Bayan Alster, Sayın Honrath ve Dr Jiang üstün teknik yardım için takdir edilmektedir. Ayrıca Dr Volz ve dijital PCR cihazına erişim sağlamak için Dr. Dandri araştırma grubudur takdir.

1. Malzemeler Kültür tümör hücreleri ve non-tümör hücreleri hem de içeren hazırlanması <ol><li> Kurulu hücre çizgisi MPNST S462 5 tümör hücreleri kullanır. Non-tümör hücreleri 6,7 olarak fibroblastlar kullanın </li><li> Kültür, her iki tümör hücreleri,% 10 fetal sığır serumu, standart DMEM ortamı içinde fibroblastlar (BSA), 3 mM glutamin, 0.1 mM 2-merkaptoetanol, 500 U / ml penisilin, 500 ug / ml streptomisin ve 1 mM sodyum piruvat, 37 ° C&#39;de ve% 5 CO Şubat 05-07. alt izdiham,% 0.05 tripsin ile hücreler hasat ve hemasitometre kullanarak onları saymak. </li><li> 0.2 ml ortam içinde 96 çukurlu bir kültür plakasının her bir oyuğuna birlikte 400 tümör hücreleri ve 1.600 non-tümör hücreleri karıştırın. 5 günlük tedavi süresi boyunca tümör hücrelerinin hızlı artışı göz önüne alındığında, tümör hücrelerinin başlangıç ​​oranı% 25 olarak belirlenmiştir. kurmak 4 her ilaç konsantrasyonu için çoğaltır. 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri ve% 5 CO2 O / N. </li></ol> 2. Drug Tedavisi <ol><li> Test ilaç olarak nilotinibin kullanın. DMSO içinde, 0, 2, 4 ve 20 mM nilotinibin stok çözelti hazırlayın. 0, 10, 20 ve 100 uM 6.7 2 kat konsantre edilmiş ilaç çözeltileri vererek, 5 mi DMEM ortamında 200-kat, her biri seyreltilir. </li><li> Her 0.1 mi orta de kaldırma ve orta ilacı içeren 0.1 ml ekleyin. nihai konsantrasyonlar 0, 5, 10 ve 50 uM bulunmaktadır. 5 gün boyunca ortam ihtiva eden bir ilaç hücrelerin inkübe edilmesi devam edin. </li><li> Tedavinin sonunda, bir faz-kontrast mikroskop kullanılarak ekli hücreleri incelemek ve fotoğraf çekmek. Uzak orta aspire 0.2 ml PBS ile bir kez hayatta yapışkan hücreleri yıkayın. </li></ol> 3. Dijital PCR için DNA hazırlanması <ol><li> HotShot 8 kullanarak lyse hücreleri. <ol><li> her bir oyuğa 50 ul alkalin liziz çözeltisi (25 mM NaOH, 0.2 mM EDTA) ekleyin. folyo ile kuyu Seal. bir fırın içinde ya da 30 dakika için bir ısıtma plakası üzerinde 95 ° C&#39;de inkübe plakası. Bir MICR altında edinOscope daha sağlam hücreler kuyu yüzeyinde kalan olduğundan emin olmak için. durumunda hücreler tamamen lyse ısıtma süresini artırmak veya deterjan eklemek vermedi. -20 ° seferde Freeze da hücrelerin kırma artırır C. </li><li> Her kuyucuğa çözeltisi (40 mM Tris-HC, pH 4.0) nötralize 50 ul ekle. 10 ila 30 dakika süreyle 95 ° C de bir PCR döngü bir PCR plaka ve kuru U biçimli kuyular içine tüm lizatları aktarın. distile su 20 ul lizatları sulandırın. </li></ol></li><li> Bırak-Diyaliz 9 kullanarak Tuzu Çöz <ol><li> ortalama gözenek boyutu 0.025 mikron membran filtreleri kullanmak. </li><li> 12-çukurlu bir levhanın kuyularında parlak tarafı yukarı gelecek şekilde damıtılmış su filtre Float. 5 dakika boyunca filtreyi ıslatın. filtre ve su arasındaki hava kabarcıklarını önlemek için dikkat edin. </li><li> Pipet dikkatle filtre 4 alanların her birinde üzerine adım 3.1.4 her numunenin yeniden lizatları. plaka kapatın ve 30 ila 60 dakika boyunca diyaliz. </li><li> Filtreyi üzerinde saygısız, ne de damla bozmadan filtrenin altında su emiciler. </li><li> yeni bir PCR-plakanın gözleri içerisine lizat damla aktarın. Bir PCR döngü 10 ila 30 dakika 95 ° C&#39;de ısıtılarak DNA damla kuru. 10 ul su içinde lizatları sulandırın. </li></ol></li></ol> 4. Dijital PCR <ol><li> Bu DNA, tampon ve oda sıcaklığında tahlil karışımı olarak çözülme dondurulmuş parçalar, (örneğin, VWR Mini santrifüjü) mevcut herhangi bir santrifüjün yüksek kuvvette 10 saniye boyunca aşağı doğru döner ve daha sonra buz üzerinde tutun. </li><li> DNA (Tablo 1) dışındaki tüm bileşenleri içeren bir ana karışım hazırlayın. Ölü hacim düşünün ve gereken miktardan daha yaklaşık% 10 daha fazla ana karışımı hesaplayın. NOT: ticari kit kullanılan primerler ve problar kullanın. </li><li> Vortex ana karışımı, (örneğin, VWR Mini santrifüj) herhangi bir kullanılabilir santrifüj maksimum kuvvette 10 saniye boyunca aşağı doğru dönmeye ve her 15 ul dağıtmak96 PCR plaka de. ana karışım ihtiva eden çukurlara, her numunenin (DNA içeren) tüm lizat ekleyin. Aktarım oda sıcaklığında bir kartuş örnek tarafında iyi olarak her bir reaksiyon karışımının, 20 ul. </li><li> Bir kartuşun yağ tarafındaki her bir kuyunun içine damla üreteci yağı 70 ul koyun. conta ile kartuşu kapatın ve bir damlacık jeneratör içine bütün ayar yerleştirin. Damlacık oluşturma başlatın. </li><li> 96-çukurlu bir PCR plaka oyuklarına Aktarım 40 ul damla çözeltisi. Bir folyo ile plaka Seal ve PCR cycler içine plaka yerleştirin. 