Bağırsak bariyerinin bütünlüğünü araştırmak amacıyla fare ince bağırsak organoidlerinde bağırsak bariyerinin bütünlüğünü ölçmek için bir yöntem geliştirdik. Buna karşılık, biz kullanılan monolayer hücre kültürü bakın, bizim test üç boyutlu ince bağırsak organoidler dayanmaktadır. Modelimize iki boyutlu bir töz adapte etmek pratikliği için çok önemliydi.
Test in vitro kültürlü organoidler dayanmaktadır ve uygulama indükleyiciler ve bağırsak bariyer bütünlüğü inhibitörleri tanımlamak için yardımcı olacaktır. Sıkı kavşak proteinlerinin düzenlenmesi tüm epitel hücrelerinin önemli bir özelliğidir. Tahlilimiz epitel bariyer bütünlüğünün işlevini ve analizini sağlar.
Fare bağırsak dokusundan izole edilen organoidlerin bariyer bütünlüğünü ölçmek için, ilk olarak kaplama işlemi sırasında organoidlerin saklanması için kullanılacak santrifüj tüplerinin tümü, pbs'de tüm plastik yüzeyleri kapsayacak şekilde yeterli %0,1 BSA ile önkatlanır. Hemen BSA çözeltisini çıkarın ve tüpleri buza yerleştirin. Daha sonra, hücre matris çözeltisi ve organoid kültür ortamıbuz üzerinde çözülme ve dikkatle 48 iyi organoid kültür plaka her kuyudan kültür ortamı kaldırın.
Hücre matrislerini eritmek için borulamadan önce her kuyuyu bir mililitre soğuk PBS ile yıkayın. Nispeten homojen hücre süspansiyonları elde edildiğinde, organoidleri santrifüj le iki kez taze PBS ile yıkayın ve her organoid kültürü 40 mikrolitre soğuk ortamda yeniden askıya alın. 40 ila 60 mikrometre boyutundaki yapıları toplamak ve her organoid süspansiyonu 40 mikrolitre taze hazırlanmış hücre matris çözeltisi ile karıştırmak için büyük organoid yapıları 10 mikrolitrelik pipet ucu ile beş kez ayırın.
Sekiz iyi odalı coverslip bireysel kuyuların merkezine her organoid hücre matris çözeltisi süspansiyon ekleyin ve beş dakika boyunca bir buz torbası üzerinde slayt yerleştirin. Kuluçka sonunda, hücre kültürü kuluçka merkezinde 24 saatlik kuluçka için her kuyuya 150 mikrolitre organoid kültür ortamı eklemeden önce organoid hücre matris yapısının polimerizasyonunu sağlamak için slaytı 20 dakika boyunca 37 derece ve %5 karbondioksit olarak yerleştirin. Kuluçka sonunda, 48 saat boyunca rekombinant murine interferon gama mililitre başına 10 nanogram ile pozitif kontrol kuyuları tedavi.
Geçirgenlik tayini yapmak için, odacıklı kapak fişini ters konfokal mikroskobunun 37 derece ısıtılmış kuluçka odasına aktarın ve odanın karbondioksitini mikroskop aşamasına sıkıca kilitleyin ve mikroskobun görüntüleme ayarlarını ayarlayarak organoidleri odanın bir kuyusında görselleştirin. Daha sonra, mikroskop odasında bir saat kuluçka için orta 150 mikrolitre orta 100 milimolar Lucifer sarı üç mikrolitre ekleyin. Kuluçka sonunda, referans organoidlülünin lümenini görselleştirmek için odağı ayarlayın ve Lucifer sarı uyarma için gerekli lazer enerjisini ve enstrümanın mevcut dinamik aralığının %30 ila %40'ında Lucifer sarı sinyalini görüntülemek için cihazın ilgili algılama hassasiyetini tanımlayın.
Alternatif olarak, sinyal yoğunluğu pozlama süresini değiştirerek değiştirilebilir. Diferansiyel girişim kontrastı canlı görüntüleme ile kapak yüzeyine yakın küresel bir yapıya sahip yaklaşık 10 organoidin pozisyonlarını bulmak, benzer çaplara sahip organoidleri yakalamak ve lümenleri görmek için organoidlerin merkezi dilimine odaklanmak. Her organoidin şeklini ve oto floresansını belgelemek için diferansiyel girişim kontrastını ve her pozisyonun Lucifer sarı floresanını kaydedin.
Tüm organoidler görüntülendiğinde, Lucifer sarısı da dahil olmak üzere 150 mikrolitre orta maddeyi Lucifer sarı tedavi kuyularına ekleyin ve 70 dakika boyunca her beş dakikada bir kuyuların görüntüsünü verin. Görüntüleme seansının sonunda, 100 mikrolitre orta dereceye dört mikrolitre taze hazırlanmış EGTA ekleyin. Seyreltilmiş EGTA'yı uygun kuyulara ekleyin.
Daha sonra, 30 dakika boyunca her beş dakikada bir organoidlerin floresan kaydedin. Hücresel canlılık ve bütünlük olarak işlem ve kültür veya organoidler önceden uygulama emin olun taşkınlık başarısı için bir ön koşuldur. Bu temsili deneyde, Lucifer sarı intraluminal Lucifer sarı floresan ile tedavi 70 dakika sonra sadece interferon gama ile tedavi vahşi tip hayvanların organoidlerde görülebilir.
Ne uyarılmamış kontroller, ne de interferon gama reseptör-2 nakavt hayvanlardan elde edilen organoidler tedavi süresinin sonunda intraluminal Lucifer sarı floresan gösterdi. EGTA eklenmesi sıkı kavşak co-faktörler inquestering tarafından bağırsak bariyer bütünlüğü spesifik olmayan bir arıza neden, lucifer sarı take-up ve ifade tüm organoidler ne olursa olsun kökeni veya tedavi koşulları ile sonuçlanan. Organoid lümen içinde ve her organoid dışında Lucifer sarı floresan düzeyi için göreceli yoğunluk değerleri de ölçülebilir.
Yapılandırma etrafında benzer bir boyuta sahip organoidleri seçtiğinizden ve organoidin merkezi lümenini hayal edebilmeniz için belirlenen ekseni seçtiğinizden emin olun. Bağırsak bariyeri arızası indükleyen maddelerin kullanılmasının yanı sıra, bağırsak bariyerinin yıkımının inhibisyonu için stratejiler de inceleyebiliriz. Bu metodoloji tek bir hayvanın birincil hücrelerine dayandığı için, her deney için gerekli olan hayvan sayısını azaltarak birçok deney için kullanılabilir.
