Bu çalışma ULUSAL ARTRİT, MİSKÜLOKELETAL VE CİLT HASTALIKLARI ENSTİTÜSÜ (R01AR069653 - Zhang LJ) ve Ulusal Sağlık Destek Enstitüleri (5T32AR062496-03 - CA) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri, UCSD Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Yenidoğan Cildinde Primer Fare KC İzolasyonu ve Kültürü <ol><li> C57B / 6 vahşi tipli fare suşundan post-doğum günündeki 0-2 yenidoğan makas kullanarak kesilerek kurban edin. Bilek ve ayak bileği eklemlerinin hemen üzerindeki kolları kesin, daha sonra kuyruk tamamen kesip küçük bir delik bırakın. </li><li> Tüm cildin soyulması için önce kuyruktaki delikten keskin bir makas takın ve cildinizi vücudun dorsal orta çizgisi boyunca boyundaki açıklığa kadar kesin. Daha sonra, cildi tutunacak şekilde maruz kalan cesedi ve diğer forsepsleri kavrayabilmek için bir forseps kullanın ve vücudun tüm cildi hafifçe soyun ve bir sürekli hareketle bacak kütükleri üzerinden soyun. <ol><li> Ciltten dokunulmamış bir parça olarak soyun ve cildi parçalara ayırmamaya özen gösterin, çünkü cilt soyulurken hücre kaybına neden olur. </li></ol></li> &lt;Li&gt; 10 cm&#39;lik bir Petri kabında 15 mL&#39;lik steril PBS ile soyulmuş cildi durulayın, daha sonra her bir yavrunun cildini, KC büyüme ortamında 4 mg / mL disperse içeren buz gibi soğuk sindirim tamponu ile doldurulmuş 2 mL tüp içine yerleştirin (KC bazal ortamı 0,06 mM CaCl2, DGS ve antibiyotikler / Antimikotiklerin vardır). NOT: Birden fazla deri izolatı kombine edilebilir ve 12 mL dispaz çözeltisi içeren bir 15 mL tüp içinde (tüp başına 5 deriye kadar) inkübe edilebilir. Cilt tüpünü, rotatorda 4 ° C&#39;lik bir buzdolabında gece boyunca inkübe edin. <ol><li> Katlanan bölgenin dispase solüsyonuna yeteri kadar maruz kalmayla sonuçlanacağı için tüpün içinde cildin katlanmadığından emin olun. </li></ol></li><li> Ertesi gün (disperse 12-18 saat sonra), cilt dispase solüsyonu ile bir Petri kabına aktarılır. Fazla disperi uzaklaştırmak için her doku parçasını 15 mL steril PBS ile yeni bir Petri kabına aktarın. </li><li> İki çift forseps kullanarak deriyi PBS&#39;den tutun,Cildi kaldırın ve yeni bir Petri kabına, epidermal tarafı aşağı ve dermis tarafı yukarı gelecek şekilde aktarın. Deri katlanmalarını dikkatli bir şekilde gerin böylece Petri kabında tamamen uzatın. </li><li> Yeni bir Petri kabındaki her cilt için tripsin bazlı sindirim solüsyonundan 500 μL yerleştirin. Cımbızı kullanarak epidermisi tutarken yavaşça dermikleri yukarı kaldırın ve epidermiden uzaklaştırın. Dermizi biyolojik tehlikeli madde olarak atın. Ayrılan epidermisi aktarın ve her damla tripsin solüsyonunda bazal tabaka aşağıya doğru yüzdürün. <ol><li> Epidermis, tripsin solüsyonu üzerine katlanırsa, bazal KC&#39;lerin epitelden etkili bir şekilde sindirilmesini sağlamak için forseps kullanarak herhangi bir kat yeri çıkarın. </li></ol></li><li> Cildini 20 dakika hafifçe çalkalayarak yatay bir çalkalayıcıda oda sıcaklığında (kapak kapalıyken) tripsin solüsyonundaki bir Petri kabında inkübe edin. </li><li> Epidermis başına 2 mL eklenmiş KC büyüme ortamı ekleyin (başına yaklaşık 1 inç kare boyutuEpidermis) ekleyelim. Forseps kullanarak epidermis kavrayın ve epidermal sayfadan tek hücrelerin serbest bırakmak için şiddetle epidermis ileri ve geri sürtün. <ol><li> Hücreler epidermisden ayrıldıkça orta dönüşün giderek bulanık olduğunu izleyin. Kalan epidermal tabakayı çanakta bırakarak yeni bir tüpe hücre süspansiyonu toplamak ve aktarmak için Petri kabını eğin. </li></ol></li><li> 2 mL KC büyüme ortamı ilave edildikten sonra epidermal tabakanın sürtünmesini iki kat daha tekrarlayın ve hücre süspansiyonlarını aynı tüpe birleştirin. </li><li> Uygun serum serumu pipetini kullanarak herhangi bir hücre yığını kırmak için hücre solüsyonunu birkaç kez hafifçe birkaç kez pipetleyin, sonra yeni bir 50 mL&#39;lik santrifüj tüpüne 100 μm&#39;lik bir filtreden geçirin. </li><li> Filtrelenmiş hücreleri 5 dakika 180 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı aspire edin ve yavaşça 1 mL soğuk KC büyüme ortamı / epidermis hücre peletini tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Hücreleri bir hemositometre ile sayın. <br/&gt; NOT: KC&#39;ler spontan olarak süspansiyonda ayrım yapabilir, bu nedenle hücrelerin optimal performansını sağlamak için hücrelerin izolasyondan sonra en kısa sürede kaplanması gerekir. KC&#39;nin kendiliğinden farklılaşmasını azaltacağı için, sayım yaparken hücreleri buz üzerinde bırakmanızı öneririz. </li><li> Kültür tabaklarında KC büyüme ortamı içinde, 5 x 10 4 / cm2 &#39;lik bir yoğunlukta hücreler ana hücre eki