Yazarlar Véronique de Berardinis verimli tartışma ve Alain Perret, Christine Pellé ve Peggy Sirvain teknik destek için teşekkür ederiz.

1. enzim hazırlık
<ol><li>Hızlı ve proteinler yukarıda açıklanan26arındırmak. Not: Aşağıdaki son konsantrasyonları ile rekombinant proteinler elde edilmiştir: αKAO Catenulispora acidiphila, UniProtKB kimliği üzerinden: C7QJ42 (KDO1), 1,35 mg/mL; C. pinensis, UniProtKB kimliği üzerinden αKAO: C7PLM6 (KDO2), 2.29 mg/mL; PIP-DCs dan S. rumirantium, UniProtKB kimliği: O50657 (LDCSrum), hücre ücretsiz ayıklamak toplam enzim, 12.44 mg/mL; PIP-DC C. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM7 (DCCpin), 2.62 mg/mL.</li>
</ol>2. çözümler hazırlanması
Not: Aşağıdaki çözümleri deiyonize suyla hazırlanır.
<ol><li>1 M HEPES tampon, pH 7.5 hazırlamak; ile 5 M NaOH ayarlayın. Not: pH ayarlama adım sırasında koruyucu eldiven, koruyucu giysiler, göz koruması ve yüz koruma (P280) giymek. (P305, P351, P338) gözlerle temas durumunda dikkatli birkaç dk. Kaldır kontakt lensler mümkünse için su ile durulayın. Durulama devam ve derhal bir zehir Merkezi veya doktor (P310) arayın. P kodu için önlem deyim başvurur (tehlike sınıf ve kategori; bakalım, örneğin, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/).</li>
	<li>100 mM L-lizin, 100 mM (5S) hazırlamak - hidroksi - L-lizin, 150 mM α-ketoglutaric asit, 100 mM sodyum askorbat, 10 mM amonyum iron(II) sülfat hekzahidrat (Mohr tuzu), 100 mM piridoksal 5-fosfat (PIP) ve 100 mM dithiothreitol (DTT).</li>
	<li>1 2.1 açıklanan alanındakiyle aynı güvenlik talimatlarını takip M, 2 M ve 6 M % 37 HCl çözümden (approximatively 12 M çözüm), hidroklorik asit (HCl) hazırlayın. Not: α-ketoglutaric asit, sodyum askorbat ve amonyum iron(II) sülfat hekzahidrat çözümleri kullanım gününde taze yapılmalıdır. Lizin çözüm oda sıcaklığında birkaç ay depolanabilir. PIP çözüm 4 ° C'de bir ay boyunca saklanabilir DTT çözüm-20 ° C'de bir ay boyunca saklanabilir</li>
</ol>3. analitik ölçek tepkiler
<ol><li>Decarboxylation reaksiyon (5R) için yöntem geliştirme - hidroksi - L-lizin<ol>
<li>1 M çözüm HEPES tampon pH 7.5 11 µL ekleyin (son konsantrasyonu 50 mM) 2 mL microtube için. Daha sonra 100 mm (5S) 22 µL ekleyin - hidroksi - L-lizin (son konsantrasyonu 10 mM), 2.2 µL 100 mm PIP (son konsantrasyonu 1 mM) ve 100 mm DTT 2.2 µL (son konsantrasyonu 1 mM). Not: LDCSrumile tepki söz konusu olduğunda, DTT eklenmesi gerekli değildir.</li>
		<li>Arıtılmış PLP-DC ekleyin (son konsantrasyonu 0.1 mg/mL). H2O için 220 µL son hacmi ile tamamlayın.</li>
		<li>3 h için 300 rpm'de açık havada açık bir kapak ile oda sıcaklığında tepki karışımı sallayın. Not: tepki karışımı açık bir kapak ile açık havada sallayarak tepki medya iyi oxygenation sağlar. Bu nedenle oksijen tepki medya kabarcık gerek yoktur.</li>
		<li>6. adımda açıklanan tepki izleme yordamına uygun olarak çözümlenmesi için tepki karışımı 10 µL toplamak. Örnekleri tercihen derivatized ve doğrudan örnekleme sonra analiz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PIP-DC tarafından katalize decarboxylation ile αKAO tarafından katalize bir prokollajen adım birleştirerek enzimatik cascade tepki için yöntem geliştirme<ol>
<li>1 m HEPES tampon pH 7.5 11 µL ekleyin (son konsantrasyonu 50 mM) 2 mL microtube için. Sonra α-ketoglutaric asit 150 mm 22 µL ekleyin (son konsantrasyonu 15 mM), 5.5 µL sodyum askorbat 100 mm (son konsantrasyonu 2.5 mM), 22 µL Mohr 10 mm tuz (son konsantrasyonu 1 mM) ve 100 mm L-lizin, 22 µL (son konsantrasyonu 10 mM).</li>
		<li>H2O son hacmi çok 3.2.3. adımda eklenecek enzim çözüm hacmi dikkate alarak 220 µL için ile tamamlayın.</li>
		<li>Hedeflenen regioselectivity göre gerekli saf αKAO enzim ekleyin: prokollajen L-lizin C-4 konumunu için pozisyon C-3 veya KDO2 için KDO1. Arıtılmış enzim son konsantrasyonu (0,05-0,5 mg/mL) approximatively 3 h tam bir dönüşüm etkinleştirmek kararlıydı.</li>
		<li>3 h için 300 rpm'de açık havada açık bir kapak ile oda sıcaklığında tepki karışımı sallayın.</li>
		<li>PIP 100 mm 2.2 µL eklemek (son konsantrasyonu ~ 1 mM) ve 2,2 µL DTT 100 mm (son konsantrasyonu ~ 1 mM). Not: LDCSrumile tepki söz konusu olduğunda, DTT eklenmesi gerekli değildir.</li>
		<li>18 h: LDC tam dönüşüm sağlayan bir konsantrasyon arıtılmış PLP-DC ekleyinSrum 0.1 mg/mL KDO1 ve DCCpin 0,5 mg/mL için yaklaşık bir son konsantrasyonu, art arda sıralı reaksiyon için yaklaşık bir son konsantrasyonu, Art arda sıralı tepki ile KDO2.</li>
		<li>18 h için 300 rpm'de açık havada açık bir kapak ile oda sıcaklığında tepki karışımı sallayın.</li>
		<li>Adım 3.1.4 olduğu gibi izleme yordamı çalıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PIP-DC tarafından katalize decarboxylation ile αKAOs tarafından katalize iki prokollajen adım birleştirerek enzimatik cascade tepki için yöntem geliştirme<ol>
<li>Adımları 3.2.1-3.2.2 çalıştırın.</li>
		<li>KDO1 bir son konsantrasyonu olarak 0,05 mg/mL ekleyin. 3 h için 300 rpm'de açık havada açık bir kapak ile oda sıcaklığında tepki karışımı sallayın.</li>
		<li>KDO2 0,5 mg/mL, ilk tepki birimi kullanan hesaplanan bir yaklaşık son konsantrasyonu ekleyin. 18 h için 300 rpm'de açık havada açık bir kapak ile oda sıcaklığında tepki karışımı sallayın.</li>
		<li>Adım 3.2.5 çalıştırın.</li>
		<li>Arıtılmış PLP-DC DCCpin 0,5 mg/mL, ilk tepki birimi kullanan hesaplanan bir yaklaşık son konsantrasyonu ekleyin. 18 h için 300 rpm'de açık havada açık bir kapak ile oda sıcaklığında tepki karışımı sallayın.</li>
		<li>Adım 3.1.4 olduğu gibi izleme yordamı çalıştırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. yarı partiye hazırlık One-pot Biocatalytic tepki
Not: Enzimatik reaksiyonları, L-lizin 0,1 mmol bir açık hava 250 mL cam Erlenmeyer şişeye 10 mL toplam hacmi için üzerinde yapılmaktadır.
<ol><li>Monohydroxylated türevlerinin sentezi<ol>
<li>1 M HEPES tampon, pH 7.5 0.5 mL ekleyin (son konsantrasyonu 50 mM) şişeye için. Sonra 1 mL 100 mM L-lizin ekleyin (son konsantrasyonu 10 mM), 1 mL 150 mM α-ketoglutaric asit (son konsantrasyonu 15 mM), 100 mM sodyum askorbat 0.25 mL (son konsantrasyonu 2.5 mM), ve 10 mM Mohr 1 mL tuz (son konsantrasyonu 1 mM).</li>
		<li>H2O için 10 mL, 4.1.3 adımda eklenecek enzim çözüm hacmi dikkate alarak son hacmi ile tamamlayın.</li>
		<li>Hedeflenen regioselectivity göre gerekli saf αKAO enzim ekleyin: 0,075 mg/mL pozisyonunda C-3 veya KDO2 0,5 mg/mL L-lizin C-4 konumunu için son bir konsantrasyon, prokollajen için son bir konsantrasyon, KDO1. Arıtılmış enzim son konsantrasyonu approximatively 3 h tam bir dönüşüm etkinleştirmek kararlıydı.</li>
