JBW için:; Bu çalışma Coulter Vakfı, Beyster Vakfı, Lisansta Araştırma Fırsat (UROP) ATA ve Ulusal Bilim Vakfı Yüksek Lisans Araştırma Bursu (2010101926. Kimlik Hibe hiçbir DGE 0718128) için yaz programı tarafından desteklenmiştir.

1. Faz Sistemi Karakterizasyonu: Faz Ayırma için belirlenmesi Eşikleri <ol><li> Istenilen tampon ya da hücre kültür aracı maddesi 15 ml, 50 ml konik bir tüp içinde Şekil 1 (mor nokta) &#39;de gösterildiği gibi, PEG ve DEX içeren solüsyonlar hazırlayın. Ahiret, PEG ve DEX 35 kDa PEG ve 500 kDa DEX sevk edecektir, ancak kritik konsantrasyonlarda kullanılan iki polimer bağlı olarak değişecektir. Her bir çözelti, PEG ve DEX kütle kaydedin. Yüksek konsantrasyonda polimer çözeltilerinin çözünmesi için birkaç saat sürebilir. Vorteks serumsuz çözümler için de kullanılabilir. Hem polimerler tamamen çözülene kadar protein veya serum içeren medya için bir sallanan sahnede tüpleri yerleştirin. Polimerlerin çözünmesi ve başlangıç ​​konsantrasyonları dikkat çekmek için kullanılan ortam ağırlığını kaydedin. </li><li> Polimerler tamamen çözülür sonra, çözümleri bulutlu görünmelidir. Bu faz ayrışması meydana geldiğini ilk belirtisidir. Bunu doğrulamak için izinpolimer çözeltileri, 20 dakika için oda sıcaklığında, bir dikey konumda hareketsiz. 1,000 x g&#39;de santrifüj faz ayırma işlemi hızlandırmak için kullanılabilir. Yoğun alt faz DEX-zengin olacak ve üst faz PEG-zengin olacak. </li><li> Yavaşça tüpler için ek tampon veya ortam ekleyin. Küçük artışlarla aşmamak faz ayırma noktasına kadar kullanılmalıdır. </li><li> Çözüm açık olur ve artık santrifüj sonra faz ayrımı için eşik ulaşılmıştır faz ayıran zaman. Tüpün son ağırlık kaydedin. </li><li> Ortam eklendikten sonra faz ayrılması artık meydana geldiği her iki polimer ağ / ağ% belirlemek nihai ağırlık ile birlikte, polimerler için önceki kayıtlı ağırlıkları kullanılması. </li><li> Bu değerler Konu x-ekseni üzerinde y-ekseni ve ağ / ağ% DEX üzerinde ağ / ağ% PEG. Binodal eğri olarak bilinen bu arsa, farklı konsantrasyon derecesinden için faz ayırma için eşik konsantrasyonu belirlemek için kullanılabilirlerBelirli bir hücre kültürü ortamında PEG / DEX ons. </li></ol> 2. Konfigürasyon 1: Dışlama desenlendirme (96-Plaka Biçimi) <ol><li> % 5.0 &#39;hücre kültürü aracı maddesi içinde ağırlık / ağırlık PEG ve% 12.8 wt / wt DEX ayrı çözümler hazırlayın. Polimerleri birbirine göre dengelenmesi sonra bir ATP kalmasını sağlamak için en az iki kat kritik nokta ATP çözümleri kullanın. PEG-zengin faz ve bunun tersi içine DEX akı az miktarda bulunmaktadır, bu nedenle, kritik noktanın altındaki konsantrasyonlarda damla olarak fazlı bir sistemin kaybına neden olabilir kritik konsantrasyon çok yakın çalışma. Benzer şekilde, bir nem ve sıcaklık kontrollü bir kuluçka makinesi için hücre kültürü çanağı aktarma iki faz özelliklerinin değişmesine neden olur ve iki çözüm karıştırılabilir yapabilir. Not: Bazı hücrelerde diğer ATP formülasyonları ile daha iyi performans gösterebilir. Kabul edilebilir formülasyonlar Bölüm 1 ile belirlenen binodal eğrilerine göre seçilebilir. </li><li> Dışlama patte için kullanılacak hücreler hasatrning. Mevcut hücrelerinin toplam sayısı / konsantrasyonunu belirleyin. İsteğe bağlı: CellTracker veya floresan mikroskobu için diğer non-sitotoksik etiketleri hücrelerin etiket. </li><li> Pelet% 5.0 uygun bir hacim içinde hücreler ve pelet tekrar süspansiyon dışlama hücrelerin arzu edilen sayıda elde etmek için PEG. Örneğin, bir 96-kuyulu plakanın da bir 37,500 fibroblast hücreleri, ertesi gün kesişme noktası oluşturmak için PEG 200 ul içinde tekrar süspanse edilir olması gerekir. Diğer hücre türleri ve kültür substrat boyutları uygun olarak aşağıdaki numaraları Scale. </li><li> Bir mikropipet kullanılarak, bir kuru hücre kültüründe bir alt tabaka üzerine DEX 0.5 ul damlacıkları dağıtın. Büyük hacimli damlacıkları büyük dışlama bölgeleri üretmek. 