teşvik eden bir hücre dışı matris (ECM) ürünü ile kaplı önceden. NOT: Bir ticari mevcut (örn., Jelatin bazlı bir kaplama malzemesi olan bağlanma faktörü kullanıyoruz (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız). Hücreler nemlendirilmiş inkübatörde% 5 CO 2 ile 37 ° C&#39;de kültüre edildi ve taze ortam Her geçen gün yenilendi. <ol><li> Kaplama için kültür bulaşıkları, hücre tohumlamasından önce 10 dakika ila 2 saat süreyle oda sıcaklığına ısıtılmış hücre bağlama kaplama malzemesiyle kaplanır. Daha önce bağlanma faktörünü kaldırınHücre süspansiyonu ekleniyor. </li></ol></li><li> Bağlanmamış hücreleri çıkarmak için ilk kaplamadan 24 saat sonra ortamı değiştirin ve deneyler öncesinde hücreler istenen konfluene erişene kadar ortamı her gün değiştirin. </li></ol> 2. Yetişkin Kuyruk Cildinden Primer Fare KC İzolasyonu <ol><li> Yetişkin bir C57BL / 6 fare (tercihen 6-15 hafta arasında yaş; erkek ya da dişi) hayvan tesis yönetmeliklerine göre kurban edilir. Kuyruk gövdesindeki kuyruğu kuyruk tabanı üzerinden kesin ve ucunda görünür bir delik olması için ~ 2 mm kuyruk ucunu kesin. </li><li> Kuyruk cildi soymak için öncelikle kuyruk derisini kaide ucundan kuyruk ucuna kesmek için keskin bir bıçak kullanın. Ardından, maruz kalan kuyruk kemiğini ve diğer forsepsleri kavramak için bir forseps kullanın ve hafifçe tek bir kesintisiz hareketle kemikten kuyruk cildi soyun. Soyulmuş cildi orta çizgiden kesin böylece her bir parça 2-3 cm&#39;den daha kısa olacaktır. </li><li> Soyulmuş deri zehirini yıkayınH 10 mL&#39;lik bir Petri kabında steril PBS&#39;nin 15 mL&#39;si, daha sonra her bir kuyruktan cildi buz soğuğu sindirim tamponu (KC büyüme ortamında 4 mg / mL dispaz) ile doldurulmuş 2 mL tüp içine yerleştirin. NOT: Birden fazla cilt parçası da birleştirilebilir ve 12 mL dispaz çözeltisi içeren bir adet 15 mL&#39;lik tüple (en fazla 5 kuyruk tüpü) inkübe edilebilir. <ol><li> Cilt tüpünü, rotatorda 4 ° C&#39;lik bir buzdolabında gece boyunca inkübe edin. </li></ol></li><li> Tek hücre süspansiyonunu kuyruk epidermisinden izole etmek için 1.4 ila 1.13 arasındaki adımları uygulayın. </li><li> 10 x 10 4 / cm2 yoğunluğunda yetişkin hücrelerinin tohum kültür tabaklarına kollajen ile önceden kaplanmış KC büyüme ortamı içinde (bir hematositometre ile sayılmıştır). NOT: Ticari olarak temin edilebilen bir kollajen bazlı kaplama kiti kullanırız (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız). Hücreler, 37 ° C&#39;de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatör içinde kültürlenmiştir ve taze ortam her gün doldurulan. Genel olarak, cUltura yemekleri, hücre ekiminden önce 30 dakika ila 1 saat boyunca kollajen ile kaplanmalıdır. Jelatin bazlı bir kaplama malzemesi olan bağlanma faktörüne kıyasla, kollajen ile kaplandığında kaba yetişkin KC bağlanmasının önemli bir artışının olduğunu gözlemliyoruz. </li><li> Bağlanmamış hücreleri çıkarmak için ilk kaplamadan 24 saat sonra ortamı değiştirin ve deneyler öncesinde hücreler istenen konfluene erişene kadar ortamı her gün değiştirin. </li></ol> 3. Yüksek Kalsiyum ile KC&#39;lerin İn Vitro Farklılaşması <ol><li> Nihai değişimi etkilemek için, kültür ortamı içinde 0.2 mM CaCl2 ilave edin. </li><li> Alternatif olarak, yüksek kalsiyum ilavesinden önce düşük kalsiyum KC bazal ortamda eklenen büyüme takviyeleri olmadan kültürlü KC&#39;leri bir gece aç bırakın. NOT: Büyüme faktörü açlığı, erken farklılaşma için hücre taahhüdünü ve K10 gibi erken farklılaşma belirteçlerinin indüksiyonunu geliştirecektir 5 </&gt; Sup. </li></ol> 4. UVB Işınlaması Aracılı Hücre Ölümü ve KC&#39;lerden TNFa salınımı <ol><li> Hücreler konfluansa ulaşıncaya kadar günlük orta değişim ile KC büyüme ortamında fare KC&#39;leri (37 ° C&#39;de% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş inkübatörde) kültürleyin. UVB ışınlamasından hemen önce, büyüme ortamını çıkarın ve 500 μL PBS ile değiştirin. Daha sonra hücreleri 25 mJ / cm 2 UVB veya taklit kontrol uygulayın (UVB yok). Not: UVB ışınlaması daha önce tarif edildiği gibi 10, iki 8 W ampuller (312 nm) ile el UVB lambalar kullanılarak gerçekleştirilir. UVB ışınlamasından sonra, PBS aspire edilir ve taze ortam ilave edilir. </li><li> Ölçün ve 6, 8, CCK-8, hücre canlılığı deneyi ile hücre canlılığını ölçmek ve üreticinin talimatlarına 11 takip eden 24 saat sonra UVB tedavisi. </li><li> İstenilen zaman noktalarında UVB ile muamele edilen KC&#39;lerden şartlandırılmış ortamı toplayın ve salınan TNFa&#39;yı ölçünÜreticinin talimatına göre 7 , 12 numaralı fare TNF (Mono / Mono) ELISA kiti ile klimatize edilmiş ortamda. </li></ol>