		<li>Reaksiyon karışımı 300 rpm'de oda sıcaklığında uygun süresi için salla. Zaman reaksiyon izleme (adım 6 izleme Protokolü reaksiyon için ayrıntılı adımları çalıştırma) bir tamamlanmış prokollajen tepki gösterdiği, 4.1.5 adıma geçin. Tipik tepki süresi 3 h olduğunu.</li>
		<li>100 mm PLP 100 µL αKAO reaksiyon karışıma ekleyin (son konsantrasyonu ~ 1 mM). Daha sonra 100 mm DTT 100 µL ekleyin (son konsantrasyonu ~ 1 mM), LDCSrumkullanırken hariç.</li>
		<li>Arıtılmış PLP-DC ekleyin: 0,05 mg/mL KDO1 veya KDO2 ile DCCpin 0,5 mg/mL cascade reaksiyon için yaklaşık bir son konsantrasyonu, art arda sıralı reaksiyon için yaklaşık bir son konsantrasyonu, LDCSrum .</li>
		<li>Oda sıcaklığında, 300 rpm, 18 h için tepki karışımı sallayın ve doğrudan adım 4.3 ayrıntılı adımları devam.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dihydroxylated türevi sentezi<ol>
<li>1 M HEPES tampon, pH 7.5 0.5 mL ekleyin (son konsantrasyonu 50 mM), 100 mm L-lizin 1 mL (son konsantrasyonu 10 mM), 1 mL 150 mM α-ketoglutaric asit (son konsantrasyonu 15 mM), 100 mM sodyum askorbat 0.25 mL (son konsantrasyonu 2.5 mM) , ve 1 mL 10 mm Mohr tuzu (son konsantrasyonu 1 mM). H2O 10 ml 4.2.2 adımda eklenecek enzim çözüm hacmi dikkate alarak, son birim için ile tamamlayın.</li>
		<li>KDO1 0.075 mg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. 300 devirde uygun süre için oda sıcaklığında tepki karışımı sallayın.</li>
		<li>Zaman bir tamamlanmış prokollajen tepki gösterdiği tepki izleme (bkz. Adım 6 izleme Protokolü reaksiyon için) 4.2.5 adıma geçin. Tipik tepki süresi 3 h olduğunu.</li>
		<li>1 mL 150 mM α-ketoglutaric asit ekleyin (son konsantrasyonu 15 mM), 100 mM sodyum askorbat 0.25 mL (son konsantrasyonu 2.5 mM), ve 10 mM Mohr 1 mL tuz (son konsantrasyonu 1 mM).</li>
		<li>KDO2 0,5 mg/mL, ilk tepki birim kullanılarak hesaplanan son yaklaşık bir konsantrasyon ekleyin. 18 h için 300 rpm'de oda sıcaklığında tepki karışımı sallayın.</li>
		<li>Zaman bir tamamlanmış dihydroxylation tepki gösterdiği tepki izleme (bkz. Adım 6 izleme Protokolü reaksiyon için) 4.2.7 adıma geçin. Tipik tepki süresi 18 h olduğunu.</li>
		<li>DTT 100 mm 100 µL ekleyin (son konsantrasyonu ~ 1 mM), LDCSrumkullanırken hariç.</li>
		<li>Saf DCCpin 0,5 mg/mL, ilk tepki birimi kullanan hesaplanan bir yaklaşık son konsantrasyonu ekleyin.</li>
		<li>18 h için 300 rpm'de oda sıcaklığında tepki karışımı sallayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Şoklama<ol>
<li>Tepki karışımı bir buz banyosu 250 mL cam Erlenmeyer flask yerleştirerek serin.</li>
		<li>Approximatively 1 dk, 0.25 mL 6 M HCL soğutmalı tepki karışımı el ile hafifçe sallayarak üzerinde dikkatle ekleyin. 2.1. adımda anlatılan alanındakiyle aynı alan emniyet talimatlarını izleyin.</li>
		<li>Asidik karışım içine 50 mL konik alt santrifüj tüpü Pasteur pipet donatılmış bir cam bir ampul ile kullanarak transfer sonra 1,680 x g ve 4 ° C'de 15 dakika, santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant geri çekilin ve bir 250 mL yuvarlak alt şişeye bir kenara saklayın.</li>
		<li>Pelet içeren alt konik santrifüj tüpü 10 mL deiyonize su ekleyin. Girdap Pelet yeniden askıya almak için.</li>
		<li>Santrifüj 1,680 x g de, 4 ° C, 15 dakika.</li>
		<li>Süpernatant çekilme ve ilk süpernatant (Adım 4.3.4) içeren 250 mL yuvarlak alt şişe ekleyin.</li>
		<li>Girdap gibi sürekli el ile balonun daldırma içine sıvı nitrojen tarafından toplanan supernatants donma ve balonun hemen benchtop manifold dondurma çözdürme üzerinden malzeme önlemek için kurutma makinesi transfer.</li>
		<li>Freeze-drying işlemi (gece) tamamlandıktan sonra şişeye Donma kurutma makinesi kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ham enzimatik reaksiyon karışımı gelen Amino alkoller saflaştırılması
<ol><li>İyon değiştirme reçine<ol>
<li>Dondurulmuş ürün sulu 0.1 M HCL (approximatively 4 mL) minimum tutar dağıtılması katı parçacıkları artık çıplak gözle görünür hale gelene kadar.</li>
		<li>Atmosferik basınç 1 M HCl (4 sütun birimler) 0.1 takip eluting tarafından bir sülfonik asit fonksiyonel grubu ba * exchange reçine, 200-400 örgü, bir cam sütundaki (20 x 250 mm) durumu M HCl (4 sütun cilt; sütun Cilt 10 mL =).</li>
		<li>Örnek cam sütun 1.000 µL micropipette kullanarak duvarlarında reçine dikkatle üstündeki yükleyin. O zaman, ham ürün bulunan alt konik santrifüj tüpü durulama üç kez ile 1 mL 0.1 M HCl sulu çözüm yıkama ve sütun sonuçta elde edilen durulama birimlerini aynı şekilde yükleyin.</li>
		<li>Bir doğrusal olmayan ile elute gradyan: 4 sütun Cilt 0.1 m HCl, su, % 5 NH4OH, 4 sütun Cilt % 10 NH4OH, % 15 NH4Oh, % 20 NH4Oh 4 sütun Cilt 4 sütun Cilt 4 sütun Cilt 4 sütun cilt , 4 sütun cilt % 25 NH4OH ve son olarak 4 sütun cilt % 28 NH4OH.</li>
		<li>HPLC tarafından arıtma izlemek (bkz. Adım 6).</li>
		<li>Bileşik (NH4OH 20-%28) içeren kesirleri havuz ve adımları 4.3.8-4.3.9 içinde açıklandığı gibi şeytanibir. Not: İyon değiştirme sütun elüsyon nötralizasyon elüsyon su (approximatively 50 mL) 1 m HCL ile 50 mL eluting tarafından yenileme tarafından takip deiyonize su ile sonra yeniden kullanılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SPE<ol>
<li>H3PO4/water (20 µL/mL) approximatively 2 ml dondurularak bileşik solubilize.</li>
		<li>Bir su pompası bir emme manifoldu üzerinde yer bir karma mod katyon değişim SPE 6 mL-kartuş bağlı. 4 mL metanol manifold tarafından sağlanan düşük basınç altında aracılığıyla çizerek kartuşu durumu. Kartuş PO4/water (20 µL/mL) / H3ile 4 mL çizerek equilibrate.</li>
		<li>Örnek cam sütun duvarlarında reçine üstündeki 1.000 µL micropipette kullanarak kartuş üzerine yük ve üç kez ile H3PO4/water (20 µL/mL) yıkama başına 0.75 mL ürün içeren flakon durulayın. Elde edilen durulama birimin sütuna aynı şekilde yükleyin.</li>
		<li>Manifold 4 mL % 2 tarafından sağlanan düşük basınç altında eluting tarafından kartuş yıkama HCOOH su, daha sonra 4 mL su ile. Gradyan NH4OH su ile elute (%4 NH4OH başlayan her elüsyon için 4 mL: % 10, % %15 %15 20 ve % 28).</li>
		<li>Arıtma HPLC tarafından her kesir izleme Protokolü 6. adımda açıklanan tepki göre analiz ederek izlemek. Ultraviyole (UV) Kromatografik göre saf istenen türev içeren tüm kesirler tutmak ve 5.2.6 adıma devam edin.</li>
		<li>İstenen içeren kesirleri 100 mL yuvarlak alt şişesi içine bileşik kesirler ile su içeren tüpler durulama ve durulama birim 100 mL için eklemek havuzu yuvarlak alt şişesi.</li>
		<li>40 ° C'de bir termostat su banyosu su ısıtıcısı ile donatılmış ve bir vakum pompası 10 mbar ayarla bağlı döner Buharlaştırıcı kullanarak düşük basınç altında solvent kaldırın.</li>
		<li>Su en az bir hacim içinde katı solubilize ve çözüm ağırlığını 25 mL yuvarlak alt şişesi içine aktarın. Balonun en küçük birim su ile durulayın, durulama birim için 25 mL şişe ekleyin ve 5.2.9 adıma devam edin.</li>