0.1 1 ul büyüklüğü arasında değişen damlacıklar dışlama micropatterning için tavsiye edilir. İsteğe bağlı: DEX damlacıkların vaktinden önce 24 saat çökelmiş ve oda sıcaklığında kurutmak için izin verilebilir. Bu temizleyici desenler üretebilir. </li><li> T içine PEG hücre süspansiyonu 200 ul dağıtıno iyi DEX damlacıkları kapsayacak. </li><li> 37. az 12 saat boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi ° C,% 5 CO2 içinde yerleştirin. Çanak elleçleme sırasında ve desenleri bozmamak için bir seviye inkübatör rafa yerleştirilen bu eğik olmadığından emin olun. </li><li> PEG çözüm çıkarın ve kültür ortamı 200 ul ile üç kez yıkayın. </li><li> Taze kültür ortamı ve inkübatör dönmek ekleyin. </li><li> Yasak bölge içine hücre hareketi gözlemlemek için periyodik kültürler izleyin. </li></ol> 3. Yapılandırma 2: Island desenlendirme (96-Plaka Biçimi) <ol><li> % 5.0 üstünde olduğu gibi hücre kültür ortamı içinde ağırlık / ağırlık PEG ve% 12.8 wt / wt DEX çözeltiler hazırlanır. </li><li> Ada modelleme için kullanılacak hücreler hasat etmek. Mevcut hücrelerinin toplam sayısı / konsantrasyonunu belirleyin. </li><li> % 12.8 DEX uygun bir hacim içinde ve Pelet tekrar süspansiyon hücreleri ada modelleme için hücrelerin istenen bir konsantrasyon elde etmek için. 5.000 ce konsantrasyonlarılls / ul veya daha az kuvvetle yapışık hücre tipleri için tavsiye edilir. Için zorluk bağlamadan veya gevşek bir şekilde bağlı olan hücreler vardır hücreleri, 10,000 hücre / ml &#39;ye kadar konsantrasyonlarda olarak kabul edilebilir. </li><li> Yukarıda anlatıldığı gibi, bir kuru hücre kültür alt tabaka üzerine DEX pipet 0.5 ul damlacıkları kurumasını önlemek için hızlı bir şekilde çalışmak. Damlacıkları kurumasına izin vermeyin. İsteğe: PEG çözeltisi 200 ul vaktinden önce oyuğa ilave edilebilir. DEX damlacıkları sonra dibine çöker ve kültür yüzeyi ile temas edecek PEG çözüm içine tevdi edilebilir. Bu temizleyici ada desenler üretebilir. </li><li> PEG 200 ul DEX damlacıkları örtün. </li><li> 37. az 12 saat boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi ° C,% 5 CO2 içinde yerleştirin. Çanak elleçleme sırasında ve desenleri bozmamak için bir seviye inkübatör rafa yerleştirilen bu eğik olmadığından emin olun. </li><li> PEG çözüm çıkarın ve kültür ortamı 200 ul ile üç kez yıkayın. </li><li> Taze kültür ekleorta ve inkübatör dönmek. </li><li> Adalardan hücre hareketi ve proliferasyonu dışa gözlemlemek için periyodik kültürler izleyin. </li></ol> 4. Yapılandırma 3: Dışlama Co-kültürlerin (96-Plaka Biçimi) <ol><li> % 5.0 üstünde olduğu gibi hücre kültür ortamı içinde ağırlık / ağırlık PEG ve% 12.8 wt / wt DEX çözeltiler hazırlanır. </li><li> Dışlama ve ada modelleme için kullanılacak hücreler hasat etmek. Her bir hücre tipi için mevcut hücrelerin toplam sayısını / konsantrasyonu tayin edilir. İsteğe Bağlı: Bazı cep eşlendirme ölçüde farklı proliferasyon indeksleri görüntüleyebilir. Ada desenli hücrelerin (özellikle uzun süreli kültürler için) overpopulating dan hücre dışı önlemek için 2 saat süreyle mitomisin C ile çıkarılması için kullanılan hücreler hasat tedavi etmek ya da daha önce onları ışın. Bu çoğalmasını önler. Floresan boya CellTracker gerekirse iki hücre popülasyonu ayırt etmek için kullanılabilir. </li><li> Pelet exclusio için hücreleri ve pelet tekrar süspansiyonN% 5.0 PEG uygun bir hacim içinde modelleme yukarıda belirtildiği gibi, hücre istenilen sayıda elde etmek için. Yukarıda olduğu gibi, hücreler, istenen konsantrasyon elde etmek için% 12.8 DEX uygun bir hacim içinde ada desenleme için pelet yeniden süspanse edin. </li><li> Bir mikropipet kullanılarak, bir kuru hücre kültüründe bir alt tabaka üzerine DEX hücre süspansiyonunun 0.5 ul damlacıkları dağıtın. Damlacıkları kurumasına izin vermeyin. </li><li> PEG hücre süspansiyonu 200 ul ile DEX damlacıklar kaplayın. </li><li> 37. az 12 saat boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi ° C,% 5 CO2 içinde yerleştirin. Çanak elleçleme sırasında ve desenleri bozmamak için bir seviye inkübatör rafa yerleştirilen bu eğik olmadığından emin olun. </li><li> PEG çözüm çıkarın ve kültür ortamı 200 ul üç kez yıkayın. </li><li> Taze kültür ortamı ve inkübatör dönmek ekleyin. </li><li> Hücre popülasyonları arasındaki etkileşimi gözlemlemek için co-kültürler izleyin. İsteğe bağlı: Kontroller dışlama veya ada desenlendirme indiv gerçekleştirerek hazırlanabiliridually, etkileşmeyen ko-kültür hücreleri veya dokusunda önce ya da sonra bir ya da her iki hücre popülasyonlarının ilgi yollar engelleyerek. </li></ol>

