1. Bulaşık Hazırlık <ol><li> Kesit kültürü için kullanılan Yemekleri (WillCo yemekleri) (temel olarak bir coverslip ile) altı cam vardır. Bu cam taban temiz tutmak için 6 cm doku kültürü çanak lens dokusu yerleştirilir. </li><li> Deney bir gün önce, poli-L-lizin katı cam alt izin verecek şekilde, oda sıcaklığında 5dk süreyle cam dipli çanak ve inkübe 2 ml% 0.1 poli-L-lizin solüsyonu ilave edin. </li><li> Poli-L-lizin çözeltisi kaldırmak ve deiyonize su içinde üç kez durulama ve sonra bir defa% 70 etanol içinde. </li><li> Gece kurumaya bırakın. Yemekleri de yavaşça 30-45 saniye süreyle düşük güçte mikrodalga fırında ısıtılarak kurutulabilir. </li></ol> 2. Embriyo Elektroporasyon <ol><li> 37 yumurta inkübe ° C Hamburger-Hamilton (HH) evre 10 (~ 36 saat) (veya diğer istenen sahne) için. </li><li> Başlayan cam iğneler (biz bir Flaming / Kahverengi modeli P87 microcapillary çektirmesi kullanın) hazırlamak ve needl den ucu koptu öncee bir mikroskop altında ince bir pens kullanarak. Bu DNA solüsyonu enjeksiyonu engelleyecek kadar dar olmamasına rağmen iğnenin ucunu embriyo delmek için yeterli keskinlikte olmalıdır. </li><li> Embriyonun iki tarafında Pencere yumurta ve yer elektrotlar (5mm) </li><li> Nöral tüp içine - DNA (hızlı yeşil küçük bir miktar ile boyanmaktadır deiyonize suda 0.5 mg / ml ~ 0.025) enjekte edilir. </li><li> Mevcut uygulama - darbeler arasında 950 ms 12-17 V üç kez, 50ms darbe uzunluğu. </li><li> Biz tek tek hücrelerin takip edebilirsiniz böylece mozaik ifade elde etmek için DNA düşük konsantrasyonlarda ve düşük elektroporasyon gerilim kullanın. </li><li> Cellotape ile yumurta kabuğu pencere Kapak ve mühürlü olduğundan emin olun. </li><li> Embriyoların 37 3-4 saat veya gece boyunca kurtarmak için izin ° C </li></ol> 3. Kollajen ve Dilim Kültür Orta Hazırlık <ol><li> Dilimleme önce yaklaşık bir saat kollajen karışımı ve dilim kültür ortamı hazırlayın. </li><li> 300 ul tYPE 1 kollajen 100 ul% 0.1 asetik asit solüsyonu ve 100 ul 5 x L15, orta ekleyin. Her eklemeden sonra iyice vorteksleyin. Çözüm sarı açmalısınız. </li><li> Şimdi 15-20 ul% 7.5 sodyum bikarbonat ve iyice vorteks ekleyin. Çözeltisi hafif pembe olmalıdır, ve bunun için gerekli sodyum bikarbonat hacmi farklı olabilir. Buz üzerinde tutun ve her zaman taze oluşturuyor. </li><li> 10 ml neurobasal ortam, bir 1 x nihai konsantrasyona ve 10 ul gentamisin çözeltisine, B-27 takviyesi ve Glutamax eklemek. </li><li> 37 ° C inkübatör koyun orta% 5 CO 2 ile tampon. Bu CO2 ile dengelenmesi için izin vermek için kabın üst serbest bırakır. </li></ol> 4. Dilim Kültür <ol><li> Yumurtadan embriyo çıkarın ve L15 ortamda yıkayın. </li><li> Bir altta sylgard tabakası ve gerildi böylece çevreleyen ekstra embriyonik zarlar yoluyla onları iğnelemek bir doku kültür kaplarına koyun. </li><li> Bir mikrofon kullanarakroknife, ilgi bölgesinden geçen dilim embriyonu olarak düz mümkün. Spinal kord için, kalın dilimler 1-2 Somitlerin arasında olmalıdır. Bunları kaybetmemeniz için diğer embriyolar dilim ise embriyo bağlı dilimleri bırakın. </li><li> Ucu ~ 1 mm kesmek ve bir p2 veya p10 bu takarak bir 200 ul mikropipet ucu hazırlayın. Bu ucu cam alt çanak omurilik dilimleri aktarmak için kullanılacaktır. A 10 ul ucu dilim almak için yeterince geniş değil. </li><li> Coat daha önceden hazırlanmış 1 ul kollajen karışımı pipetleme kollajen ile ucunun içinde. L15 orta ile yıkayın daha sonra 1-2 dakika bekletin ve. Bu ucu içine yapışmasını doku önleyecektir. </li><li> Bir microknife kullanarak embriyodan dilim ayırın ve 200 ul ucu ile donatılmış ve 1 ul ayarlanmış bir p2 veya p10 kullanarak çanak kaldırmak. Mümkün olduğu kadar az aracı olarak almaya çalışın. </li><li> Poli-L-Lizin kaplamalı çanak üzerindeki bu vorteks kollajen karışımı ve damla 5-8 ul. </li><li> Immedialarına ince forseps bir çift ile yerine kollajen ve pozisyona embriyo dilim koydu. Dilimler yansıması ile yan coverslip ile aynı hizada olacak şekilde yerleştirilmelidir. Doku coverslip üzerindeki poli-l-lizin kaplama uymalıdır. </li><li> Eğer coverslip birkaç dilim bulana kadar