Deri, keratinositler, fibroblastlar ve sinir Schwann hücreleri dahil olmak üzere çoklu hücre tipleri içerir. Bu protokol, in vitro deneyler için bu hücre tiplerinin her birinin izolasyonuna izin verir. Tek bir donörden bireysel birincil hücre kültürlerinin izolasyonu ve kurulması, genetik varyasyonun etkilerini hafifletirken, sağlam karşılaştırmalara ve ortak kültür deneylerine izin verir.
Bu protokolle, bireysel hücrelerin ve etkileşimlerinin analizi, Schwann hücrelerinin cilt homeostazı ve patofizyolojisindeki rolünün analizine izin verir. Bu farklı hücre popülasyonları, Schwann hücrelerini, fibroblastları veya keratinositleri ayrı ayrı veya normal cilt fizyolojisinde, yara iyileşmesinde veya cilt hastalıklı durumlarında kombinasyon halinde incelemek için kullanılabilir. Laboratuvarımda doktora sonrası bir akademisyen olan Jagadeeshaprasad M G, prosedürü göstermemde bana yardımcı olacak.
Standart bakım prosedürlerini izleyerek yenidoğan sünnet derisini aldıktan sonra, eksize edilen sünnet derisini sekiz ila 10 mililitre buz gibi soğuk DMEM bazal ortam içeren bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin ve sünnet derisini derhal hücre izolasyonu için hücre kültürü laboratuvarına taşıyın. Sünnet derisini, antibiyotik ve antimikotik içeren 20 ila 25 mililitre Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu veya DPBS ile iki kez durulayın. Daha sonra yıkanmış cildi 10 santimetrelik bir doku kültürü kabında 25 ila 30 mililitre buz gibi soğuk DMEM bazal ortamına batırın.
15 dakika sonra sünnet derisini dermis ve deri altı yağ dokusunu ortaya çıkarmak için bir neşter kullanarak dilimleyin. Subkutan yağ dokusunu çıkarmak ve atmak için forseps, neşter bıçağı ve makas kullanın. Daha sonra temiz sünnet derisini üç ila beş küçük parçaya bölün ve cilt parçalarını steril bir konik tüp içinde 16 ila 20 mililitre Dispace bir DMEM ortamında inkübe edin.
Dispace ile inkübasyonun ilk 30 dakikası boyunca, konik tüpteki cilt parçalarını ara sıra ters çevirerek karıştırın. Daha sonra konik tüpü 16 ila 18 saat boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin. Ertesi gün cilt parçalarını çıkarın ve kuru steril bir kültür kabına yerleştirin ve dış epidermis tabakasının kültür kabına dokunması için her bir cilt parçasını açın.
Dokunun kenarından başlayarak, iki set forseps kullanarak epidermisi dermisten uzaklaştırın. Ayrılmış epidermis parçalarını, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe etmek için 10 santimetrelik bir kültür kabında beş mililitre HBS'ye ekleyin. Daha sonra HBS çözeltisini 50 mililitrelik bir konik tüpte toplayın ve konik tüpe beş mililitre tripsin nötralizasyon tamponu veya T ve B ekleyin.
Tüpü bir kenara koyun. Kültür kabındaki epidermal parçalara, 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmek için üç mililitre Tripsin çözeltisi ekleyin. Kuluçkayı takiben, tripsin keratinositler çözeltisi bulanıklaşana kadar epidermal parçaları forseps ile nazikçe çalkalayın.
Daha sonra tripsin keratinosit çözeltisini HBS T ve B tüpüne ekleyin. Sindirilmemiş epidermal fragmanları tripsin EDTA çözeltisi ile çözdükten sonra, tripsin EDTA çözeltisi içeren HBS T ve B tüpüne iki mililitre FBS ekleyin ve ikisini dört santigrat derecede beş dakika boyunca yaklaşık 870 kez G santrifüj edin. Daha sonra süpernatantı aspire edin ve hücre peletini üç mililitre keratinosit tam büyüme ortamında yeniden askıya alın, ardından hücre süspansiyonunun steril bir 100 mikrometre filtre ile steril bir 50 mililitrelik konik tüpe filtrelenmesi ile filtrelenmesi.
Hücre sayısı ve hücre canlılığı ölçüldükten sonra, kültür plakalarındaki hücreleri% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirmek üzere tohumlayın. İki gün sonra, yapışmamış hücreleri aspire edin ve keratinositler pasaj veya aşağı akış deneyleri için% 50 ila% 80 birleşime ulaşana kadar hücre kültürü ortamını her gün yenileyin. Beş mililitre DPBS kullanarak poli-l-lizin veya PLL ile ön kat T25 şişeleri ve önceden kaplanmış şişeleri üç saat boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin.