<ol>
	<li>Mauro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+barrier+perturbation+abolishes+the+Ca2++and+K++gradients+in+murine+epidermis:+quantitative+measurement+using+PIXE.">Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE.</a> J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).</li><li>Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+calcium+reservoirs+in+mammalian+epidermis:+ultrastructural+localization+by+ion-capture+cytochemistry.">Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry.</a> J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).</li><li>Elias, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+epidermal+calcium+gradient+coincides+with+key+milestones+of+barrier+ontogenesis+in+the+rodent.">Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent.</a> J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).</li><li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture.">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li><li>Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ctip2+is+a+dynamic+regulator+of+epidermal+proliferation+and+differentiation+by+integrating+EGFR+and+Notch+signaling.">Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).</li><li>Lai, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+bacteria+regulate+Toll-like+receptor+3-dependent+inflammation+after+skin+injury.">Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury.</a> Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).</li><li>Bernard, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+radiation+damages+self+noncoding+RNA+and+is+detected+by+TLR3.">Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3.</a> Nat Med. 18 (8), (2012).</li><li>Zhang, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+Peptide+LL37+and+MAVS+Signaling+Drive+Interferon-beta+Production+by+Epidermal+Keratinocytes+during+Skin+Injury.">Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury.</a> Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).</li><li>Borkowski, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-Like+Receptor+3+Activation+Is+Required+for+Normal+Skin+Barrier+Repair+Following+UV+Damage.">Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage.</a> J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).</li><li>Borkowski, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+3+activation+is+required+for+normal+skin+barrier+repair+following+UV+damage.">Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage.</a> J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).</li><li>Zillessen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+role+of+dipeptidyl+peptidase+4+(DPP4)+in+primary+human+(pre)adipocytes.">Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes.</a> Sci Rep. 6, 23074 (2016).</li><li>Wells, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage-inducible+C-type+lectin,+mincle,+is+an+essential+component+of+the+innate+immune+response+to+Candida+albicans.">The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans.</a> J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).</li><li>Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+actin+polymerization+is+the+driving+force+for+epithelial+cell-cell+adhesion.">Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion.</a> Cell. 100 (2), 209-219 (2000).</li><li>Zhuang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF+receptor+p55+plays+a+pivotal+role+in+murine+keratinocyte+apoptosis+induced+by+ultraviolet+B+irradiation.">TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation.</a> J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).</li><li>Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+utilization+of+epidermal+keratinocytes+for+oncogene+research.">Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research.</a> Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).</li><li>Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+keratinocytes.">Isolation and culture of mouse keratinocytes.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+keratinocyte+culture.">Primary mouse keratinocyte culture.</a> Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).</li><li>Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+murine+epidermal+differentiation+markers+is+tightly+regulated+by+restricted+extracellular+calcium+concentrations+in+vitro.">Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro.</a> J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).</li><li>Yuspa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+for+proliferation+and+differentiation+in+keratinocytes.">Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes.</a> Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).</li><li>Fang, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+enhances+mouse+keratinocyte+differentiation+in+vitro+to+differentially+regulate+expression+of+papillomavirus+authentic+and+codon+modified+L1+genes.">Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes.</a> Virology. 365 (1), 187-197 (2007).</li><li>Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+cell+cycle+exit,+and+onset+of+terminal+differentiation+in+cultured+keratinocytes:+pre-programmed+pathways+in+control+of+C-Myc+and+Notch1+prevail+over+extracellular+calcium+signals.">Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals.</a> J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).</li><li>Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+1.2+mmol/l+calcium,+triamcinolone+acetonide,+and+retinoids+on+low-calcium+regulated+keratinocyte+differentiation.">Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation.</a> Br J Dermatol. 111, 64-72 (1984).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Cilt epidermisi vücudu dış ortamdan ayırmak ve korumak, su kaybı, patojenler, ısı ve UV ışınlarından hasar oluşturmak için kritik bir bariyer olarak işlev görür. KC&#39;ler epidermisin baskın hücre soylarıdır ve epidermal KC&#39;lerin birincil kültürü, bariyer oluşumunun biyolojik süreçlerini ve KC&#39;lerin in vitro ortamda hakaretlere tepkisini incelemek ve anlamak için yararlı bir araçtır. Burada neonatal ve erişkin fare derisinden birincil epiderma...