		<li>Arıtılmış ürün tartmak ve verim hesaplayın.</li>
		<li>Katı parçacıkları artık çıplak gözle görünür hale gelene kadar 2 m HCL en küçük birim arıtılmış üründe dağıtılması ve adımları 4.3.8-4.3.9 içinde açıklandığı gibi şeytanibir. Not: Amino alkoller hassas bileşiklerdir ve onların hidroklorür tuzu tutulur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. tepki izleme ve ürün analizi
<ol><li>Derivatization yüzeylerde ve ürünleri HPLC analiz önce Not: Yüzeylerde ve ürün aromatik türevleri onların UV Kromatografik detectivity artırmak için derivatized gerekiyor. Biz 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) kullanılır. Her örnek hemen sonra derivatization HPLC enjekte ettiler.<ol>
<li>Enzimatik reaksiyon ve transfer 10 µL 1.5 mL microtube al. NaHCO3 sulu çözüm 0.25 m 10 µL, 100 µL etanol ve 2,5 mg/mL DNFB çözeltisi 30 µL etanol ekleyin.</li>
		<li>Microtube kapatın ve 1000 rpm'de 65 ° C'de 1 h için elde edilen çözüm sallamak. İle 10 µL gidermek 1 M HCL.</li>
		<li>4 mm çap steril olmayan şırınga filtre 1 mL radarı kullanarak bir 0,22 µm gözenek boyutu hidrofilik polivinilidin florid (PVDF) membran ile filtre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Derivatized amino asitler ayıran özelliğine sahip herhangi bir sistemi kullanarak dioxygenase reaksiyon izleme yapmayı. Bu iletişim kuralı UV algılama amino asit tarafından dinitrobenzene (DNB) chromophore grup27derivatized içerir.<ol>
<li>HPLC ile C18 trimetil silyl endcapping ters faz olan bir sütun (5 µm, 3 x 150 mm) uygun.</li>
		<li>C18 sütun (30:70) eluent B ile equilibrate (MeCN + %0,1 TFA) için eluent A (H2O + %0,1 TFA) 1 mL/dk ve 35 ° C (approximatively 20 sütun birimlere karşılık gelen) 15dk için akış hızında.</li>
		<li>Derivatized reaksiyon karışımı 10 µL enjekte (bkz. Adım 6.1) HPLC C18 sütuna. MeCN, % 0,1 TFA/H2O ve % 0.1 karışımı kullanın TFA eluent doğrusal gradyan ile olarak (oranı 30:70 için 70:30 9 min, sıcaklık 35 ° C, Debi 1 mL/dk).</li>
		<li>400 ayarla UV algılama özelliğini kullanmak nm Kromatografik sütun üzerinde eluted ürünleri analiz etmek. DNB-lizin genellikle yaklaşık 6.5 min, hydroxylated DNB-lizin yaklaşık 5.5 min, dihydroxylated DNB-lizin yaklaşık 4.2 min ve DNB-aminodiol civarında 5.3 min elutes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. NMR analizi arıtılmış Amino alkoller
<ol><li>D2O saf amino alkoller dağıtılması (700 µL) ve çözüm için bir Nükleer manyetik rezonans (NMR) tüp transfer.</li>
	<li>1H ve 13C NMR spectra göre uygun NMR tesis protokolleri28edinme.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nestl, B. M., Hammer, S. C., Nebel, B. A., Hauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Generation+of+Biocatalysts+for+Organic+Synthesis.">New Generation of Biocatalysts for Organic Synthesis.</a> Ang. Chem. Int. Ed. 53 (12), 3070-3095 (2014).</li><li>Reetz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalysis+in+Organic+Chemistry+and+Biotechnology:+Past,+Present,+and+Future.">Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).</li><li>Turner, N. J., O'Reilly, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+retrosynthesis.">Biocatalytic retrosynthesis.</a> Nat. Chem. Biol. 9 (5), 285-288 (2013).</li><li>Oroz-Guinea, I., Garcia-Junceda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+catalysed+tandem+reactions.">Enzyme catalysed tandem reactions.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 236-249 (2013).</li><li>Ricca, E., Brucher, B., Schrittwieser, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Enzymatic+Cascade+Reactions:+Overview+and+Perspectives.">Multi-Enzymatic Cascade Reactions: Overview and Perspectives.</a> Adv. Syn. Catal. 353 (13), 2239-2262 (2011).</li><li>Ager, D. J., Prakash, I., Schaad, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1,2-Amino+Alcohols+and+Their+Heterocyclic+Derivatives+as+Chiral+Auxiliaries+in+Asymmetric+Synthesis.">1,2-Amino Alcohols and Their Heterocyclic Derivatives as Chiral Auxiliaries in Asymmetric Synthesis.</a> Chem. Rev. 96 (2), 835-876 (1996).</li><li>Abiko, A., Masamune, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved,+convenient+procedure+for+reduction+of+amino+acids+to+aminoalcohols:+Use+of+NaBH4-H2SO4.">An improved, convenient procedure for reduction of amino acids to aminoalcohols: Use of NaBH4-H2SO4.</a> Tet. Lett. 33 (38), 5517-5518 (1992).</li><li>McKennon, M. J., Meyers, A. I., Drauz, K., Schwarm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+convenient+reduction+of+amino+acids+and+their+derivatives.">A convenient reduction of amino acids and their derivatives.</a> J. Org. Chem. 58 (13), 3568-3571 (1993).</li><li>Singh, P., Samanta, K., Das, S. K., Panda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+chirons:+a+tool+for+asymmetric+synthesis+of+heterocycles.">Amino acid chirons: a tool for asymmetric synthesis of heterocycles.</a> Org. Biomol. Chem. 12 (33), 6297-6339 (2014).</li><li>Colomer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminomethylhydroxylation+of+alkenes:+Exploitation+in+the+synthesis+of+scaffolds+for+small+molecule+libraries.">Aminomethylhydroxylation of alkenes: Exploitation in the synthesis of scaffolds for small molecule libraries.</a> Bioorg. Med. Chem. 23 (11), 2736-2740 (2015).</li><li>Steinreiber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Aromatic+1,2-Amino+Alcohols+Utilizing+a+Bienzymatic+Dynamic+Kinetic+Asymmetric+Transformation.">Synthesis of Aromatic 1,2-Amino Alcohols Utilizing a Bienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformation.</a> Adv. Syn. Catal. 349 (8-9), 1379-1386 (2007).</li><li>Steinreiber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+Thermodynamic+and+Kinetic+Limitations+of+Aldolase-Catalyzed+Reactions+by+Applying+Multienzymatic+Dynamic+Kinetic+Asymmetric+Transformations.">Overcoming Thermodynamic and Kinetic Limitations of Aldolase-Catalyzed Reactions by Applying Multienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformations.</a> Ang. Chem. Int. Ed. 46 (10), 1624-1626 (2007).</li><li>Kohls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Access+to+All+Four+Diastereomers+of+a+1,3-Amino+Alcohol+by+Combination+of+a+Keto+Reductase-+and+an+Amine+Transaminase-Catalysed+Reaction.">Selective Access to All Four Diastereomers of a 1,3-Amino Alcohol by Combination of a Keto Reductase- and an Amine Transaminase-Catalysed Reaction.</a> Adv. Syn. Catal. 357 (8), 1808-1814 (2015).</li><li>Sehl, T., Maugeri, Z., Rother, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+synthesis+strategies+towards+1,2-amino+alcohols+with+special+emphasis+on+phenylpropanolamines.">Multi-step synthesis strategies towards 1,2-amino alcohols with special emphasis on phenylpropanolamines.