Daha sonra PLL kaplama matrisini DPBS ile iki kez yıkayın. Dermisin izole edilmiş parçalarını beş mililitre DMEM bazal ortamı ile yıkadıktan sonra, dermisi makasla küçük parçalara ayırın. Kıyılmış dermisi iki buçuk saat boyunca 37 santigrat derecede beş mililitre kollajenaz ile sindirin, dermis tamamen ayrışana kadar her 30 dakikada bir pipet ucu kullanarak nazik bir titrasyon yapın.
Sindirildikten sonra, hücre süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir hücre süzgeci ile filtreleyin, ardından kollajenazın enzimatik aktivitesini durdurmak için filtrelenmiş hücre süspansiyonunun beş mililitre tam DMEM ortamı ile seyreltilmesi ile seyreltilir. Daha sonra, hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 870 kez G'de santrifüj edin ve hücreleri bölmek için hücre oy pusulasını iki mililitre DMEM tam ortamında yeniden askıya alın. Santrifikasyon işlemini tarif edildiği gibi tekrarladıktan sonra, Schwann hücrelerini veya fibroblastlarını izole etmek için hücre peletini kullanmak üzere süpernatantı aspire edin.
Schwan hücrelerini izole etmek için, hücre peletini beş mililitre taze DMEM tam ortamında yeniden askıya alın ve önceden kodlanmış T25 şişelerinde yeniden askıya alınmış hücrelerin beş mililitresini, mililitre başına üç hücreye 4.0 kat 10 yoğunlukta tohumlamadan önce hücre sayısını ve canlılığını ölçün. Şişeyi 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. 16 saat sonra, 10X büyütmede mikroskopi ile hücre yapışmasını onaylayın.
Ardından yapışmayan hücreleri çıkarın ve şişeyi beş mililitre DPBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra hücreleri beş mililitre 10 mikromolar sitozin arabinozid ile DMEM tam bir ortamda inkübe edin. 24 saat sonra, şişeyi daha önce gösterildiği gibi durulamadan önce sitozin arabinozid içeren ortamı aspire edin.
Kültür şişesini beş mililitre Schwann hücresi ile doldurun, 48 saat inkübe etmek için kültür ortamını tamamlayın, Schwann hücreleri% 80 akıcılığa ulaşana kadar ortamı her gün yenileyin. Fibroblastları izole etmek için, toplanan peleti beş mililitre fibroblast tam ortamında yeniden askıya alın. Schwann hücreleri için gösterildiği gibi kodlanmamış T25 kültür şişelerindeki hücreleri 24 saat boyunca kültürlemek.
Yapışmayan hücreleri aspire ettikten ve şişeyi yıkadıktan sonra, hücreleri 37 santigrat derecede tam orta ve 48 saat boyunca% 5 karbondioksitte beş mililitre taze fibroblast ile inkübe edin. İzole edilen primer hücreler ilgili hücre kültürü ortamında kültürlendiğinden, primer keratinositler yedinci güne kadar% 85 akıcılığa ulaştı ve parke taşı şeklinde karakteristik hücre morfolojisi sergiledi. Schwann hücreleri beşinci güne kadar% 95 birleşmeye ulaştı ve bipolar veya tripolar şeklinde ortaya çıktı.
Fibroblast kültürleri dördüncü güne kadar% 95 birleşmeye ulaştı ve çoğu hücre bir iğ şekli morfolojisi sergiledi. İmmünofloresan boyama, hücre kültürlerinde hücre tipine özgü protein ekspresyonunu doğruladı. Keratinositler K10 ve K14 proteini için pozitifti.
Keratin immünofloresan ve DAPI nükleer boyamasının birleştirilmiş görüntüleri, hücre kültürlerinin% 97.8 saflığını göstermiştir. Benzer şekilde, Schwann hücreleri S100 ve P75 NTR için pozitifti ve kültürde% 95.2'lik bir saflığa sahipti. Fibroblastlar pozitif olarak vimentin eksprese etti, ancak bir miyofibroblast belirteci olan alfa düz kas Aktin'i eksprese etmedi.
Kültürün saflığı yaklaşık% 97.2 idiShanse'nin kanıtlarını arttırmak için, önceden kaplanmış poli-l-lizin çanak kullanılabilir. Fibröz kontaminasyonu daha da azaltmak için, hücreler kısa bir süre eklendikten sonra sitozin arabinozid ve antimikotik ajan eklendi. Bu, shwann hücreleri, keratinositler ve fibroblastlar gibi üç birincil hücreyi tek bir insan sünnet derisinden oluşturmak için basit, ucuz bir deneysel prosedürdür.
Bu protokol, hücre hücre iletişimini veya hücre tipleri arasındaki çapraz konuşmayı içeren in vitro deneyler için idealdir.