Cilt, vücudun en büyük organıdır ve dış tabaka olarak epidermisdir. Epidermis, vücudu çevreden ayırmak için sağlam bir epidermal bariyer oluşturmada kritik bir rol oynar ve böylece su kaybını önler ve alerjen, patojen ve UVB maruziyeti gibi çevresel hasarlardan korunma sağlar. Epidermis, farklılaşmamış bazal keratinositlerden (KCs) oluşan tek bir katmandan, bazal tabaka, bunu takiben bir östrus tabakası, granüler tabaka ve stratum corneum&#39;dan oluşan çok tabakalı bir tabakalı epitele dönüşür. Hem epidermal kök hücrelerden hem de transit amplifikatör hücrelerden oluşan bazal KC&#39;ler proliferatif ve farklılaşmamıştır. Bazal KC&#39;ler hücre döngüsünden çıkarken hücreler farklılaşmaya çalışırlar ve hücre-hücre kavşaklarının olgunlaşması ve bir epidermal geçirgenlik bariyeri (EPB) oluşumu eşliğinde epidermisin yüzeyine doğru giderek yer değiştirirler. Eğik tabakadaki KC&#39;ler, erken diferansiyasyonu ifade ederIyon belirteçleri, örneğin Keratin 10 (K10); KC&#39;ler granül tabakaya göç ederken, hücreler Filaggrin (FLG), Lorikrin (LOR) ve Involucrin (INV) gibi geç farklılaşma belirteçlerini ekspres eder. Stratum corneum&#39;da, KC&#39;ler terminal olarak diferensiye edilmiş korneositler haline gelir ve bunlar, sonunda yeni hücreler yerine geçtikten sonra süsleme yoluyla dökülür. Kalsiyum, epidermisin en fizyolojik ajanı olarak düşünülür ve benzer şekilde in vitro ve in vivo farklılaşmaları tetikler. Normal deri epidermisinde, kalsiyum iyonları karakteristik bir &quot;konsantrasyon gradyanı&quot; oluşturur ve konsantrasyonda deri yüzeyine doğru artar 1 , 2 , 3 . Kalsiyum konsantrasyonu, en alttaki tabakalardan (bazal ve spinöz katmanlar) düşük seviyelerden üst granüler katmandaki bir tepeye yükselir ve en yüzeysel katmanda (stratum corneum) ihmal edilebilir seviyelere düşer.<html> Kalsiyum degradasyonu, aynı zamanda, kalsiyum sinyallemesinin KC diferansiyasyonunda kritik bir rol oynadığını destekleyen bir bileşen geçirgenlik bariyerinin ortaya çıkması ile çakışarak gelişir. İn vitro düşük kalsiyum (0.02-0.1 mM) bazal KC&#39;lerin tek tabaka halinde çoğalmasını sağlarken, yüksek kalsiyum (&gt; 0.1 mM), hücrelerin terminal birleşimine hızlı ve geri döndürülemez bir taahhütte bulunur, bu da sıkı birleşim oluşumu ve indüksiyon ile gösterilir LOR ve INV&#39;nin bazal KC 4 , 5&#39;e yüksek kalsiyum muamelesi üzerine uygulanması. Bariyer oluşumuna ek olarak, epidermal KCler de cildin doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir bileşenidir. UVB ışınlaması veya yaralanması üzerine salınan patojenlere veya hasar görmüş moleküler kalıplara (DAMP&#39;ler) yanıt olarak, KCs TNFa, IL6 ve IFNβ gibi inflamatuar sitokinleri büyük miktarda üreterek immün sistem aktivasyonuna yol açabilir&gt; 6 , 7 , 8 , 9 . KC&#39;lerden uygun iltihap sinyali patojen temizlemesi için gerekli olmakla birlikte, kontrol edilemeyen inflamatuar yanıt, sedef hastalığı ve rosacea 6 , 8 gibi oto-inflamatuar cilt hastalıklarının gelişimini tetikleyebilir. Genel olarak, KCler bozulmamış cilt bariyerini korumada ve patojen istilasına veya çevresel hakaretlere karşı bir bağışıklık tepkisi başlatmada hayati bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, epidermal KC&#39;lerin birincil kültürü, epitel biyolojisini, KC farklılaşmasını ve ayrıca KC uyarılı doğal immün yanıtları incelemek için yararlı bir tekniktir. Primer fare epidermal KC&#39;lerin izolasyonu ve kültürü, KC&#39;nin çeşitli harici uyarıcılara duyarlılığı ve hassasiyeti nedeniyle zor bir süreç olabilir. Burada, yenidoğan fare derisinden KC&#39;leri izole etmek ve kültürlemek için bir yöntem anlatılmaktadır.Yetişkin fare kuyruğu cildi. Yetişkin KC izolasyonu için, fare dorsal deri kullanmıyoruz, çünkü bu dokudan yeterli miktarda canlı KC&#39;lerin izole edilmesi aşağıdaki nedenlerle zor olabilir: Birincisi, saç döngüsünün (telogen) dinlenme fazındaki yetişkin dorsal deri, Sadece 1-2 kat hücreli ince epidermis, düşük hücre verimi ve epidermisin dermisden ayrılmasına neden olur ki bu başarılı KC izolasyon için kritik adımdır. İkincisi, yetişkin dorsal deri üzerinde bulunan yüksek kıl follikülü yoğunluğu, epidermisin dermisden ayrılma zorluğuna daha fazla katkıda bulunur. Bunun yerine, yetişkin fare KC&#39;leri için kuyruk derisini rutin olarak kullanırız, çünkü bu epitel 3-5 epidermal KC tabakasıyla daha kalıntır. Ayrıca epidermal ayrılmaya müdahale etmeyen daha düşük bir saç follikülü yoğunluğu vardır, böylece fare yaşına ve saç döngüsüne bakılmaksızın yetişkin fare kuyruk derisinden KC izolasyonuna izin verir. İzole edilmiş neonaTal KC&#39;ler, jelatin kaplı kültür bulaşıkları üzerine ekilirken kolajen kaplı bulaşıklar yetişkin hücrelerin yenidoğan muadillerine kıyasla zayıf kalma yeteneklerinden dolayı izole yetişkin KC&#39;leri tohumlamak için kullanılır. Kültür fare KC&#39;lerine düşük kalsiyum bazal ortam, epidermal büyüme faktörü (EGF), sığır transferini, insülin benzeri büyüme faktörü (IGF1), prostaglandin E2 (PGE2), sığır serum albümini (BSA) ve hidrokortizon içeren dGS ile takviye edilmiştir. İlk kaplamadan 2-4 gün sonra, farklılaşmış KC&#39;lerin çoğu, günlük orta değişimler sırasında yıkanabilir ve kalan yapışık hücreler, tipik Arnavut kaldırımı morfolojisi 4 gösterir , çoğalmakta ve erken farklılaşma markörü K10&#39;u ifade etmemektedir.