<ol>
	<li>Hatti-Kaul, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+two-phase+systems+:+methods+and+protocols.">Aqueous two-phase systems : methods and protocols.</a> Methods in biotechnology. xiii, 440 (2000).</li><li>Albertsson, P. A. k. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Partition of cell particles and macromolecules: separation and purification of biomolecules, cell organelles, membranes, and cells in aqueous polymer two-phase systems and their use in biochemical analysis and biotechnology. , 346 (1986).</li><li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cell+partitioning+using+an+aqueous+two-phase+flow+system+in+microfluidic+devices.">Continuous cell partitioning using an aqueous two-phase flow system in microfluidic devices.</a> Biotechnol. Bioeng. 88 (4), 489-494 (2004).</li><li>Soohoo, J. R., Walker, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+aqueous+two+phase+system+for+leukocyte+concentration+from+whole+blood.">Microfluidic aqueous two phase system for leukocyte concentration from whole blood.</a> Biomed. Microdevices. 11 (2), 323-329 (2009).</li><li>Hahn, T., Hardt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+and+size+separation+of+DNA+samples+at+liquid-liquid+interfaces.">Concentration and size separation of DNA samples at liquid-liquid interfaces.</a> Anal. Chem. 83 (14), 5476-5479 (2011).</li><li>Hatti-Kaul, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+two-phase+systems.+A+general+overview.">Aqueous two-phase systems. A general overview.</a> Mol. Biotechnol. 19 (3), 269-277 (2001).</li><li>Hustedt, H., Kroner, K. H., Menge, U., Kula, M. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+recovery+using+two-phase+systems.">Protein recovery using two-phase systems.</a> Trends in Biotechnology. 3 (6), 139-144 (1985).</li><li>Keating, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+Phase+Separation+as+a+Possible+Route+to+Compartmentalization+of+Biological+Molecules.">Aqueous Phase Separation as a Possible Route to Compartmentalization of Biological Molecules.</a> Acc Chem. Res. 45 (12), 2114-2124 (2012).</li><li>Helfrich, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+and+assembly+of+metal+particles+and+their+bioconjugates+in+aqueous+two-phase+systems.">Partitioning and assembly of metal particles and their bioconjugates in aqueous two-phase systems.</a> Langmuir. 21 (18), 8478-8486 (2005).</li><li>Diamond, A. D., Hsu, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prote.+Partitioning+in+PEG/Dextran+Aqueous+Two-Phase+Systems.">Prote. Partitioning in PEG/Dextran Aqueous Two-Phase Systems.</a> AIChE Journal. 36 (7), 1017-1024 (1990).</li><li>Y-T, Z. -. Q., Zhu, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+interfacial+tension+of+aqueous+two-phase+systems.">Modeling of interfacial tension of aqueous two-phase systems.</a> Chemical Engineering Science. 54 (4), 433-440 (1999).</li><li>Liu, Y., Lipowsky, R., Dimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+dependence+of+the+interfacial+tension+for+aqueous+two-phase+polymer+solutions+of+dextran+and+polyethylene+glycol.">Concentration dependence of the interfacial tension for aqueous two-phase polymer solutions of dextran and polyethylene glycol.</a> Langmuir. 28 (8), 3831-3839 (2012).</li><li>Rha, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+Tension+of+Polyethylene+Glycol/Potassium+Phosphate+Aqueous+Two-Phase+Systems.">Interfacial Tension of Polyethylene Glycol/Potassium Phosphate Aqueous Two-Phase Systems.</a> Physics and Chemistry of Liquids: An International Journal. 38 (1), 25-34 (2000).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Generation+of+Multiplexed+Cell+Cocultures+Using+Acoustic+Droplet+Ejection+Followed+by+Aqueous+Two-Phase+Exclusion+Patterning.">Rapid Generation of Multiplexed Cell Cocultures Using Acoustic Droplet Ejection Followed by Aqueous Two-Phase Exclusion Patterning.</a> Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (9), 647-657 (2012).