</a> J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 114, 65-71 (2015).</li><li>Martinez, S., Hausinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+Mechanisms+of+Fe(II)-+and+2-Oxoglutarate-dependent+Oxygenases.">Catalytic Mechanisms of Fe(II)- and 2-Oxoglutarate-dependent Oxygenases.</a> J. Biol. Chem. 290 (34), 20702-20711 (2015).</li><li>Baud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Mono&#8208;and+Dihydroxylated+Amino+Acids+with+New+&#945;&#8208;Ketoglutarate&#8208;Dependent+Dioxygenases:+Biocatalytic+Oxidation+of+C-H+Bonds.">Synthesis of Mono&#8208;and Dihydroxylated Amino Acids with New &#945;&#8208;Ketoglutarate&#8208;Dependent Dioxygenases: Biocatalytic Oxidation of C-H Bonds.</a> ChemCatChem. , (2014).</li><li>Suzuki, H., Kurihara, S., Kusano, T., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+4.">Ch. 4.</a> Polyamines. 4, 47-59 (2015).</li><li>Kind, S., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-based+production+of+the+platform+chemical+1,5-diaminopentane.">Bio-based production of the platform chemical 1,5-diaminopentane.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (5), 1287-1296 (2011).</li><li>Schneider, J., Wendisch, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotechnological+production+of+polyamines+by+bacteria:+recent+achievements+and+future+perspectives.">Biotechnological production of polyamines by bacteria: recent achievements and future perspectives.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1), 17-30 (2011).</li><li>Qian, Z. -. G., Xia, X. -. X., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+Escherichia+coli+for+the+production+of+cadaverine:+A+five+carbon+diamine.">Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: A five carbon diamine.</a> Biotechnol. Bioeng. 108 (1), 93-103 (2011).</li><li>Shin, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+microorganisms+for+the+production+of+L-arginine+and+its+derivatives.">Metabolic engineering of microorganisms for the production of L-arginine and its derivatives.</a> Microb. Cell. Fact. 13, (2014).</li><li>Nguyen, A., Schneider, J., Reddy, G., Wendisch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fermentative+Production+of+the+Diamine+Putrescine:+System+Metabolic+Engineering+of+Corynebacterium+Glutamicum.">Fermentative Production of the Diamine Putrescine: System Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum.</a> Metabolites. 5 (2), 211 (2015).</li><li>Kidron, H., Repo, S., Johnson, M. S., Salminen, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Classification+of+Amino+Acid+Decarboxylases+from+the+Alanine+Racemase+Structural+Family+by+Phylogenetic+Studies.">Functional Classification of Amino Acid Decarboxylases from the Alanine Racemase Structural Family by Phylogenetic Studies.</a> Mol. Biol. Evol. 24 (1), 79-89 (2007).</li><li>Takatsuka, Y., Onoda, M., Sugiyama, T., Muramoto, K., Tomita, T., Kamio, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Characteristics+of+Selenomonas+ruminantium+Lysine+Decarboxylase+Capable+of+Decarboxylating+Both+L-Lysine+and+L-Ornithine.">Novel Characteristics of Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase Capable of Decarboxylating Both L-Lysine and L-Ornithine.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (6), 1063-1069 (1999).</li><li>Takatsuka, Y., Tomita, T., Kamio, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+Amino+Acid+Residues+Conferring+Substrate+Specificity+upon+Selenomonas+ruminantium+Lysine+Decarboxylase.">Identification of the Amino Acid Residues Conferring Substrate Specificity upon Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).</li><li>Baud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Approaches+towards+the+Synthesis+of+Chiral+Amino+Alcohols+from+Lysine:+Cascade+Reactions+Combining+alpha-Keto+Acid+Oxygenase+Hydroxylation+with+Pyridoxal+Phosphate-+Dependent+Decarboxylation.">Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation.</a> Adv. Syn. Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).</li><li>Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+chiral+derivatizing+agents+in+the+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+amino+acid+enantiomers:+a+review.">Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).</li><li>. Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy">https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy</a> (2017)</li><li>Hibi, M., Ogawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+biotechnology+applications+of+aliphatic+amino+acid+hydroxylases+belonging+to+the+Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent+dioxygenase+superfamily.">Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (9), 3869-3876 (2014).</li><li>H&#252;ttel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Production+of+Chemical+Building+Blocks+in+Technical+Scale+with+&#945;-Ketoglutarate-Dependent+Dioxygenases.">Biocatalytic Production of Chemical Building Blocks in Technical Scale with &#945;-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases.</a> Chem. Ing. Tec. 85 (6), 809-817 (2013).</li><li>Kourist, R., Guterl, J. -. K., Miyamoto, K., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Decarboxylation-An+Emerging+Reaction+for+Chemicals+Production+from+Renewable+Resources.">Enzymatic Decarboxylation-An Emerging Reaction for Chemicals Production from Renewable Resources.</a> ChemCatChem. 6 (3), 689-701 (2014).</li><li>Lee, J., Michael, A. J., Martynowski, D., Goldsmith, E. J., Phillips, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+diversity+and+the+structural+basis+of+substrate+specificity+in+the+beta/alpha-barrel+fold+basic+amino+acid+decarboxylases.">Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases.</a> J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).</li><li>Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Evolution+of+Enzymes+for+Industrial+Biocatalysis.">Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis.</a> ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Kiral amino alkoller ve türevleri uygulamalardan kiral benzerleri ilaç tedavisi için Organik sentez için geniş bir aralığı vardır. Amino alkoller tarafından geleneksel Organik sentez üretmek için multistep sentez çoktur, ama her zaman sıkıcı koruma/deprotection adımları ile birlikte stereokimya16hassas bir denetim nedeniyle etkili olmayabilir. Koruma/deprotection adımlarla dağıtır ve genellikle stereoselective son derece biocatalytic bir yaklaşım iyi bir alternatif temsil e...

