Son zamanlarda, oral keratinositler benzersiz özelliği nedeniyle dikkat çekmektedir. Fare oral keratinositlerin aşağı akış uygulamaları için uygun kök hücre benzeri bir durumda kült haline getirilmiş bir protokol sunuyoruz. Fare oral keratinosit kültürü ve cilt keratinositten farklı karakteristik.
Bu protokolde primer fare oral keratinositini başarıyla izole ettik ve uzun vadeli bir kültür tekniği geliştirdik. Bu kültür sistemi, oral basilar kök hücrenin özelliğini ve ilgili hastalıklarını daha iyi anlamak için moleküler ve biyokimyasal tahlillerde kullanılabilir. Yetişkin bir C57BLK6J fareden ödün ettikten sonra, ağız çevresindeki saçları bir tıraş makinesiyle çıkarın ve makas kullanarak yanaklardan her iki taraftaki çeneye doğru kesin.
Daha sonra, ağzı geniş açmak ve pamuklu çubuk kullanarak herhangi bir kanı emmek için tokaları kullanın, ardından ağzın içini% 10 povidon iyot içeren bir pamuklu çubukla silerek paleti dezenfekte edin. Fare paletini hasat etmek için, önce cerrahi bir neşter bıçağı kullanarak, maksiller dişlerin palet tarafı boyunca tam kalınlıklı marjinal bir kesi yapın. Daha sonra bir raspatorium kullanarak, tüm paleti dikkatlice parçalara ayırın.
Palet dokusunu antibiyotik ve antimykotiklerle desteklenmiş dört mililitre tam ortam içeren 15 mililitrelik bir tüpe hızlı bir şekilde aktarın. Dokuları inkübasyona hazır olana kadar buzda tutun. Laminer akış davlumbazında, dokuları antibiyotikler ve antimykotiklerle dört mililitre tam ortam içeren 60 milimetrelik bir tabağa aktarın.
Daha sonra kısa künt tokalar ve neşter bıçağı kullanarak, dokulardan herhangi bir kanı hafifçe çıkarın ve dokuları tam ortamla 10 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, dokuları antibiyotik ve antimycotics ile desteklenmiş dört mililitre% 0.025 tripsin içeren 35 milimetrelik bir tabağa aktarın. Epitel yüzeyi aşağı bakacak şekilde dokuları yerleştirin ve kültür davlumbazında oda sıcaklığında 16 saat kuluçkaya yatırın.
Bir gecede tripsin sindiriminden sonra, dokuyu tripsin çözeltisinden çıkarmak ve epitel yüzeyi yukarı bakacak şekilde tripsin inhibitörü çözeltisi içeren 60 milimetrelik bir tabağa aktarmak için bir çift künt forseps kullanın. Daha sonra, paletin kenarınaps ile tutunarak, alttaki lamina propria'daki epitel tabakasını hafifçe kazımak için neşter bıçağını kullanın. Dokulardan maksimum miktarda epitel hücresi toplamak için, dokuyu dört mililitre tam orta ile 60 milimetrelik başka bir çanağa aktarın ve daha önce gösterildiği gibi kazımayı tekrarlayın.
Daha sonra, 50 mililitrelik konik tüpün üzerine steril bir 100 mikron hücre süzgeci yerleştirin. Ve steril bir pipet kullanarak, yüzeyini ıslatmak için süzgeçe iki mililitre tripsin çözeltisi aktarın. Daha sonra bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu 60 milimetrelik tabakta birkaç kez karıştırın ve hücreleri 100 mikron hücre süzgecinden filtreleyin.
Hücre sayısını saymak için, 50 mikrolitre trippan mavisi çözeltisine hücre süspansiyonunun 15 mikrolitresini ekleyin, ardından hücre trippan mavisi karışımının 10 mikrolitresini bir hemositometreye aktarın ve hücre sayısını sayın. Daha sonra, hücre süspansiyonu santrifüj, süpernatan çıkarmak ve tüpe Chelex FBS içeren tam orta iki mililitre ekleyin. Beş mililitrelik pipet kullanarak birkaç kez titrat yaparak hücre peletini yeniden dirildi.
Daha sonra bir fareden beşinci hücrelere iki ila beş kez kollajen tip bir ile önceden kaplanmış 24 kuyulu bir kuyuya plakalayın ve hücreleri ortamı değiştirmeden iki gün boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya bırakın. Primer oral keratinositler monolayer olarak büyüdü ve parke taşı morfolojisi gösterdi. Küçük keratinosit kolonileri üç ve beş gün sonra görülebilirdi.
Bir haftalık kuluçkadan sonra, bu koloniler büyüdü ve sıkı koloniler oluşturdu. İlk pasaj ilk kaplamadan iki hafta sonra gerçekleştirildi ve daha sonraki pasajlarda keratinositler daha kısa bir kültür süresi ile istikrarlı bir büyüme sergiledi. İzolasyon işlemi sırasında önemli fibroblast kontaminasyonu meydana gelirse keratinositler büyümeyi durdurdu.
Kültlemeden sonra keratinositler keratin 14 ve alfa6-integrin ifade etti. Erken ve geç geçiş hücreleri P63'ün saplarını doğrulayan tek tip ifadesini gösterdi. Bununla birlikte, yüksek kalsiyum ile tedavi edilen keratinositler, yüksek kalsiyum tedavisinin kök hücre ile ilgili genleri baskıladığını gösteren P63 ekspresyonda azalma gösterdi.
Diferansiasyon belirteci keratin 13 erken ve geç pasajlarda nadir veya hiç ifade göstermedi, ancak yüksek kalsiyum tedavisinde anlamlı ifade gösterdi. Fibroblast belirteci PDGFR alfa, keratinosit kültüründe bu protokolün bazal keratinositleri başarıyla izole edebileceğini ve bu hücreleri farklılaşmamış durumda tutabileceğini gösteren ifade edilmemiştir. Bindirme epidural taraftan başlamalı ve doku örneği başına 10 dakika olmalıdır.
Ayrıca genel olarak, hücrelerin pipetlenerek daha iyi hücre canlılığı için önemlidir. İki veya üç geçiş sonra, oral keratinosit daha fazla fonksiyonel deney için stabil hale gelir. Daha da önemlisi, bu protokol hücresel ve moleküler test in vitro için transgenik fare ömrü ile birleştirilebilir.
Son çalışma oral basilar kök hücrenin dinamiklerini ve heterojenliğini bildirmektedir. Bu yöntem ağız kök hücre biyolojisinin çalışmasını kolaylaştıracak ve ağız hastalıklarının daha iyi anlaşılmasına yol açacaktır.