105 ° C&#39;de kapak sıcaklığını ayarlamak ve 2 ° C / sn hızı rampa. Tablo 2&#39;deki ayarları kullanarak PCR yürütmek. PCR, bir damlacık okuyucu plaka transfer ve okumaya başlayın sonra. Alternatif olarak, en fazla 24 saat boyunca 4 ° C &#39;de plaka saklayın. </li></ol> 5. Tümör Hücrelerinin Oranı Hesaplama <ol><li> Dijital PCR verileri yüklemek ve otomatik analys gerçekleştirmekolduğunu. </li><li> elle pozitif ve negatif damlacıkların tek boyutlu ve 2 boyutlu dağılımını inceleyerek her testin sonuçlarını kontrol ve onlar iyi ayrılır ve eşik çizgileri doğru pozisyonlarda vardı emin olun. Sonuçlar, örneğin kriterlere uymayan dışlamak, daha fazla analiz olumlu ve olumsuz damlacıkların net bir ayrım. Bir excel sayfasında içine çıkan oran NF1 / RPP30 kopyalayın. </li><li> 2 x (1-NF1 / RPP30): tümör hücrelerinin oranını hesaplar. </li></ol> Tümör hücrelerinin oranını 6. Doz-bağlı değişimini <ol><li> Her bir ilaç-konsantrasyonu için, 4 kez tekrarlanmış olan deneyin ortalama ve standart sapmayı hesaplayın. araç ve uyuşturucu konsantrasyonlarına karşı standart sapma çizilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Caponigro, G., Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+preclinical+testing+of+cancer+therapeutic+hypotheses.">Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).</li><li>McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tumour-stromal+interactions+in+modifying+drug+response:+challenges+and+opportunities.">The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).</li><li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development.">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li><li>Edwards, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+target+validation+using+patient-derived+cells.">Preclinical target validation using patient-derived cells.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).</li><li>Frahm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+phenotypic+characterization+of+tumor+cells+derived+from+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+of+neurofibromatosis+type+1+patients.">Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients.</a> Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+selectivity+of+nilotinib+on+NF1-associated+tumors+in+vitro.">Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro.</a> J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).</li><li>Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+assessment+of+the+anticancer+drug+response+of+plexiform+neurofibroma+tissue+using+primary+cultures.">Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures.</a> J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).</li><li>Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+an+inexpensive+and+high-throughput+genomic+DNA+extraction+method+for+the+molecular+ecology+of+zooplanktonic+diapausing+eggs.">Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs.</a> Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).</li><li>Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desalting+DNA+by+drop+dialysis+increases+library+size+upon+transformation.">Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).</li><li>Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+head+and+neck+cancer+oncogenome:+widespread+PI3K-mTOR+pathway+alterations+and+novel+molecular+targets.">Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets.</a> Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).</li></ol>