Yararları biocatalysis tarafından sunulan rağmen sentetik yolları veya toplam biocatalytic yolları biocatalytic adımları Tümleştirme çoğunlukla enzimatik Kinetik çözünürlükleri için sınırlı kalır. Bu yolları asimetrik kemoterapi enzimatik sentez bir ilk adım olarak yaygın olarak kullanılmış olan ama biocatalysis fonksiyonel grup interconversions yüksek stereoselectivity1,2,3 ile çok daha fazla olanak sunuyor . Biocatalytic reaksiyonlar benzer koşullarda yapılmaktadır Ayrıca, bu nedenle cascade reaksiyonlar bir one-pot moda4,5' te gerçekleştirmek için uygun olduğu.
Kiral amino alkoller çok yönlü kullanım için yardımcı ya da Organik sentez6iskele olarak moleküllerdir. Amino alkol yan sık Sekonder metabolitler ve ilaç aktif maddeleri (API) bulunur. Birincil β-amino alkoller kiral γ-amino alkoller için kolayca karşılık gelen α-amino asitler konvansiyonel kimyasal sentez, ancak access tarafından kullanılabilir veya ikincil amino alkoller genellikle sıkıcı sentetik yolları ile birlikte duyarlı gerektirir Denetim stereokimya7,8,9,10. Onun yüksek stereoselectivity nedeniyle biocatalysis bu kiral yapı taşları11,12,13,14için üstün bir sentetik yol sağlayabilir.
Daha önce diastereoselective enzimatik prokollajen demir (II) dioxygenases tarafından katalize tarafından sentez, mono - ve di-hidroksi-L-lysines rapor / α-ketoacid-bağımlı Siklooksijenaz aile (αKAO) (Resim 1)15. Özellikle, L-lizin başlayarak, KDO1 dioxygenase (3S) - hidroksi türev (1), (4R) süre - tromboksan türev (2) KDO2 dioxygenase ile reaksiyonu tarafından oluşturulur. Art arda gelen regiodivergent hydroxylations KDO1 ve KDO2 tarafından kurşun oluşumu (3R, 4R) için - dihidroksi - L-lizin optik saf formu (3). Ancak, karboksilik asit yan pozisyonda α-amino grubu etkinliği16için gerekli olduğu gibi bu enzimler sınırlı substrat dizi onların büyük kullanımı basit aminler, prokollajen başta kimyasal sentez içinde engellemektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig1.jpg"> Şekil 1: L-lizin Biocatalytic dönüştürülme. Dönüşüm (3S) içine - hidroksi - L-lizin KDO1 dioxygenase tarafından; katalize (1) (4R) - hidroksi - L-lizin KDO2 dioxygenase tarafından; katalize (2) ve (3R, 4R) - dihidroksi - L-lizin (3) art arda sıralı tepki gittikçe KDO1 ve KDO2 dioxygenases tarafından katalize. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Decarboxylation metabolizma17ortak bir tepkidir. Özellikle, amino asit DCs (EC 4.1.1) kofaktör-ücretsiz (pyruvoyl bağlıdır) ya da PIP-bağımlı enzim ve bakteriler ve daha yüksek organizmaların18,19 ilgili polyamines içine decarboxylation amino asitlerin katalizler , 20 , 21 , 22. de mono - ve dihidroksi bileşikler (şekil 3) 4-7, 10-11 hydroxylated cadaverine, L-lizin decarboxylation tarafından elde edilen diamin karşılık gelir. Cadaverine kimya sanayî için önemli bir yapı taşı, özellikle bu poliamid ve poliüretan polimerlerin bir bileşendir. Bu nedenle, biyo-esaslı üretimini bu diamin yenilenebilir kaynaklardan gelen petrol bazlı rota alternatif olarak dikkat çekti ve çeşitli mikroorganizmalar bu amaç için tasarlanmış. Bu metabolik yollar, lizin DC (LDC) anahtar enzimdir. LDC alanin racemase (AR) yapısal aile23için ait PLP-bağımlı bir enzimdir. PIP-bağımlı DCs (PIP-DCs) yüksek substrat özgü olduğu bilinmektedir. Ancak, bazı enzimler hafif karışıklık, örneğin LDC Selenomonas rumirantium (LDCSrum), düşük olarak L-Ornitin ve L-lizin amino asitler doğru aktif varlık yeteneği kendi benzer Kinetik sabitler için sahip olduğu Lisin ve ornithine decarboxylation24,25. Bu genişletilmiş substrat özgüllüğü Bu enzim, mono - ve di-hidroksi-L-lizin decarboxylation için iyi bir aday yapar. Buna ek olarak, DCs etkin lizin Hidroksil türevleri doğru bulmak için biz αKAO enzimler kodlama genler genomik bağlamında inceledi. Nitekim, prokaryotik genleri enzimler aynı biyosentetik yolu dahil kodlama genler genellikle gen kümelerde co lokalizedir. KDO2 ( Chitinophaga pinensis)'dan gen sözde PLP-DC (Şekil 2) kodlama bir gen ile birlikte lokalize bulundu. Buna ek olarak, hiçbir gen DC için kodlama KDO1 dioxygenase genomik bağlamında analiz ederken bulundu. C. pinensis (DCCpin) PLP-DC protein bu nedenle cascade tepki decarboxylation adımında katalizler umut verici adayı olarak seçildi.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig2.jpg"> Şekil 2: C. pinensisKDO2 geni genomik bağlamında. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Sonuç olarak, enzimatik cascade reaksiyonlar içeren dioxygenases ve DCs gelen amino asitler (şekil 3) Alifatik kiral β ve γ-amino alkoller sentezi elde etmek için tasarlanmış. Önceden bildirildiği gibi αKAO tarafından katalize C-H oksidasyon hidroksi yerine stereogenic Merkezi ile toplam diastereoselectivity tanıtır; Cβ/γ sembolik-ecek var olmak saklı içinde belgili tanımlık decarboxylative adım, amino asit yan16Cα karbon sadece etkileyen.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig3.jpg"> Şekil 3: Retrosynthetic analiz. (A)Retrosynthesis β ve γ amino alkoller (R) - 1,5 - diaminopentan-2-ol, (4) (5R) - hidroksi - L-lizin ve (S) - 1,5 - diaminopentan-2-ol (5) ve 1,5-diaminopentan-3-ol (6) dan L-lizin. (B) Retrosynthesis - 1,5 - β, γ - ve β, δ-amino diols (2S, 3S) diaminopentane-2,3-diol (10) ve (2R, 4S) - 1,5 - diaminopentane-2,4-diol (11) (5R) başlangıç- hidroksi-L-lizin ve (2R, 3R) - 1,5 - diaminopentane-2,3-diol (7) L-lizin başlayarak. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
L-lizin ve onun (5R) başlayan-hidroksi Türev, biz burada rapor bir iki/üç adım, tek bir kap, enzimatik yordamı dioxygenases ve amino alkoller hedef almak için PIP-DCs birleştirerek. Önceden bir sentez hedef molekülleri laboratuvar ölçekte reaksiyon koşulları, örneğin, başlangıç malzemelerin; tam dönüşüm sağlamak için gerekli enzim konsantrasyonları ayarlamak için analitik ölçekte yöntem geliştirildi Biz bu yordamı de mevcut.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(5S)-hydroxy-L-lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>GPS NONH</td>
			<td>Out sourcing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-ketoglutaric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Acros</td>
			<td>201370250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal phosphate (PLP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>82870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20825.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 37%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>435570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl 0.1M</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>35335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83640.320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-trifluoroacetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>153112E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia 28%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21182.294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83638.32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Acros</td>
			<td>270480010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid 85%</td>
			<td>Acros</td>
			<td>201145000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Acros</td>
			<td>320,710,075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00F-4601-Y0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accela UHPLC System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accela PDA detector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4mm syringe filters - 0,22&#181;m - PVDF</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SLGVR04NL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HSWA5010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange resin 100-200&#160;mesh</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>217506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT200609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>B&#252;chi</td>
			<td>531-0103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer alpha 1-2 LDplus</td>
			<td>Christ</td>
			<td>L083302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 20 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121000031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121000074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 500 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121000112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121000120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 MHz spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microtube</td>
			<td>CLEARLine</td>
			<td>CL20.002.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical-bottom centrifuge tube</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>05-539-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL round-bottom flask 14/23</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10353331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL round-bottom flask 29/32</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11786183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL round-bottom flask 29/32</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11786183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL erlenmeyer flask</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>15496143</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enzymatic cascade reactions for the synthesis of chiral amino alcohols from l-lysine