</li><li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanolitre+liquid+patterning+in+aqueous+environments+for+spatially+defined+reagent+delivery+to+mammalian+cells.">Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells.</a> Nat. Mater. 8 (9), 736-741 (2009).</li><li>Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+aqueous+biphasic+systems+for+non-contact+cell+printing+on+cells:+engineering+heterocellular+embryonic+stem+cell+niches.">Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches.</a> Adv. Mater. 22 (24), 2628-2631 (2010).</li><li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprinted+feeder+cells+guide+embryonic+stem+cell+fate.">Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. , (2011).</li><li>Tavana, H., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+biphasic+microprinting+approach+to+tissue+engineering.">Aqueous biphasic microprinting approach to tissue engineering.</a> Biomicrofluidics. 5 (1), 13404 (2011).</li><li>Frampton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precisely+targeted+delivery+of+cells+and+biomolecules+within+microchannels+using+aqueous+two-phase+systems.">Precisely targeted delivery of cells and biomolecules within microchannels using aqueous two-phase systems.</a> Biomed. Microdevices. 13 (6), 1043-1051 (2011).</li><li>Hossein Tavana, K. K., Bersano-Begey, T., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rehydration+of+Polymeric,+Aqueous,+Biphasic+System+Facilitates+High+Throughput+Cell+Exclusion+Patterning+for+Cell+Migration+Studies.">Rehydration of Polymeric, Aqueous, Biphasic System Facilitates High Throughput Cell Exclusion Patterning for Cell Migration Studies.</a> Advanced Functional Materials. 21 (15), 2920-2926 (2011).</li><li>Falconnet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+engineering+approaches+to+micropattern+surfaces+for+cell-based+assays.">Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays.</a> Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).</li><li>Lim, J. Y., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sensing+and+response+to+micro-+and+nanostructured+surfaces+produced+by+chemical+and+topographic+patterning.">Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning.</a> Tissue Eng. 13 (8), 1879-1891 (2007).</li><li>Ringeisen, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jet-based+methods+to+print+living+cells.">Jet-based methods to print living cells.</a> Biotechnol. J. 1 (9), 930-948 (2006).</li><li>Wright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+static+and+dynamic+patterned+co-cultures+using+microfabricated+parylene-C+stencils.">Generation of static and dynamic patterned co-cultures using microfabricated parylene-C stencils.</a> Lab Chip. 7 (10), 1272-1279 (2007).</li><li>Takayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+cells+and+their+environments+using+multiple+laminar+fluid+flows+in+capillary+networks.">Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (10), 5545-5548 (1999).</li><li>Berthier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pipette-friendly+laminar+flow+patterning+for+cell-based+assays.">Pipette-friendly laminar flow patterning for cell-based assays.</a> Lab Chip. 11 (12), 2060-2065 (2011).</li><li>Davidson, R. L., O'Malley, K. A., Wheeler, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol-induced+mammalian+cell+hybridization:+effect+of+polyethylene+glycol+molecular+weight+and+concentration.">Polyethylene glycol-induced mammalian cell hybridization: effect of polyethylene glycol molecular weight and concentration.</a> Somatic Cell Genet. 2 (3), 271-280 (1976).</li><li>Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+Two-Dimensional+Patterned+Substrates+for+Protein+and+Cell+Confinement.">Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement.</a> J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).</li><li>Moon, S., Lin, P., Keles, H. O., Yoo, S., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Title+Cell+Encapsulation+by+Droplets.">Title Cell Encapsulation by Droplets.</a> J. Vis. Exp. (8), e316 (2007).</li></ol>