The procedure is patent-protected (10 2013 221 452, Germany)

In vitro ilaç özgüllük değerlendirmek için Genetik-ve hücre tabanlı bir araç anahtar aşama bir veya daha fazla tümör spesifik genetik özellikleri kullanılarak tümör hücrelerinin oranının belirlenmesidir. Geleneksel fenotipik özellikleri 7 aksine, genetik özellikler, özel bir kararlı ve ölçmek için kolaydır. Örneğin, bir tümör spesifik mutasyon ya da kopya sayısı varyasyonu non-tümör hücreleri, sadece tümör hücrelerinde değil, mevcut bulunmaktadır. Bu tür genetik leke hassas ve güvenilir şekilde bu çalışmada gösterildiği gibi, dijital, PCR kullanılarak, örneğin, belirlenebilir. Dijital PCR için DNA yüksek saflıkta gerekli değildir. Ancak, tuz giderme ve inhibitör molekülünün çıkarılmasıyla, uygun bir filtre kullanılarak bir damla diyaliz ile elde edilebildiği gereklidir. Kombine parçalama ve açılan diyaliz, basit ve hızlı özel araçlar gerektirir ve bu nedenle herhangi bir standart laboratuarda yapılabilir. Hücreler brea yoksade k, ilave işlem örneğin, -20 ° C &#39;de hücreler dondurma deterjan eklenmesi ve / veya proteaz kullanılarak olarak kabul edilebilir. Bu çalışmada, NF1 geninin heterozigot silinmesi ölçümü için tümöre özel bir özellik olarak kullanılır. Benzer şekilde, diğer genler ya da mahallerinin silmeler de kullanılabilir. Ayrıca, mutasyonlar ayrıca tümör hücrelerinin miktarının belirlenmesi için kullanılabilir. Böyle bir durumda, mutant için dijital PCR ve normal alleller yoğun bunların her biri için kendi özgüllüğü sağlamak için valide gerekmektedir. Tümör hücrelerinin doza-bağımlı bir oranda ilaç spesifikliği veya seçicilik açısından bir gösterge sağlar. Ayrıca, aynı zamanda, bir ilaç (Şekil 4) karışık bir kültür toplam hücrelerin tepkisinden tümör hücrelerinin ekstre cevabı sağlar. Bu çıkarma stratejisi olmayan tümör ve her ikisini de içerir birincil kültürlerin kullanıldığı teknik sorun için bir çözüm sağlar (uyuşturucu testi için n-tümör hücreleri). Genetik-ve bu nedenle uygulama potansiyeline sahip olabilir Bu çalışmada gösterilmiştir in vitro aracı hücre tabanlı (1) in vitro ilaç özgüllük veya seçicilik değerlendirilmesi ve bir platform sağlar ilaç keşif (2) kişiselleştirilmiş kanser bakımında nerede birincil kültürler test ilaçları sağlar ve sonuç olarak adjuvan kemoterapi 4 ilaç seçimi katkıda bulunabilir. Belirli genetik değişim ya da birden fazla genetik değişiklikler, ilaç-tedavi sırasında takip edilebilir Dahası, bir ilacın farmakolojik mekanizma, bu aracı kullanarak ele alınabilir. bireyselleştirilmiş birincil kültürleri kullanılarak bir zorluk olmaması tümör hücrelerinin ölçümü için evrensel bir genetik özelliktir. Ancak, tam genom dizileme bugünün peşin ile, en sık değişmiş genler ve bölgeler ortak tümörler için bilinir. Örneğin, baş ve boyun arasındatümörler,% 71,% 23 ve% 22 TP53, FAT1 mutasyonu CDKN2A genleri ve% 60,% 34 ve% 26 CDKN2A, STK11 ve PTEN, sırasıyla 10 gen bölümlerde silmeler sahip bulunmaktadır. hedeflenen-dizisi ve / veya dijital PCR vasıtasıyla 5 ila 10 tür genleri ve / veya bölgeleri depolarının taranması bu nedenle muhtemelen türetilen primer kültür içinde, tümör hücrelerinin ölçümü için kullanılabilecek bir ya da daha fazla genetik değişiklik belirleyecektir. Başka bir sınırlama birincil kültürleri kurmak için rezeke tümörlerin çoğu zaman yetersiz miktarıdır. Avantajlı özellikleri ve Genetik-umut verici uygulama potansiyeli ve hücre tabanlı in vitro aracı, kendi sınırlamaları göz önünde tutulmalıdır ve in vitro doğa vurgulanmalıdır rağmen. Örneğin, tümör hücreleri üzerinde, bir ilacın etkisinin karşılaştırılması ve sitotoksisite olabilir dolayı oldukça hücre tiplerinde farkı (Schwann hücrelerinin genel fibroblastlar) ya da onların(Farklı bireylerden) farklı kökenleri. non-tümör hücreleri üzerinde daha tümör hücreleri üzerinde bir ilacın daha güçlü etkisi, önceki ikinci daha hızlı büyür gerçeği ile açıklanabilir. En önemlisi, in vitro davranış hücreler, insan vücudundaki hücrelerin daha farklıdır ve dolayısıyla, in vitro değerlendirme sonuçları genellikle gerçek klinik durumu yansıtmıyor ya da sadece kısmen yok. Bu nedenle, etkinlik, sitotoksisite ve kültürlü hücreler için elde edilen ilaç özgüllüğü yerine biyomarker nitelikte ama antibiyotik klinik öncesi ölçülen etkinliği güvenilirliğini yoktur. Bununla birlikte, karma kültürlerin ve / veya primer kültürlerinde hücre hatları hareketli in vitro ilaç etkisi ve özgünlüğü / seçicilik değerlendirirken ileri bir adımdır. Geniş çaba ile, in vitro koşullarda, en azından bazı ilaçlar için hastanın gerçek tepkiler ile in vitro verileri makul bir ilişki sağlayan bulunabilir.

Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios. 
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated. 
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">membrane filter of 25 mm diameter</td>
			<td style="width:71px;">Merk-Millipore</td>
			<td style="width:119px;">VSWP 02500</td>
			<td style="width:167px;">for drop-dialysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ddPCR assay for NF1</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>dHsaCP1000177</td>
			<td>FAM-labelled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ddPCR assay for RPP30</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>dHsaCP2500350</td>
			<td>HEX-labelled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QX200</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">186-4001</td>
			<td>the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Droplet oil</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cartriges&#160;</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gaskets</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cartrige holder</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pierceble foil</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>181-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing specificity of anticancer drugs in vitro

Tümör olmayan Tümör hücreleri ihtiva eden kültürler kullanılarak in vitro anti-kanser ilaç özgüllüğünü belirlemek için kullanılan prosedür gösterilmektedir. Anahtar elemanı çift sonda, dijital PCR deneyi ve tümör hücrelerinin oranı daha sonra hesaplama kullanılarak evrensel sekansına ilişkin olarak, bir tümör-spesifik genetik değişiklik kantitatif belirlenmesidir. Deney Tümör kurulu bir hattın hücreleri ihtiva eden bir kültürün üzerinde gerçekleştirilmektedir katkılı olmayan tümör hücreleri. karışık kültür çeşitli konsantrasyonlarda test ilacı ile muamele edilmektedir. muameleden sonra, DNA, bir basit ve ucuz bir yöntemi kullanarak 96-çukurlu tablalara, hayatta yapışkan hücreler tarafından doğrudan hazırlanır ve tümöre spesifik genetik değişiklik ve bir referans genel sekansı ölçmek için bir çift sonda, dijital PCR analizine tabi . Bu gösteri NF1 geninin heterozigot silinmesi tümör spesifik genetik değişiklik olarak kullanılır veReferans gen gibi bir RPP30 geni. Oranı NF1 / RPP30 ile tümör hücrelerinin oranı hesaplanmıştır. Tümör hücrelerinin oranının doza bağımlı bir değişiklik ilacın özgüllüğü için bir in vitro gösterge sağlar çünkü bu, genetik ve hücre bazlı in vitro deney muhtemelen ilaç keşfi uygulama potansiyeline sahip olacaktır. Bundan başka, kişiselleştirilmiş kanserine bakımı için, bu Genetik-ve hücre tabanlı bir araç tek tek tümörler birincil kültürleri kullanılarak etkisini test etmek ve aday ilaçların spesifite ile adjuvan kemoterapi optimize katkıda bulunabilir.