Amino alkoller geniş bir uygulama yelpazesi ile çok yönlü bileşiklerdir. Örneğin, Organik sentez kiral iskele olarak kullanılmıştır. Onların sentez geleneksel organik kimya tarafından genellikle sıkıcı Multi-step sentez işlemlerle stereochemical sonucu zor kontrol gerektirir. Enzimatik synthetize amino alkoller hazır L-lizin 48 h dan başlayan bir iletişim kuralına tanıtacağız. Bu iletişim kuralı tarafından geleneksel Organik sentez yapmak çok zor olan iki kimyasal reaksiyonlar birleştirir. İlk adım, regio - ve diastereoselective oksidasyon lizin unactivated bir C-H bağı içinde yan zincir dioxygenase tarafından katalizlenir; regiodivergent dioxygenase tarafından katalize ikinci bir regio - ve diastereoselective oksidasyon 1,2-diols oluşumuna yol açabilir. Son adımda, karboksilik grubu Alfa amino asitin piridoksal-fosfat (PIP) dekarboksilaz (DC) tarafından i ciddi. Decarboxylative bu adımı yalnızca stereogenic hidroksi yerine merkezi bir beta/gama pozisyonda istinat amino asit, Alfa karbon etkiler. Elde edilen amino alkoller bu nedenle optik zenginleştirilmiş. Protokol dört amino alkoller semipreparative ölçekli sentezi başarıyla uygulandı. Tepkileri izleme yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) tarafından derivatization sonra 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene tarafından yapılmıştır. Basit arıtma katı fazlı ayıklama (SPE) tarafından tanınan mükemmel verimleri ile amino alkoller (%93 > % 95).

