Protokolümüz organoidlerin yapısal karmaşıklığını görselleştirmek için kullanılabilir, tek hücreli çözünürlükte bu 3B yapılarda kimlik, sülfat ve dağılım haritalanmasına izin verir. Hızlı üç günlük protokolümüz tamamen çeşitli kökenli organoidler için optimize edilmiş ve toksik olmayan optik temizleme adımı ve silikon bazlı montaj yöntemi içeren basit bir numune hazırlama kullanır. Protokolümüz basit olmasına rağmen, bazıları organize işleme veya slayt hazırlama gibi kritik adımlardır, görsel gösterim yoluyla metin yoluyla daha iyi açıklanabilir.
24 kuyu plakalı bodrum zarek ekstresinde yetiştirilen 100 ila 500 mikrometre çapında organoidleri kurtarmak için, 3D matrisleri bozmadan PBS ile hasat edilecek her kaynağı yıkayın ve plakayı buzüzerine yerleştirin. Her kuyuya bir mililitre buz gibi geri kazanım çözeltisi ekleyin ve plakayı 30 ila 60 dakika boyunca dört derece lik yatay bir çalkalayıcıya yerleştirin. Bir mililitrelik pipet ipuçlarını PBS çözümünde %1 BSA'ya batırın ve pipetleri iki kez yukarı ve aşağı iki kez BSA ile kaplayın.
Daha sonra, her koşul da 15 mililitrelik bir tüpe %1 PBS BSA beş mililitre ekleyin ve tüpün içini kaplamak için çözeltiyi atmadan önce tüpü 2-3 kez ters çevirin. Organoidleri toplamak için, kuyu içeriğini beş ila 10 kez hafifçe askıya almak için kaplanmış bir uç kullanın ve her durumdan tüm organoidleri tek bir kaplamalı 15 mililitrelik tüple çekin. Tüm organoidlerin toplanmasını sağlamak için her kuyuyu bir mililitre buz gibi %1 PBS BSA ile durulayın ve yıkamaları uygun tüplere aktarın.
Soğuk PBS ile 10 mililitreye kadar her tüpteki son hacmi getirin ve 3B matrisin görünür bir katmanı olmadan sıkı bir palet elde etmek için organoidleri santrifüj ile tortulayın. Organoidleri onarmak için, bir mililitrelik pipet ucunu kullanarak her bir peleti bir mililitrelik buz gibi para formaldehitte dikkatlice yeniden askıya alın ve 45 dakika boyunca dört derece santigrat derecede düzeltin. Fiksasyon süresinin yarısında organoidleri yavaşça askıya alın.
45 dakika sonra, 10 dakika boyunca dört santigrat derece tüpler yerleştirmeden önce, her tüp için buz gibi PBS artı ara 20 mililitre ekleyin ve yavaşça inversion tarafından karıştırın. Organoidleri engellemek için, kuluçka sonunda, örnekleri aşağı spin ve iyi kaplanacak başına buz gibi organoid yıkama tampon en az 200 mikrolitre pelet yeniden askıya. Daha sonra organoidleri 24 kuyuluk süspansiyon plakasının tek tek kuyularına aktarın ve 4 derecelik bir kuluçka için 15 dakika kuluçkaya yatın.
Immunolabeling için boş bir referans kuyusu içine organoid yıkama tampon 200 mikrolitre ekleyin ve organoidler plaka nın altına yerleşmek için izin. Organoidler yerleştiğinde, son 200 mikrolitre yıkama tamponunun kaldırılması na izin vermek için plakayı 45 derecelik bir açıyla yatırın. Daha sonra, ilgi birincil antikorları içeren organoid yıkama tampon 200 mikrolitre ekleyin ve hafif sallanan ve dakikada 40 devrimleri sallayarak plaka dört derece santigrat gecede yerleştirin.
Ertesi sabah, her kuyuya bir mililitre organoid yıkama tamponu ekleyin ve organoidlerin üç dakika boyunca tabağın dibine yerleşmelerine izin verin. Organoidler yerleştiğinde, her kuyudan son 200 mikrolitre hariç hepsini çıkarın ve organoidleri bir mililitre taze organoid yıkama tamponu ve yıkama başına hafif sallanan ve titreyen üç adet iki saatlik yıkama ile yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, organoidlerin her kuyudan son 200 mikrolitre organoid yıkama tamponu hariç hepsini çıkarmadan önce üç dakika boyunca plakanın dibine yerleşmelerine izin verin.