DNA&#39;nın kalitesi kombine HotShot / Bırak-Diyaliz tatmin edici dijital PCR (Şekil 1B) için yeterlidir kullanılarak hazırlanan. 2.000 fibroblastlar için, yaklaşık 3.000 ± 500 pozitif damlacıklar beklenen 4000 kopya (bir hücrede iki kopya)% 75 tekabül eden, elde edilmiştir. Bu çalışmada, tümör hücreleri NF1 geninin 5 bir heterozigot delesyon bilinen kurulu bir hat MPNST S462 geliyordu. Bu% 50 gen dozaj azaltılması açıkça çift dijital PCR yöntemi (Şekil 1B) tarafından tespit edildi. Buna karşılık, bu genin iki kopyası fibroblast ölçüldü. Tümör ve non-tümör hücreleri arasındaki bu genetik farklılık karışık kültürlerde tümör hücrelerinin (Şekil 2) oranının hesaplanmasını sağlar. RPP30 için NF1 göreceli gen dozajı ölçerek, karışık bir kültüründe tümör hücrelerinin oranı belirlenebilirHer bir ilaç-konsantrasyonunda (Şekil 3). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig1.jpg" /> Prensip Şekil 1. Dijital PCR. (A) resimde. (B) çift prob deneyi referans (RPP30) gen ile ilgili olarak tümör hücreleri MPNST S462 bir hedef (NF1) geni azaltılmış miktarda ortaya koymaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig2.jpg" /> Şekil 2. Tümör Hücreleri hesaplanan oranı. Tümör hücreleri ve non-tümör hücreleri çeşitli oranlarda karıştırıldı ve 96 plakasının her oyuğuna tohumlandı. Ek O / N, hücreler lize edildi wit sonraH HotShot / Bırakma Diyaliz ve tuzdan arındırılmıştır lizatlar NF1 / RPP30 oranı verdi dijital PCR&#39;ye tabi tutulmuştur. Bu oran Baz, her bir oyuk, tümör hücrelerinin oranı hesaplanmıştır. Ve ortalama 4 adet kurulum oranda tekrarlanmış olan tümör hücrelerinin oranı standart sapması hesaplandı. Tümör hücrelerinin (Y ekseni) hesaplanan oranlar kurulum oranlarda (X ekseni) karşı grafiğe geçirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53752/53752fig3.jpg" /> Şekil Tümör hücrelerinin oranını 3. Doz bağımlı değişiklikler (A). Doza bağımlı görünür yaşayan hücrelerin azalma. (B) tümör hücrelerinin oranı (ortalama 4 suretin standart sapma) hesaplanan<html> NF1 oranı: - 10 uM RPP30, 0 ila azalmıştır. En yüksek doz 50 uM&#39;de, birkaç önemli hücreler nedeniyle tüm hücrelere toksik etkisi, muhtemelen kalmıştı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53752/53752fig4.jpg" /> . Non-tümör hücreleri bu tümör hücrelerinin Şekil 4. Ayırma Yanıt (A) canlılık ve / veya toplam hücrelerin çoğalması geleneksel deneyler kullanılarak ölçülebilir; Tümör hücrelerinin oranı, bu çalışmada ortaya prosedür kullanılarak belirlenebilir. İki parametre kullanarak (B), bir ilaca, bir karışık kültür toplam hücrelerin tepki, tümör hücreleri ve tümör olmayan hücre tepkisinin karşılık ayrılabilir..com / files / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <table fo:keep-together.within-page="1"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"></td><td style="width:171px;"> 1 Tepki </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> 2 x ddPCR Supermix </td><td style="width:171px;"> 12 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> NF1 için tahlil karışımı </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> RPP30 için deney karışımı </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> Haelll </td><td style="width:171px;"> 0.6 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> ara toplam </td><td style="width:171px;"> 15 </td><td style="width:99px;"> usta karışımı </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> DNA </td><td style="width:171px;"> 9 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> Toplam </td><td style="width:171px;"> 24 </td><td style="width:99px;"> Nihai PCR Karışımı </td></tr></tbody></table> Tablo 1 Çift ddPCR Reaksiyon Kurma <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Adım </td><td> Aksiyon </td><td> sıcaklık </td><td> Zaman </td><td> Bisikletler </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Polymaktivasyon silmek </td><td> 95 ° C </td><td> 10 dakika </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> DNA denatürasyonu </td><td> 94 ° C </td><td> 30 sn </td><td rowspan="2"> 40 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Tavlama / exetension </td><td> 60 ° C </td><td> 1 dakika </td></tr><tr><td> 4 </td><td> polimeraz devre dışı bırakma </td><td> 98 ° C </td><td> 10 dakika </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Tut (isteğe bağlı) </td><td> 4 ° C </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 2 PCR Cycler Ayarları