<table width="633">
	<tbody>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="width:171px;height:100px;">C57BL/6 neonates or adult wildtype mice</td>
			<td style="width:177px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;">000664</td>
			<td style="width:167px;">Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="width:171px;height:60px;">KC basal medium (EpiLife)</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">MEPICF500</td>
			<td style="width:167px;">basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="width:171px;height:60px;">Defined Growth Supplement (dGS)</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">S0125</td>
			<td style="width:167px;">defined growth supplements for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Dispase powder</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">17105041</td>
			<td style="width:167px;">enzyme to dissociate the epidermis from dermis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Attachment Factor</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">S006100</td>
			<td style="width:167px;">gelatin-based coating material</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Coating Matrix</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">R011K</td>
			<td style="width:167px;">Collagen-based coating material</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="width:171px;height:80px;">TrypLE</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">12604-013</td>
			<td style="width:167px;">A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">100 &#956;m Cell Strainer Nylon mesh</td>
			<td style="width:177px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352360</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="width:171px;height:60px;">CCK-8 cell viability Kit</td>
			<td style="width:177px;">Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD</td>
			<td style="width:119px;">CK04-11</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:119px;">555268</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Corded Hand-Held UV Lamps</td>
			<td style="width:177px;">Spectronics, Westbury, NY</td>
			<td style="width:119px;">EB-280C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:171px;height:20px;">8-watt UV tubes</td>
			<td style="width:177px;">Spectronics, Westbury, NY</td>
			<td style="width:119px;">BLE-8T312</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Light Inverted Microscope for cell culture</td>
			<td style="width:177px;">ZEISS, Jena, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Axio Observer</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:171px;height:20px;">Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:177px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">BX41</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary mouse keratinocytes from neonatal and adult mouse skin