Yazarlar hiçbir mali çıkarlarının rekabet var.

ATP hücre micropatterning yöntemi hücre kültürü teknikleri yeterlik ötesinde çok az uzmanlık gerektiren ve hızlı bir şekilde hakim olabilir. Bu yaklaşımın avantajı, ucuz ve hızlı hücre kültürü türleri ve çeşitli biçimlerde ile uyumlu olmasıdır. Bu nedenlerden dolayı, bizim protokol kolayca özellikle yaşam bilim adamları, hücre çoğalması, göç ve kemotaksis, ve hücre popülasyonları arasındaki juxtacrine ve parakrin etkileşim etkisini araştıran kişiler tarafından kabul edilmel...

Iki uyuşmayan polimerlerin çözeltileri yeterince yüksek konsantrasyonlarda karıştırılır Sulu iki fazlı sistemler (ATPSs) oluşturur. Faz ayırma molekül ağırlığı ve polarite polimerlerin, çözeltiler, pH ve sulu çözücü 1, 2, iyonik içeriğinin ısısı içeren çeşitli faktörler tarafından etkilenmektedir. Ayrı iki polimer çözeltileri seçilmiş fazlı bir sistemin fizyokimyasal özellikler ile belirlenmiştir, fakat hangi nokta genellikle ATPSs biyoteknolojide kullanılan izin vererek, denatüre edici olmayan koşullar altında düşük bir polimer konsantrasyonu (% 20 den az ağırlık / ağırlık) gerçekleşir uygulamalar 3-9. Bugüne kadar en çok çalışılan ATP polietilen glikol (PEG) / dekstran (DEX) sistemidir. Bu pahalı olmayan ve biyolojik olarak uyumlu polimerler ile oluşturduğu ATP aslen moleküler bölümleme 2, 10 yolu ile biyomoleküllerin arıtma için tarif edilmiştir. Bölümlemefazlı sistemde katkıda olmayan ek moleküllerin veya parçacıkların PEG ve DEX ile karışık oluşur. DEX veya PEG ya da onların ilgili yakınlığa göre, moleküller veya parçacıklar tercihen iki faz biri içinde ya da ara yüzeyde yer alacaktır. PEG / DEX ATP diğer bir özelliği iki polimer fazlar arasındaki arayüzey gerilimi varlığıdır. PEG ve DEX oluşturduğu ATPSs genellikle yağ ve su gibi diğer sıvı-sıvı iki fazlı sistemlerde çok daha düşüktür arayüzey gerilimleri görüntüleyebilir, ancak arayüzey gerilimi kuvvetler hala, virüsler, hücre ve protein agrega 2 gibi küçük parçacıklar üzerinde etkileri bulunmaktadır , 11-13. Memeli hücreleri üzerinde herhangi bir zararlı etkilerini bu sahasına dahil Son olarak, yüksek bir moleküler ağırlık PEG ve DEX tuzlarının fizyolojik konsantrasyonlarının varlığında, düşük konsantrasyonlarda (% 5&#39;inden az ağ / yüksek moleküler ağırlıklı polimerler çeşitleri için ağırlık) olarak ayrı bir yana, azdır sistemleri14-16. Son zamanlarda, arayüzey özellikleri ve ATPSs bölümleme etkileri hücre desenlendirme 14, 16-20 için laboratuvar tarafından uygulanmıştır. Bu micropatterning, PEG varlığında, hücre kültürü yüzeyler üzerinde daha yoğun bir DEX çözelti gerçekleştirildi. Hücrelerin PEG fazına dahil edildiğinde, PEG / DEX arayüzey gerilimi 