tekrarlayın. Biz genellikle bir çanak üzerine 6-9 dilim yerleştirebilirsiniz. </li><li> Tüm dilimler yerinde sonra, çanak kapağı ve kollajen 20 dakika ayarlamanızı sağlar. Erken yerleştirilen kollajen bazıları şimdiden kurumaya başlamış olabilir. Bu bu kapsayan önce L15 için küçük bir miktar eklemek önlemek için. </li><li> Bir kez, dikkatle ayarlanmış en az bir saat için 37 ° C&#39;de% 5 CO 2 dengelenmiş oldu 2ml dilim kültür ortamı ekleyin. Bakım coverslip gelen kollajen çıkarmak değil alınmalıdır. </li><li> 37 ° /% 5 CO2 inkübatör Yeri ve dilimleri görüntüleme önce en az 3 saat kurtarmak için izin verir. Bir kutu zekâ hiç nem, yer çanak varsabir köşede nemli kağıt mendil ha biraz. </li></ol> 5.. Görüntüleme Embriyo Dilimleri <ol><li> Biz görüntü dilimleri bir Weatherstation kazanı ile donatılmış bir DeltaVision Çekirdek geniş alan mikroskobu kullanın. Odacık sürekli% 5 CO2 /% 95 hava azından mikroskop aşamasında sürdürmek için bir CO2 perfüzyon aparatı ile 37 ° C&#39;de muhafaza edilir. </li><li> Görüntüleme normalde 40 x / 1.30 NA immersiyon yağı lens kullanarak ve görüntüleri CCD kamera soğutmalı bir CoolSnap HQ2 ile yakalanan yapılmaktadır. </li><li> Z-bölümleri 45 mikron doku aracılığıyla her 1.5 mikron yakalanır. Pozlama süresi mümkün olduğu kadar düşük tutulmalıdır. Biz normalde her Z-bölüm için 5-50 ms için maruz. Görüntüler her 7 dakikada yakalanır ve en fazla 9 dilim fonksiyonu Ziyaret DeltaVision sistemin hassas noktası kullanarak ziyaret edilebilir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Bir omurilik progenitör hücre örneği time-lapse sırasıŞek. 2a ve tekabül eden film 1. Görüntüleme iki gün yaşlı (HH aşamada 12) embriyo bir omurilik dilim başlandı. Bu hücre GFP-αTubulin ifade eden bir yapı ile transfekte edildi. Bu erken aşamada, nöral progenitör hücrelerin ağırlıklı hücreleri iki tane daha bisiklet progenitör hücreler üretmek için bölmek sırasında progenitör-progenitör modu bölünmeler uğrarlar. Şekil. 2b ve tekabül eden film 2 hücre membran işaretleme, GFP-GPI (GPI GFP demirli) ile transfekte edilmiş bir hücre gösterir. Bu hücre bazal süreci ikiye böler ve eşit kızı hücreleri tarafından devralınan sırasında bir bölümü uğrar. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig1.jpg" /> Şekil 1.. Time-lapse görüntüleme için Dilim kültür protokolü. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig2.jpg" /> Şekil 2. Hücre bNormal omurilik gelişimi sırasında ehavior. Movie 1 (a) Seçilmiş kareleri. GFP-tubulin ifade Hücre bir kez daha (24 saat 23 dk ve 25 saat 54 dakika) bölen iki kızı üreten hücreleri, apikal yüzeye (2 saat 20 dakika) dik bir bölünme uçağı ile böler. (B) Film 2 Seçili karelerin. GFP-GPI ile transfekte Hücre bazal süreci bölünmüş (beyaz ok) ve eşit kızı hücreleri tarafından devralınan sırasında hücre bölünmesi uğrar. Movie 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">filmi görmek için buraya tıklayın</a> . Film 2. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">filmi görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Ulloa, F., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogens+and+the+Control+of+Cell+Proliferation+and+Patterning+in+the+Spinal+Cord.">Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord.</a> Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).</li><li>Briscoe, J., Novitch, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+pathways+linking+progenitor+patterning,+cell+fates+and+neurogenesis+in+the+ventral+neural+tube.">Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).</li><li>Shiau, C., Das, R., Storey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+assay+for+high+cellular+resolution+time-lapse+imaging+of+sensory+placode+formation+and+morphogenesis.">An effective assay for high cellular resolution time-lapse imaging of sensory placode formation and morphogenesis.</a> BMC Neuroscience. 12, 37 (2011).</li><li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+spindle+orientation+distinguishes+stem+cell+and+terminal+modes+of+neuron+production+in+the+early+spinal+cord.">Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord.</a> Development. 134, 1943-1954 (2007).</li><li>Vilas-Boas, F., Fior, R., Swedlow, J. R., Storey, K. G., Henrique, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+reporter+of+notch+signalling+indicates+regulated+and+random+notch+activation+during+Vertebrate+neurogenesis.">A novel reporter of notch signalling indicates regulated and random notch activation during Vertebrate neurogenesis.</a> BMC Biology. 9, 58 (2011).</li><li>Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Bios Scientific Publishers. , (1998).</li><li>Conchello, J. -. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+microscopy.">Optical sectioning microscopy.</a> Nat. Meth. 2, 920-931 (2005).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental Limits in Confocal Microscopy Handbook Of Biological Confocal. , (2006).</li><li>Swedlow, J. R., Hu, K., Andrews, P. D., Roos, D. S., Murray, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+tubulin+content+in+Toxoplasma+gondii:+A+comparison+of+laser-scanning+confocal+and+wide-field+fluorescence+microscopy.">Measuring tubulin content in Toxoplasma gondii: A comparison of laser-scanning confocal and wide-field fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 2014-2019 (2002).</li><li>Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+performance+in+three-dimensional+fluorescence+microscopy.">Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 228, 390-405 (2007).</li><li>Biggs, D. S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Deconvolution+Microscopy.">3D Deconvolution Microscopy.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2001).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging:+Opportunities,+limitations,+and+challenges.">Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz tavuk embriyonik kesit kültürü hücre davranışlarını izlemek için buraya yeni bir time-lapse görüntüleme testi sunuyoruz. 24-48 saat arasında zaman kareleri yakalamak daha kolay olmasına rağmen Bu testte, 70 saate kadar canlı doku için yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar. Yüksek NA petrol objektif ve zaman noktaları arasında nispeten kısa aralıklarla kullanımı de bize genellikle hızlı gelişir hücre davranışlarını izlemek için izin olarak, yüksek çözünürlükte görüntü toplama sağlar, ve kolayca konfokal kullanarak geleneksel time-lapse görüntüleme sırasında atlanabilir mikroskopi. Bu testin önemli avantajı uzun süreler boyunca görüntü hücrelere yeteneğidir. 7 mikroskobu konfokal lazer yerine geniş alan 6 kullanımı bunun için önemlidir. Konfokal mikroskop geleneksel optik kesitler alıp doğrudan odak bilgi dışarı ortadan kaldırmak için yeteneği de dahil, geniş alan mikroskopisi karşı çeşitli avantajlar sundu <sup&gt; 7, ancak bir iğne deliği kullanımını önemli bir bilgi miktarı hariç, ve daha uzun maruz kalma süresi gerektiren, dedektör 8 ışık kaybına yol açmaktadır. Geniş alan mikroskopisi, diğer taraftan tam saha aydınlatma kullanan ve amacı ile, tüm geçen ışık dedektörü gönderilir. Bir yüksek kuantum verimliliği ile birleşince birleştiğinde cihaz (CCD) kamerası çok hızlı pozlama süreleri ile konfokal mikroskopi 9, göre gürültü oranı yüksek bir sinyal ile görüntüleme sağlar soğutulur. Bizim uygulama, biz uzun süre, kayıt 3D yığınları ve sonuçta küçük yakın kırınım sınırlı yapıları çözmek için görüntü gerekir. Konfokal mikroskopi hiç dedektör ulaşmasını out-of-focus ışığı engeller ve böylece önemli ölçüde kalın, yoğun-etiketli örnekleri 7, 8 arka plan azaltmakla birlikte, sadece çok daha fazla ışık girişi ile kullanılabilir bir sinyal-gürültü oranı elde geniş alan mikroskopisi 10. Çok ışığa duyarlı sparsel içinBizim electroporated omurilik dilimleri gibi y-etiketli örnekleri, bu nedenle, geniş alan mikroskopisi konfokal mikroskopi daha iyi yapar. Dekonvolüsyonun tarafından görüntü restorasyonu ile birlikte, hangi odak bilgi dışarı çıkarır ve geliştirir kontrast, geniş alan, küçük, loş nesnelerin 11 tespiti için özellikle iyi o olduğunu. Her doku görüntüleme deney için uygun olmasa da, bu yaklaşım bizim canlı hücre görüntüleme uygulaması için çok etkili olmuştur. Floresan protein seçimi hücre yaşamını etkileyebilen önemli bir faktördür. Biz iyi sonuçları bir belirteç olarak yeşil floresan protein (GFP) 12 kullanımı yapıları elde görürüz. Şu anda etkin bir şekilde iki kanallı zaman ihmallerini GFP ile kombinasyon halinde de kullanılabilir kırmızı floresan proteinleri bir dizi değerlendirilmesi bulunmaktadır. 