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro at JoVE.com

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

Bu protokolün amacı, tümör ve non-tümör hem hücreleri içeren karışık kültürleri kullanılarak in vitro antikanser ilaçların özgüllüğünü değerlendirmektir.

Antikanser İlaçların Özgüllük değerlendirilmesi<em&gt; İn Vitro</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

assessing-specificity-of-anticancer-drugs-in-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

9.4K Görüntüleme.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf.  Bu protokolün amacı, tümör ve non-tümör hem hücreleri içeren karışık kültürleri kullanılarak in vitro antikanser ilaçların özgüllüğünü değerlendirmektir. 

Video: Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Transgenic and knockout mice have been powerful tools for the investigation of the physiology and pathophysiology of airways1,2. In vitro tensometry of isolated tracheal preparations has proven to be a useful assay of airway smooth muscle (ASM) contractile response in genetically modified mice. These in vitro tracheal preparations are relatively simple, provide a robust response, and retain both functional cholinergic nerve endings and muscle responses, even after long incubations.
Tracheal tensometry also provides a functional assay to study a variety of second messenger signaling pathways that affect contraction of smooth muscle. Contraction in trachea is primarily mediated by parasympathetic, cholinergic nerves that release acetylcholine onto ASM (Figure 1). The major ASM acetylcholine receptors are muscarinic M2 and M3 which are Gi/o and Gq coupled receptors, respectively3,4,5. M3 receptors evoke contraction by coupling to Gq to activate phospholipase C, increase IP3 production and IP3-mediated calcium release from the sarcoplasmic reticulum3,6,7. M2/Gi/o signaling is believed to enhance contractions by inhibition of adenylate cyclase leading to a decrease in cAMP levels5,8,9,10. These pathways constitute the so called "pharmaco-contraction coupling" of airway smooth muscle11. In addition, cholinergic signaling through M2 receptors (and modulated by M3 signaling) involves pathways that depolarize the ASM which in turn activate L-type, voltage-dependent calcium channels (Figure 1) and calcium influx (so called "excitation-contraction coupling")4,7. More detailed reviews on signaling pathways controlling airway constriction can be found4,12. The above pathways appear to be conserved between mice and other species. However, mouse tracheas differ from other species in some signaling pathways. Most prominent is their lack of contractile response to histamine and adenosine13,14, both well-known ASM modulators in humans and other species5,15.
Here we present protocols for the isolation of murine tracheal rings and the in vitro measurement of their contractile output. Included are descriptions of the equipment configuration, trachea ring isolation and contractile measurements. Examples are given for evoking contractions indirectly using high potassium stimulation of nerves and directly by depolarization of ASM muscle to activate voltage-dependent calcium influx (1. high K+, Figure 1). In addition, methods are presented for stimulations of nerves alone using electric field stimulation (2. EFS, Figure 1), or for direct stimulation of ASM muscle using exogenous neurotransmitter applied to the bath (3. exogenous ACH, Figure 1). This flexibility and ease of preparation renders the isolated trachea ring model a robust and functional assay for a number of signaling cascades involved in airway smooth muscle contraction.