Keratinosit (KC), cildin en dış tabakası olan epidermisdeki baskın hücre türüdür. Epidermal KCler, UVB ışınlaması veya patojenler gibi çevresel hasarlara karşı bozulmamış bir cilt bariyeri oluşturarak cilt savunmasını sağlamada ve ayrıca bu hakaretlere karşı iltihaplı bir tepki başlatarak kritik bir rol oynamaktadır. Burada, yenidoğan fare derisinden ve erişkin fare kuyruğu derisinden KC&#39;leri izole etme yöntemlerini açıklıyoruz. Ayrıca, tanımlanmış büyüme takviyeleri (dGS) kullanarak, çoğaltılmış fetüs sığır serumu (cFBS) ile kültür koşullarını tarif ederiz. İşlevsel olarak, hem yenidoğan hem de erişkin KC&#39;lerin yüksek kalsiyumun indüklediği terminal farklılaşması, sıkı birleşim oluşumu ve tabakalaşmaya son derece tepkisel olduğunu göstermektedir. Ek olarak, kültürlenmiş yetişkin KC&#39;ler UVB ile tetiklenen hücre ölümüne duyarlıdır ve UVB ışınlaması üzerine büyük miktarda TNF salabilirler. Birlikte, burada açıklanan yöntemler araştırmacılar için in vitro model kurulumu için yararlı olacaktırYenidoğan fare ve / veya yetişkin fare epidermal biyoloji incelemek için.