13 kullanılabilir Bu tür proteinleri bir dizi vardır. Birçok protein bir floresan protein füzyon olarak stabil olmasına rağmen, Bazı proteinler düşük hücre canlılığı ile sonuçlanan, füzyon ile kararsız kılınabilir. Bu gibi durumlarda, dahili bir ribozom giriş sitesi (IRES) içeren yapıları kullanımı flüoresan protein ilgili proteini ayırmak için yararlıdır. Zaman görüntüleme spinal kord dilimleri, bakım floresan ışığına maruz kalma en aza indirmek için alınması gerekir. Mikroskop mercekleri dilimleri bulun ve pozisyona geçen ışık (aydınlık) ile kullanılabilir olmalıdır. Floresan resimler her zaman az pozlama süreleri kullanarak mikroskop yazılımı kullanılarak elde edilmelidir. Bunlar, 5-50 ms aralığında tutulması ve nötr yoğunluğu filtrelerin kullanımının deneyler edilmelidir. Uzun pozlama süreleri başlangıçta daha net görüntüler üretmek olsa da, floresan ışıkta fototoksik etkilerini hücre ölümüne yol açabilir. Bu bölgede sırasında zarar görmüş olabilen doku içerir coverslip en yakın olan doku ilk 5-10 mikron görüntülenmiştir edilmemelidirdilimleme. Burada sunulan örnekler HH aşaması 10 ve daha sonra fazla görüntülü 6-7 saat electroporated embriyo olmakla birlikte, bu yöntem aşaması 18 HH embriyosu için kullanılabilmektedir. Daha sonraki aşamalarda, spinal kord doku çok daha büyük olduğu ve bu yüzden, elle dilim zordur. Bu durumlarda, düşük erime noktası agaroz içinde embriyo yerleştirilmesi ve bir vibratome ile kesit daha iyi sonuçlar verebilir. Biz gelişmekte olan omurilik görüntüleme hücreleri için bir yöntem olarak bu testte sunmak olsa da, bu yaklaşım aynı zamanda duyusal placodes 3 dahil olmak üzere görüntü diğer embriyonik dokular için modifiye edilmiştir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> WillCo Bulaşık </td><td> WillCo Wells </td><td> GWst-3522 </td><td></td></tr><tr><td> poli-L-Lizin </td><td> Sigma </td><td> P8970 </td><td> Tris% 0.1 </td></tr><tr><td> Borosilikat cam kılcal </td><td> Harvard Aletleri </td><td> GC100-10 </td><td> 1.0mm dış çaplı, 0.58mm iç çapı </td></tr><tr><td> Elektrotlar (Genetrodes, ovo içinde, L-şekilli </td><td> BTX </td><td> 10-001850-01 </td><td> 5mm altın kaplama </td></tr><tr><td> ECM 830 kare dalga üreteci </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td> ovo electroopration içinde için </td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Sigma </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> Ben sıçan kollajen yazın </td><td> Sigma </td><td> C3857 </td><td></td></tr><tr><td> L-15 orta (toz) </td><td> Sigma </td><td></td><td> 2.76 g / L damıtılmış su içinde 5x çözüm </td></tr><tr><td> Sodyum bikarbonat </td><td> Sigma </td><td> S8761 </td><td> % 7.5 çözümü </td></tr><tr><td> Neurobasal orta </td><td> Invitrogen </td><td> 12348-017 </td><td> fenol kırmızısı olmadan </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> A1286001 </td><td> 100x çözüm </td></tr><tr><td> B-27 takviyesi </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15710049 </td><td> 10 mg / ml </td></tr><tr><td> L15 orta (sıvı 1x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Microknife </td><td> Altomed </td><td> A10102 </td&gt; <td> 15 derecelik eğim </td></tr><tr><td> Paslanmaz çelik başsız pimler </td><td> Watkins ve Doncaster </td><td> E6871 </td><td> A1 boyutu </td></tr><tr><td> Sylgard 184 elastomer </td><td> VWR </td><td> 634165S </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision Çekirdek mikroskop sistemi </td><td> Uygulamalı Hassas </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coolsnap HQ2 CCD kamera </td><td> Fotometri </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