Hafif sallanan ve sallayarak dört derece santigrat bir gecede kuluçka için her kuyuya uygun ikincil antikorlar içeren organoid yıkama tampon 200 mikrolitre ekleyin. Ertesi sabah, organoidleri bir mililitre taze organoid yıkama tamponunda üç adet iki saatlik yıkama ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, iyi başına bir 1.5 mililitre tüp içine organoidler aktarın ve santrifüj ile organoidler toplamak.
Organoidlerin optik temizlenmesi için, organoidleri bozmadan her tüpten mümkün olduğunca çok yıkama tamponu çıkarın ve her pelete en az 50 mikrolitre FUnGI eklemek için değiştirilmiş 200 mikrolitrelik pipet ucu kullanın. Oda sıcaklığında 20 dakikalık bir kuluçkadan sonra organoidler bir haftaya kadar dört santigrat derecede veya eksi 20 santigrat derecede altı aya kadar saklanabilir. Konfokal mikroskopi ile organoid görüntüleme için slaytlar hazırlamak için, 10 mililitrelik bir şırıngayı silikon dolgu ile doldurun ve şırıngaya modifiye edilmiş 200 mikrolitrelik pipet ucu takın.
Bir slayt ortasında bir iki santimetre bir dikdörtgen çizmek için şırınga kullanın ve dikdörtgenin ortasına temizlenmiş organoidler yerleştirmek için ikinci bir değiştirilmiş 200 mikrolitre pipet ucu kullanın. Organoidlerin üzerine bir kapak kayma yerleştirmek için, kapak kayma sol tarafı ilk aşağı yerleştirin, yavaş yavaş soldan sağa hiçbir sıkışmış hava kadar kapak kayma indirmeden önce. Daha sonra silikon dolgu sıvısına sıkıca takmak için kapağın tüm kenarlarına hafifçe basınç uygulayın.
Organoidleri görüntülemek için, slaytı konfokal lazer tarama mikroskobunun aşamasına yerleştirin ve konfokal görüntüleme için çok daldırma 25 X hedefi seçin. Fotoğraf beyazlatma azaltmak için düşük bir lazer gücü seçerek, uygun edinme ayarları na mikroskop ayarlayın. Alt uç üst sınırları tanımlamak için Z yığın modunu kullanın ve Z adım boyutunu en iyi şekilde ayarlayın.
Büyük organoid yapıları veya birden fazla organoidi birlikte görüntülerken, %10 örtüşme ile fayans modunu kullanın ve ilgi alanını gösterir. Tüm parametreler ayarlandığında, görüntüleme yazılımında görüntülemenin 3B görüntülenmiş bir temsilini edinin ve parlaklık, kontrast ve 3B işleme özelliklerini optimize edin. Ardından sonuçların RGB anlık görüntülerini TIFF dosyaları olarak dışa aktarın.
2D görüntüleme ile karşılaştırıldığında 3D görüntüleme gücü gösterildiği gibi oluşturulan fare meme bezi organoidlerinin bu görüntüleri ile gösterilmiştir. Bu temsili organoidlerin merkezi tabakası sütun şeklindeki K8/K18 pozitif luminal hücrelerden oluşur ve dış tabaka, meme bezinin morfolojisini in vivo olarak özetlemek üzere uzamış K5 pozitif fesleğen hücreleri içerir. Bu polarize organizasyon aynı organoid bir 2D optik bölümünden takdir etmek zordur.
3D bilgi olmadan yorumlanması imkansız karmaşık bir yapının başka bir örnek insan karaciğer organoidlerin safra sıvısı toplama kolaylaştırmak MRP2 pozitif kanaliculi ağıdır. Ayrıca elde edilen kalite ve çözünürlük yarı otomatik segmentasyon ve görüntü analizine olanak sağlar. Böylece, toplam hücre sayıları ve belirteçlerin varlığı tüm organoidlerde belirli hücresel alt tiplerde ölçülebilir.
140 hücre içeren tüm bir organoidin çekirdeklerini bölerek, Ki67 hücre döngüsü belirteci için yüksek pozitiflik gösteren üç hücre tanımlanabilir. Optik temizleme ajanı, FUnGI, bir organoid içinde derin floresan sinyal kalitesinde belirsiz ve fruktoz-gliserol temizleme daha iyi performans gösterir. FUnGI ile temizlenmiş organoidler, belirsiz organoidlere kıyasla genel olarak gelişmiş floresan yoğunluğu nu gösterir.
Numunede kalan herhangi bir BME'nin antikor penetrasyonunun azalmasına yol açabileceğini ve yüksek arka plan sinyaline yol açabileceğini unutmayın. Buna ek olarak, kistik organoidler çökmeleri halinde optik olarak temizlenmemelidir. Protokole hafif adaptasyonlar ile, örnekler süper çözünürlüklü konfokal, multi foton ve ışık sayfası mikroskopisi ile kullanılabilir.