20 nedeniyle DEX damlacıkları girdikten dışındadır. Hücreler DEX faz olarak desenli, bunlar ara yüzey gerilimi ve bölümleme 16, 17, 19 ile hücre kültür substrat yüzeyine tutulur. Hücre desenlendirme için diğer yöntemlerden farklı olarak, ATP hücre desenlendirme öğrenmesi kolay ve sadece polimerler kendilerini ve hücre kültürü gerçekleştirmek ve bir mikropipet kullanma yeteneği hakkında temel bilgi gerektirir. Hücre desenlendirme için diğer yöntemler genellikle kolayca inci tercüme edilmediyse özel ekipman ve eğitim gerektirire yaşam bilimleri. Örneğin, bazı yöntemler (mikrokontak baskı veya mürekkep püskürtmeli baskı) dolaylı sonradan hücre eki 21, 22 siteler olarak hizmet kültürü substrat hücre yapışkan biyomoleküllerin desenler uygulayarak desen hücreleri. Dolaylı yaklaşım, bazı hücre türleri için yararlı olmalarına rağmen, kullanıcı beceri ve modelleme araç imal etmek için özel ekipman yüksek derecede gerektirir, ve belirli hücre tipi / biyomolekül desenine bağlı olarak seçicilik eksikliği olabilir. Alternatif olarak, hücre laminer akış desenlendirme, neticede ve inkjet baskı 23-26 içeren doğrudan desenlendirme yaklaşımlar yoluyla yüksek desen özgüllük tevdi edilebilir. Ancak, bu teknikler aynı zamanda kullanıcı uzmanlık ve özel ekipman gerektiren ve yazdırma işlemi sırasında hücreler zarar verebilir. Bu yaklaşımlar genellikle yaşam bilimleri yararlı bir araç olarak hücre desenlendirme için hücreler, hassas desenleri üretmek olsa da, maliyeti etkili olmalıuygulamak basit nd. Burada, daha önce yayınlanmış başvurular içerisinde açıklanmaktadır ATPSs kullanılarak desenli bir hücre kültürü üretmek için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Sadece Mikropipetler kullanarak, kullanıcılar göç deneyleri için hücre dışlama bölgeler veya hücre adaları üretebilir. Bu, ya DEX fazındaki hücrelerin korur veya DEX dan PEG faz içinde depolanmıştır hücreleri hariç PEG / DEX ara yüzey gerilimi yolu ile elde edilir. Bu iki temel modelleme teknikleri tarama olarak, bu hızla, karaciğer-fibroblast hücre ko-kültürler olarak hücrelerinin ko-kültürü üretmek mümkündür. Modelleme yöntemleri, ATP parametreleri ve beklenen sonuçlara ayrıntılı olarak tarif edilmektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Üretici </td></tr><tr><td> Dekstran 500.000 kDa </td><td> Pharmacosmos, Danimarka </td></tr><tr><td> Polietilen Glikol 35.000 kDa </td><td> Sigma-Aldrich, St Louis, MO </td></tr><tr><td> Hela </td><td> ATCC, Manassas </td></tr><tr><td> HepG2 C3A </td><td> ATCC, Manassas </td></tr><tr><td> 3T3 NIH </td><td> ATCC, Manassas </td></tr><tr><td> Hücre Tracker </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr></tbody></table>

cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems

Hızlı, kullanımı kolay ve uygun fiyatlı Hücre desenlendirme teknolojileri hücre-hücre etkileşimleri ve doku mühendislik sistemlerini incelemek için yüksek verimlilik hücresi tayinlerinde, platformların gelecekteki gelişimi için gerekli olacaktır. Bu ayrıntılı protokol eşik konsantrasyonu yukarıda kombine faz ayrı zaman ki dekstran (DEX) ve polietilen glikol (PEG) solüsyonları kullanılarak biyo-uyumlu hücre eş-kültür üretmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Hücreler bu yöntem kullanılarak çeşitli konfigürasyonlarda da desenli olabilir. Hücre dışlama modelleme bir alt tabaka üzerinde damlacıkların DEX baskı ve PEG içeren bir hücre, bir solüsyon ile kaplanması ile uygulanabilir. İki polimer çözeltileri arasında oluşan ara yüzey gerilimi DEX damlacık dış çevresinde düşme ve geçiş deneyleri için kullanılan bir dairesel açıklığa oluşturmak için hücreler neden olur. Hücre adalar PEG çözeltisi içine hücreden zengin DEX fazlı dağıtım veya DEX örterek desenli olabilirPEG çözeltisi ile damlacık. Eş-kültür DEX ada modelleme ile hücre çıkarma birleştirilmesi ile direkt olarak oluşturulabilir. Bu yöntemler, manuel micropipetting içeren sıvı işleme yaklaşımı, bir dizi ile uyumlu olan, ve hemen hemen herhangi bir yapışkan ile hücre tipi kullanılabilir.

Hücre desenlendirme için PEG ve DEX uygun bir kombinasyonu seçmek için bu binodal eğrisi belirlemek için önemlidir. Bu eğri bir ATP oluşabilir ve sıcaklık, pH ve iyonik polimer içeriğine göre verilen bir grubu için farklı olabilir hangi noktaları çizer. Özelleştirilmiş orta formüller gerektirmektedir hücreleri kültür için deneysel olarak binodal eğrisi belirlemek için gerekli olabilir. Bu kadar binodal ve PEG ve DEX içeriği arasında değişen (Şekil 1, mor daireler) elde ...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems at JoVE.com

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Sulu de iki fazlı sistemlerde hücrelerin aynı anda birden fazla kalıp popülasyonları için kullanılmıştır. Hücre desenlendirme için bu hızlı ve kolay bir yöntem dekstran ve polietilen glikol ve iki polimer çözümleri arasında var arayüzey gerilimi sulu çözeltilerinin faz ayrışması yararlanır.

Sulu İki fazlı sistemler kullanma Hücre Co-kültür desenlendirme

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

cell-co-culture-patterning-using-aqueous-two-phase-systems

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.3K Görüntüleme.  University of Michigan. Sulu de iki fazlı sistemlerde hücrelerin aynı anda birden fazla kalıp popülasyonları için kullanılmıştır. Hücre desenlendirme için bu hızlı ve kolay bir yöntem dekstran ve polietilen glikol ve iki polimer çözümleri arasında var arayüzey gerilimi sulu çözeltilerinin faz ayrışması yararlanır.

Video: Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

Plazma Litografi Yüzey Desenlendirme Hücre Ağları Oluşturma

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Biyomühendislik

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Sulu Ortamlarda Hidrokarbon Dönüşüm Enable A Toolkit

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Photolithographically Tanımlı Parylene-C hücre Desenlendirme: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Yüzeyleri

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

İlaç test için bir sulu iki-fazlı bir sistem ile Cancer Celi sferoitlerin Robotik üretimi

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

3D Kağıt mikroakışkan Cihazlar Construct Yapışkan Desenlendirme kullanma

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Katmanlı Aljinat Yapıları: Heterojen hücre popülasyonlarının Co-kültür için bir platform

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

mikroakışkan Probe ile Canlı Hücre Katmanlar hızlı Subtractive Desenlendirme

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

DNA Kullanarak Hücrelerin Basit, Uygun Fiyatlı ve Modüler Deseni

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

Çekiş Kuvveti Mikroskopisinde Uygulamalar için Hidrojel Desenleme Teknikleri Kullanılarak Hücre Yapışıklıklarının Kontrolü

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

Methods Article

Sulu İki fazlı sistemler kullanma Hücre Co-kültür desenlendirme