Yenidoğanın ve erişkin KC&#39;lerin yüksek kalsiyum indükte terminal farklılaşması. KCs kaplanmıştır ve 0.06 mM CaCl2 muhafaza primer fare, epidermal bir tek tabaka olarak büyüdü ve tek tek hücreler bir kaldırım taşı görünümünü gösteren, farklı hücre içi alana sahip çok kenarlı bir şekle sahiptir zaman konfluent (Şekil 1A ve Şekil 2A). CaCl2 0.2 mm kaldırma...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin at JoVE.com

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Epidermal keratinositler fonksiyonel bir cilt bariyeri oluştururlar ve dış çevresel hakaretlere karşı ana savunmanın ön saflarında yer alırlar. Burada, neonatal ve erişkin fare derisinden epidermal keratinositlerin izolasyonu ve birincil kültürü için yöntemleri ve keratinositlerden gelen terminal farklılaşmayı ve UVB tetiklemeli enflamatuar yanıtın indüksiyonunu tarif ediyoruz.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

isolation-culture-primary-mouse-keratinocytes-from-neonatal-adult

Research

JoVE Journal

Biology

30.5K Görüntüleme.  UC San Diego.  Epidermal keratinositler fonksiyonel bir cilt bariyeri oluştururlar ve dış çevresel hakaretlere karşı ana savunmanın ön saflarında yer alırlar. Burada, neonatal ve erişkin fare derisinden epidermal keratinositlerin izolasyonu ve birincil kültürü için yöntemleri ve keratinositlerden gelen terminal farklılaşmayı ve UVB tetiklemeli enflamatuar yanıtın indüksiyonunu tarif ediyoruz. 

Video: Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Biyoloji

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

İzolasyon ve Kültür Yenidoğan Fare kardiyomiyositlerin

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İletimi

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...