Biz daha önce diastereoselective enzimatik prokollajen demir (II) dioxygenases tarafından katalize tarafından sentez, mono - ve di-hidroksi-L-lysines bildirdin / αKAO ailesi (şekil 1)16. PIP DC tarafından katalize bir decarboxylation adım ardından bir αKAO tarafından katalize bir ya da iki prokollajen adımları birleştiren burada anlatılan tüm cascades protokolü en iyi duruma getirmek için reaksiyon koşulları hem de g...

Watch this Scientific Journal Video about Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine at JoVE.com

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Kiral amino alkoller çok yönlü kullanım için iskele organik sentezinde moleküllerdir. L-lizin başlayarak, biz sentez amino alkoller-diastereoselective C-H oksidasyon karboksilik asit yan tarafından karşılık gelen hidroksil amino asitin bölünme ardından dioxygenase tarafından katalize birleştiren bir enzimatik cascade tepki bir dekarboksilaz.

Enzimatik Cascade reaksiyonlardan L-lizin Amino kiral alkoller sentezi için

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

enzymatic-cascade-reactions-for-synthesis-chiral-amino-alcohols-from

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Chemical Kinetics

SCIENTISTS IN ACTION

12.0K Görüntüleme.  CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay. Kiral amino alkoller çok yönlü kullanım için iskele organik sentezinde moleküllerdir. L-lizin başlayarak, biz sentez amino alkoller-diastereoselective C-H oksidasyon karboksilik asit yan tarafından karşılık gelen hidroksil amino asitin bölünme ardından dioxygenase tarafından katalize birleştiren bir enzimatik cascade tepki bir dekarboksilaz.

Video: Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Microwave-assisted Intramolecular Dehydrogenative Diels-Alder Reactions for the Synthesis of Functionalized Naphthalenes/Solvatochromic Dyes

Functionalized naphthalenes have applications in a variety of research fields ranging from the synthesis of natural or biologically active molecules to the preparation of new organic dyes. Although numerous strategies have been reported to access naphthalene scaffolds, many procedures still present limitations in terms of incorporating functionality, which in turn narrows the range of available substrates. The development of versatile methods for direct access to substituted naphthalenes is therefore highly desirable.
The Diels-Alder (DA) cycloaddition reaction is a powerful and attractive method for the formation of saturated and unsaturated ring systems from readily available starting materials. A new microwave-assisted intramolecular dehydrogenative DA reaction of styrenyl derivatives described herein generates a variety of functionalized cyclopenta[b]naphthalenes that could not be prepared using existing synthetic methods. When compared to conventional heating, microwave irradiation accelerates reaction rates, enhances yields, and limits the formation of undesired byproducts.
The utility of this protocol is further demonstrated by the conversion of a DA cycloadduct into a novel solvatochromic fluorescent dye via a Buchwald-Hartwig palladium-catalyzed cross-coupling reaction. Fluorescence spectroscopy, as an informative and sensitive analytical technique, plays a key role in research fields including environmental science, medicine, pharmacology, and cellular biology. Access to a variety of new organic fluorophores provided by the microwave-assisted dehydrogenative DA reaction allows for further advancement in these fields.

Microwave-assisted intramolecular dehydrogenative Diels-Alder (DA) reactions provide concise access to functionalized cyclopenta[b]naphthalene building blocks. The utility of this methodology is demonstrated by one-step conversion of the dehydrogenative DA cycloadducts into novel solvatochromic fluorescent dyes via Buchwald-Hartwig palladium-catalyzed cross-coupling reactions.

Fonksiyonlu naftalenlerin / Solvatochromic Boyaların Sentez için Mikrodalga-destekli Moleküliçi Dehydrogenative Diels-Alder Reaksiyonları

Functionalized naphthalenes have applications in a variety of research fields ranging from the synthesis of natural or biologically active molecules to ...

Kimya

Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as an intrinsic probe to characterize virtually every chemical process. Nowadays, this technique is extensively applied to determine thermodynamic parameters of biomolecular binding equilibria. In addition, ITC has been demonstrated to be able of directly measuring kinetics and thermodynamic parameters (kcat, KM, &#916;H) of enzymatic reactions, even though this application is still underexploited. As heat changes spontaneously occur during enzymatic catalysis, ITC does not require any modification or labeling of the system under analysis and can be performed in solution. Moreover, the method needs little amount of material. These properties make ITC an invaluable, powerful and unique tool to study enzyme kinetics in several applications, such as, for example, drug discovery.
In this work an experimental ITC-based method to quantify kinetics and thermodynamics of enzymatic reactions is thoroughly described. This method is applied to determine kcat and KM of the enzymatic hydrolysis of urea by Canavalia ensiformis (jack bean) urease. Calculation of intrinsic molar enthalpy (&#916;Hint) of the reaction is performed. The values thus obtained are consistent with previous data reported in literature, demonstrating the reliability of the methodology.

Isothermal titration calorimetry measures heat flow released or absorbed in chemical reactions. This method can be used to quantify enzyme-catalysis. In this paper, the protocol for instrumental setup, experiment running, and data analysis is generally described, and applied to the characterization of enzymatic urea hydrolysis by jack bean urease.

Sıcak Biyolojik kataliz: İzotermal Titrasyon Kalorimetre enzimatik reaksiyonların Characterize

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of trifluoromethoxylated aromatic compounds remains a formidable challenge in organic synthesis. Conventional approaches often suffer from poor substrate scope, or require use of highly toxic, difficult-to-handle, and/or thermally labile reagents. Herein, we report a user-friendly protocol for the synthesis of methyl 4-acetamido-3-(trifluoromethoxy)benzoate using 1-trifluoromethyl-1,2-benziodoxol-3(1H)-one (Togni reagent II). Treating methyl 4-(N-hydroxyacetamido)benzoate (1a) with Togni reagent II in the presence of a catalytic amount of cesium carbonate (Cs2CO3) in chloroform at RT afforded methyl 4-(N-(trifluoromethoxy)acetamido)benzoate (2a). This intermediate was then converted to the final product methyl 4-acetamido-3-(trifluoromethoxy)benzoate (3a) in nitromethane at 120 &#176;C. This procedure is general and can be applied to the synthesis of a broad spectrum of ortho-trifluoromethoxylated aniline derivatives, which could serve as useful synthetic building blocks for the discovery and development of new pharmaceuticals, agrochemicals, and functional materials.