In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Transgenic mice have been extremely useful in ascribing physiological function to genes. As such, research in general, and functional studies of airway, in particular, have undergone a remarkable shift toward murine models. Here we provide protocols for in vitro trachea constriction studies to evaluate smooth muscle function in murine airway.

Fare kullanarak Trakeal Konstrüksiyon in vitro ölçümleri ise

Transgenic and knockout mice have been powerful tools for the investigation of the physiology and pathophysiology of airways1,2. In vitro tensometry of ...

Tıp

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

Fetal Alkol Pozlama bir Zebra balığı Modelinde teratojenik değişiklikler değerlendirilmesi

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic Therapy is a novel approach for a more tumor selective treatment.
Photodynamic Therapy (PDT) that makes use of a nontoxic photosensitizer (PS), which, upon activation with light of a specific wavelength in the presence of oxygen, generates oxygen radicals that elicit a cytotoxic response1. Despite its approval almost twenty years ago by the FDA, PDT is nowadays only used to treat a limited number of cancer types (skin, bladder) and nononcological diseases (psoriasis, actinic keratosis)2.
The major advantage of the use of PDT is the ability to perform a local treatment, which prevents systemic side effects. Moreover, it allows the treatment of tumors at delicate sites (e.g. around nerves or blood vessels). Here, an intraoperative application of PDT is considered in osteosarcoma (OS), a tumor of the bone, to target primary tumor satellites left behind in tumor surrounding tissue after surgical tumor resection. The treatment aims at decreasing the number of recurrences and at reducing the risk for (postoperative) metastasis.
In the present study, we present in vitro PDT procedures to establish the optimal PDT settings for effective treatment of widely used OS cell lines that are used to reproduce the human disease in well established intratibial OS mouse models. The uptake of the PS mTHPC was examined with a spectrophotometer and phototoxicity was provoked with laser light excitation of mTHPC at 652 nm to induce cell death assessed with a WST-1 assay and by the counting of surviving cells. The established techniques enable us to define the optimal PDT settings for future studies in animal models. They are an easy and quick tool for the evaluation of the efficacy of PDT in vitro before an application in vivo.

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

The protocol reported here allows the evaluation of the efficacy of photodynamic therapy (PDT) in cell lines and the optimization of the PDT settings before applying the therapy in animal models.

Osteosarkom Hücrelerde Fotodinamik Tedavi sitotoksik etkinliği<em&gt; In Vitro</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

Bir ile Bulaşıcı Süngerimsi Ensefalopati Türler Engelleri değerlendirilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Prion Proteini Dönüştürme Deneyi

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Use of Rabbit Eyes in Pharmacokinetic Studies of Intraocular Drugs

The intraocular route of drug administration enables the delivery of high concentrations of therapeutic drugs, while minimizing their systemic absorption. Several drugs are administered into the anterior chamber or vitreous, and the intraocular injection has been effective in curing various intraocular diseases. Rabbit eyes have been widely used for ophthalmic research, as the animal is easy to handle and economical compared to other mammals, and the size of a rabbit eye is similar to that of a human eye. Using a 30 G needle, drugs can be injected into the intracameral and intravitreal spaces of rabbit eyes. The eyeballs are then frozen until analysis, and can be divided into the aqueous humor, vitreous, and retina/choroid. The vitreous and retina/choroid samples can be homogenized and solubilized before analysis. Then, immunoassays can be performed to measure the concentrations of intraocular drugs in each compartment. Appropriate pharmacokinetic models can be used to calculate several parameters, such as the half-life and maximum concentration of the drug. Rabbit eyes can be a good model for pharmacokinetic studies of intraocular drugs.

Rabbits are widely used to study the pharmacokinetics of intraocular drugs. We describe a method for conducting pharmacokinetic studies of intraocular drugs using rabbit eyes.