high-resolution live imaging of cell behavior in the developing neuroepithelium

Embriyonik spinal kord merkezi sinir sistemi (MSS) ve nöronal gliyal hücreleri büyük bir yüzdesi yol sinir hücrelerini progenitör bisiklet oluşur. Kadar moleküler mekanizmaları desen spinal kord hakkında bilinen ve nöronal farklılaşma 1, 2 ortaya çıkarmak olmasına rağmen, bu hücre davranış seviyesinde bu ilk etkinlik derin bir anlayış yoksundur. Onlar nörogenez geçerken, gerçek zamanlı olarak nöral progenitörlerin davranışlarını incelemek böylece önemlidir. Erken embriyonik doku geçmişte, gerçek zamanlı görüntü hücre / doku kültüründe canlılığı gibi floresan görüntüleme fototoksik etkileri ile sınırlı kalmıştır. Burada yeni bir ex-vivo kesit kültürü protokolü ve geniş alan floresan mikroskobu (Şekil 1) kullanarak, uzun süreler için görüntüleme gibi doku için yeni bir test sunuyoruz. Bu yaklaşım civciv embriyonik s uzun vadeli time-lapse izleme ulaşıryüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip Pinal kablosu progenitör hücreler. Bu testte geni faaliyeti için hücresel ve alt-hücresel davranışları, yeni bir gelişme ve çok hassas Muhabirlerin gözlem ek görüntü embriyonik dokular 3, 4, bir dizi ile değiştirilebilir (örneğin, Çentik sinyalleşme 5) Bu testte yapar sinyalizasyon nasıl anlamak için güçlü bir araç embriyonik gelişim sırasında hücre davranışı düzenler.

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium at JoVE.com

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Gerçek zamanlı görüntüleme embriyonik doku uzun süre boyunca meydan okuyor. Burada yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip uzun süre civciv omurilik hücresel ve alt hücresel değişikliklerin izlenmesi için bir test sunuyoruz. Bu teknik, sinir sistemi ve geliştirme embriyo diğer bölgeleri için adapte edilebilir.

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

high-resolution-live-imaging-cell-behavior-developing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.2K Görüntüleme.  University of Dundee, Dundee, UK. Gerçek zamanlı görüntüleme embriyonik doku uzun süre boyunca meydan okuyor. Burada yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip uzun süre civciv omurilik hücresel ve alt hücresel değişikliklerin izlenmesi için bir test sunuyoruz. Bu teknik, sinir sistemi ve geliştirme embriyo diğer bölgeleri için adapte edilebilir.

Video: High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Nörobilim

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

İnsan orta beyin için yüksek çözünürlüklü Fonksiyonel Manyetik Rezonans Görüntüleme Yöntemleri

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Yüksek çözünürlük<em&gt; İn Vivo</em&gt; 3T Manyetik Rezonans Görüntüleme kullanma İnsan hipokampal alanlar için Manuel Segmentasyon Protokolü

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Boyuna için bir Spinal Odası implantasyon için bir Prosedürü<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Omurilik Görüntüleme

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Nikotin Kaynaklı Kalsiyum Sinyali ve ventral Hipokampal Aksonlar boyunca Nörotransmitter Release Canlı Görüntüleme

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

İnsan Subcortex yüksek çözünürlüklü yapısal Manyetik Rezonans Görüntüleme<I&gt; İn Vivo</I&gt; Ve Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

Koku kılavuzluğunda Davranış Yüksek çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Drosophila melanogaster</emKullanma&gt;<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigma

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Retina Şerit Sinapslar at Membran Reseptör Yüksek Çözünürlüklü Sayısal immunogold Analizi

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...