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

An operationally simple procedure for the synthesis of ortho-trifluoromethoxylated aniline derivatives via a two-step sequence of O-trifluoromethylation of N-aryl-N-hydroxyacetamide followed by thermally induced intramolecular OCF3-migration is reported.

Sentezi İçin Protokol<em&gt; Ortho</em&gt; -trifluoromethoxylated Anilin türevleri

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Protein Bioconjugatlar sentezi<em&gt; yoluyla</em&gt; Sistein-maleimid Kimya

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins with the synthesis of a hydrophilic poly(oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylate) (POEGMA) homopolymer using reversible addition-fragmentation chain-transfer (RAFT) polymerization. Under mild visible light irradiation (&#955; = 460 nm, 0.7 mW/cm2), this macro-chain transfer agent (macro-CTA) in the presence of a ruthenium based photoredox catalyst, Ru(bpy)3Cl2 can be chain extended with a second monomer to form a well-defined block copolymer in a process known as Photoinduced Electron Transfer RAFT (PET-RAFT). When PET-RAFT is used to chain extend POEGMA with benzyl methacrylate (BzMA) in ethanol (EtOH), polymeric nanoparticles with different morphologies are formed in situ according to a polymerization-induced self-assembly (PISA) mechanism. Self-assembly into nanoparticles presenting POEGMA chains at the corona and poly(benzyl methacrylate) (PBzMA) chains in the core occurs in situ due to the growing insolubility of the PBzMA block in ethanol. Interestingly, the formation of highly pure worm-like micelles can be readily monitored by observing the onset of a highly viscous gel in situ due to nanoparticle entanglements occurring during the polymerization. This process thereby allows for a more reproducible synthesis of worm-like micelles simply by monitoring the solution viscosity during the course of the polymerization. In addition, the light stimulus can be intermittently applied in an ON/OFF manner demonstrating temporal control over the nanoparticle morphology.

This article describes a process for producing polymeric self-assembled nanoparticles using visible light mediated dispersion polymerization. Using low energy visible light to control the polymerization allows for the reproducible formation of self-assembled worm-like micelles at high solids content.

Photoredox Katalizörü kullanarak görünür ışık aracılığı ile dispersiyon polimerleştirilmesi ile solucan gibi miseller Facile sentezi

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from benzimidazolium salts. Detailed and generalized protocols are also presented for testing the catalytic activity of such complexes in arylation and Suzuki-Miyaura cross-coupling reactions. Representative results are shown for the catalytic activity of the four complexes in arylation and Suzuki-Miyaura type reactions. For each of the reactions investigated, at least one of the four complexes successfully catalyzed the reaction, qualifying them as promising candidates for catalysis of many carbon-carbon bond-forming reactions. The protocols presented are general enough to be adapted for the synthesis, purification and catalytic activity testing of new palladium N-heterocyclic carbene complexes.

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from benzimidazolium salts. The complexes were tested for catalytic activity in arylation and Suzuki-Miyaura reactions. For each reaction investigated, at least one of the four complexes successfully catalyzed the reaction.

palladyum<em&gt; K</em&gt; -Heterosiklik Karben Kompleksleri: Benzimidazolyum Tuzlarından Sentez ve Karbon-karbon Bağ Oluşturma Reaksiyonlarında Katalitik Aktivite

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Tek Molekül Kuvvetleri Spektroskopisi kullanarak İnorganik Malzemelerle Amino Asitler ve Peptitler Etkileşimi içine Trendleri

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are commonly found on human glycoproteins. To achieve the desired structural diversity, the strategy began with the chemo-enzymatic synthesis of three kinds of oligosaccharyl fluoride modules, followed by their stepwise &#945;-selective glycosylations at the 3-O and 6-O positions of the mannose residue of the common core trisaccharide having a crucial &#946;-mannoside linkage. We further attached the N-glycans to the surface of an aluminum oxide-coated glass (ACG) slide to create a covalent mixed array for the analysis of hetero-ligand interaction with an HIV antibody. In particular, the binding behavior of a newly isolated HIV-1 broadly neutralizing antibody (bNAb), PG9, to the mixture of closely spaced Man5GlcNAc2 (Man5) and 2,6-di-sialylated bi-antennary complex type N-glycan (SCT) on an ACG array, opens a new avenue to guide the effective immunogen design for HIV vaccine development. In addition, our ACG array embodies a powerful tool to study other HIV antibodies for hetero-ligand binding behavior.

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

A modular approach to the synthesis of N-glycans for attachment to an aluminum oxide-coated glass slide (ACG slide) as a glycan microarray has been developed and its use for the profiling of an HIV broadly neutralizing antibody has been demonstrated.

N- glukanlardir dizi geliştirme ve HIV antikor için kemoterapi enzimatik sentezi profil oluşturma

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

Sentez ve Site seçici olarak oluşturulması için Thiol reaktif reaktif Bioconjugation Immunoconjugates modifiye

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These metabolites are produced endogenously by the cytochrome P450 class of enzymes. Because of their diverse and potent biological effects, there is considerable interest in studying these metabolites. Determining the unique roles of these metabolites in the body is a difficult task, as the epoxy fatty acids must first be obtained in significant amounts and with high purity. Obtaining compounds from natural sources is often labor intensive, and soluble epoxide hydrolases (sEH) rapidly hydrolyze the metabolites. On the other hand, obtaining these metabolites via chemical reactions is very inefficient, due to the difficulty of obtaining pure regioisomers and enantiomers, low yields, and extensive (and expensive) purification. Here, we present an efficient enzymatic synthesis of 19(S),20(R)- and 16(S),17(R)-epoxydocosapentaenoic acids (EDPs) from DHA via epoxidation with BM3, a bacterial CYP450 enzyme isolated originally from Bacillus megaterium (that is readily expressed in Escherichia coli). Characterization and determination of purity is performed with nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), high-performance liquid chromatography (HPLC), and mass spectrometry (MS). This procedure illustrates the benefits of enzymatic synthesis of PUFA epoxy metabolites, and is applicable to the epoxidation of other fatty acids, including arachidonic acid (AA) and eicosapentaenoic acid (EPA) to produce the analogous epoxyeicosatrienoic acids (EETs) and epoxyeicosatetraenoic acids (EEQs), respectively.

We present a method useful for large-scale enzymatic synthesis and purification of specific enantiomers and regioisomers of epoxides of arachidonic acid (AA), docosahexaenoic acid (DHA), and eicosapentaenoic acid (EPA) with the use of a bacterial cytochrome P450 enzyme (BM3).

Dokosahexaenoic, eicosapentaenoic ve Arachidonik asitlerin Epoxilenmiş metabolitlerinin enzimatik sentezini

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...