Göziçi İlaçların Farmakokinetik Çalışmaları Tavşan Gözlerinde Kullanımı

The intraocular route of drug administration enables the delivery of high concentrations of therapeutic drugs, while minimizing their systemic absorption. ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin kaynaklı bağırsak Organoids şişme: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Kistik Fibrozis Hastalarında İlaç Tepki değerlendirilmesi için

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

Optimize Analizi<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Karaciğer Steatoz

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

Yenidoğan Murin Koklear Explant Tekniği<em&gt; In vitro</em&gt; İşitme Araştırmalarında Tarama Aracı

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to moderate level of increase in high-density lipoprotein (HDL) cholesterol in plasma. However, a possible role of these drugs in altering morphology and distribution of cholesterol particles is poorly understood. Here, we describe the in vitro evaluation of lipid-lowering drug effects in modulating morphological features of cholesterol particles using the plaque array method in combination with imaging flow cytometry. Image analyses of the cholesterol particles indicated that lovastatin, simvastatin, ezetimibe, and atorvastatin induce the formation of both globular and linear strand-shaped particles, whereas niacin, fibrates, fluvastatin, and rosuvastatin induce the formation of only globular-shaped particles. Next, purified very low-density lipoprotein (VLDL) and LDL particles incubated with these drugs showed changes in the morphology and image texture of cholesterol particles subpopulations. Furthermore, screening of 50 serum samples revealed the presence of a higher level of linear shaped HDL cholesterol particles in subjects with dyslipidemia (mean of 18.3%) compared to the age-matched normal (mean of 11.1%) samples. We also observed considerable variations in lipid-lowering drug effects on reducing linear shaped LDL and HDL cholesterol particles formation in serum samples. These findings indicate that lipid-lowering drugs, in addition to their cell-mediated hypolipidemic effects, may directly modulate morphology of cholesterol particles by a non-enzymatic mechanism of action. The outcomes of these results have potential to inform diagnosis of atherosclerosis and predict optimal lipid-lowering therapy.

The objective of this study was to evaluate in vitro lipid-lowering drug effects in modulating the morphology of cholesterol particles. Comparison of lipid-lowering drugs revealed variations in their effect in modulating the morphological features of cholesterol particles.

Kolesterol parçacıkları morfolojisi oransal olarak Lipid düşürücü ilaçlar farklı etkileri

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard therapy, a considerable number of CLI patients are not suited for either surgical or endovascular revascularization. Angiogenic therapies are emerging as an option for these patients but are currently still under investigation. Before application in humans, those therapies must be tested in animal models and its mechanisms must be clearly understood. An animal model of hindlimb ischemia (HLI) has been developed by the ligation and excision of the distal external iliac and femoral arteries and veins in mice. A comprehensive panel of tests was assembled to assess the effects of ischemia and putative angiogenic therapies at functional, histologic and molecular levels. Laser Doppler was used for the flow measurement and functional assessment of perfusion. Tissue response was evaluated by the analysis of capillary density after staining with the anti-CD31 antibody on histological sections of gastrocnemius muscle and by measurement of collateral vessel density after diaphonization. Expression of angiogenic genes was quantified by RT-PCR targeting selected angiogenic factors exclusively in endothelial cells (ECs) after laser capture microdissection from mice gastrocnemius muscles. These methods were sensitive in identifying differences between ischemic and non-ischemic limbs and between treated and non-treated limbs. This protocol provides a reproducible model of CLI and a framework for testing angiogenic therapies.

Here, a critical hindlimb ischemia experimental model is presented followed by a battery of functional, histologic and molecular tests&#160;to assess the effectiveness of angiogenic therapies.&#8203;

Hindekstremite Iskemi bir Murine modelinde terapötik anjiyogenezi değerlendirilmesi

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

Antikanser İlaçların Özgüllük değerlendirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Fare kullanarak Trakeal Konstrüksiyon in vitro ölçümleri ise

Fetal Alkol Pozlama bir Zebra balığı Modelinde teratojenik değişiklikler değerlendirilmesi

Osteosarkom Hücrelerde Fotodinamik Tedavi sitotoksik etkinliği

Bir ile Bulaşıcı Süngerimsi Ensefalopati Türler Engelleri değerlendirilmesi

Göziçi İlaçların Farmakokinetik Çalışmaları Tavşan Gözlerinde Kullanımı

Forskolin kaynaklı bağırsak Organoids şişme: Bir

Optimize Analizi

Yenidoğan Murin Koklear Explant Tekniği

Kolesterol parçacıkları morfolojisi oransal olarak Lipid düşürücü ilaçlar farklı etkileri

Hindekstremite Iskemi bir Murine modelinde terapötik anjiyogenezi değerlendirilmesi