Özel Gübre Ürünleri Şirketi (SFP) Bu çalışma için gerekli fonları sağlamak için kabul edilmektedir.

1.. Numune Hazırlanması <ol><li> Enzim çözeltisi 2 ml ve her bir deney işlemi için alt-tabaka çözeltisi, 0.5 ml hazırlayın. Alt-tabaka, ilave sırasında seyreltme ve karıştırma ısısının en aza indirmek için özdeş bileşime sahip olan, tampon çözeltiler içinde, enzim ve substrat konsantre stok çözeltileri seyreltin. <ol><li> Deney sırasında pH değişikliğini önlemek için yeterli tampon koşulları seçin. Örneğin, 20 mM HEPES pH 7 nötr pH değerinde yapılan ölçümler için yeterlidir. Not: proton değişimi söz konusu ise bu reaksiyonun ölçülen AH etkiler nedeniyle, kullanılan tamponların protonasyon entalpileri, kabul edilmelidir. Analiz edilen sistem üzerinde tampon veya katkı moleküllerinin olası spesifik etkileri dikkate alınmalıdır. Organik çözücüler (örneğin DMSO) enzim çözeltisi içerdiği takdirde, alt-tabaka çözeltisi içine tam olarak aynı konsantrasyonda ekleyin. </li><li> M1 deney için, başlangıçnM aralığındaki enzim konsantrasyonunun (örneğin, 1 nM) ve enzim konsantrasyonundan ve K M yukarıda büyüklük en az üç tane yüksek olan bir alt-tabaka konsantrasyonu. </li><li> M2 deneme için, pM-nM aralığında enzim konsantrasyonu (örneğin, 15 pM) ile başlar. Şırınga içinde substrat konsantrasyonu mM aralığında (örneğin 400 mM) bulunmaktadır. NOT: Tek bir enjeksiyon M1 deneyde, konsantrasyonları deneysel zamanla ürünün içine toplam madde dönüşüm elde etmek için yeterli olmalıdır. Bu nedenle, enzimin konsantrasyonu, enzim hızına bağlıdır: düşük k cat sahip enzimler çalışma altında ise, daha yüksek enzim konsantrasyonları (en fazla 10 uM) kullanılmalıdır. Öte yandan, M2 deneyde kullanılan enzim konsantrasyonları enjekte edilen alt-tabaka, sadece marjinal (% 5&#39;ten az) tüketilen ve enzim reaksiyonu kalıcı halde devam olmasıdır sağlamak gerekir. Bu nedenle, daha yüksekEnzim etkinliği, gerekli enzim konsantrasyonu, daha düşüktür. Deneyin sonunda, numune, hücre içinde alt-tabaka konsantrasyonu M K daha yüksek olmalıdır. </li></ol></li><li> Dikkatle 280 nm, kolorimetrik, BCA deneyleri 11 de uygun bir analitik prosedüre (örneğin absorbans ile enzim ve alt tabaka konsantrasyonları kontrol edin. Bu termodinamik ve kinetik parametrelerinin doğru ve güvenilir bir hesabını elde etmek için gereklidir. </li><li> Çözeltilerin pH değeri ölçülür ve enzim ve alt tabaka çözümlerin her ikisinin de pH uyumsuzluk (0.05 pH birimi ±) deney koşulları altında en az olduğundan emin olun. </li></ol> 2. Deney Sahne Not: Aynı prosedür, her ikisi de birbiri ardına gerçekleştirilen M1 ve M2 deney için uygulanması gerekir. <ol><li> Numune hücresi ve enjeksiyon şırınga üreticinin talimatlarına göre temizlenir doğrulayıntalimatları. Damıtılmış su ile aleti ile temin edilen yükleme şırınga doldurun, yavaşça, örnek hücredeki iğneyi hücreyi doldurmak ve aynı şırınga kullanılarak sıvı boşaltılır. Bu yöntem kullanılarak, tampon maddesi ile iki kere damıtılmış su ile iki kez, numune hücresini yıkayın. </li><li> Dikkatli bir hava kabarcığı oluşumunu önlemek, yükleme şırınga kullanılarak enzim solüsyonu ile 2 ml numune hücresini yerleştirin. Bu hücre kök üst dökülürler kadar yavaşça hücre içine enjekte çözüm. Ca bir hamle üretir. Çözeltisi 0.25 ml hücreye. Iki kez tekrarlayın. Bu adım, örnek hücre içinde hava kabarcığı kaldırır. </li><li> Kök hücre ve hücre noktası arasındaki bir çıkıntı üzerinde yükleme şırınganın iğne koyun ve herhangi bir fazla uzaklaştırın. </li><li> VP-Görüntüleyici programını başlatın ve bilgisayar arayüzü, arzu edilen deney sıcaklığının altında bir sıcaklık 3 ° C&#39;ye kadar dengeye ITC cihazı. Bu uzun dengeye önlemek için gereklidirpasif soğutma enstrümantal cihaz nedeniyle deneyden önce dönemleri. </li><li> Yukarıdaki ile aynı prosedür ile damıtılmış su ile referans hücre doldurun. Yüksek iyonik kuvveti ve yüksek osmolalitesi ile tampon çözelti içinde, örnek olarak, aynı tampon çözelti referans olarak kullanılmalıdır. </li><li> Ince bir silikon tüp kullanılarak, enjeksiyon şırınga doldurma portuna plastik bir şırınga bağlayın. Su şırınga dolu olduğunu gösteren, üst dolum noktasına çıkıncaya kadar, suya iğne ucu yerleştirme ve yukarı çizim enjeksiyon şırınga doldurun. Sonra su şırınga ucu taşımak ve havayı yukarı çekmek, enjeksiyon şırınga boşaltmak için. Bu işlem ile, tampon ile enjeksiyon şırınga yıkayın ve sistem üzerinden havayı çekmek. Daha sonra, tüpün altındaki çözeltinin küçük bir miktar bırakarak, dikkatli bir şekilde çekmek ve tamamen enjeksiyon enjektörü doldurmak, alt-tabaka çözeltisi, 0.5 ml ihtiva eden dar bir tüp içinde enjeksiyon iğne yerleştirin. </li><li> Gönderenbilgisayar arayüzü, basın &quot;Close dolgu liman&quot;. Silikon yükleme tüpü çıkarın. Basın &quot;Temizle ve dolum&quot; şırınga herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak ve toplu çözüm içine onları kovmak için izin düğmesi. Iki kez tekrarlayın. </li><li> Her damla çıkarın ve örnek hücre içine enjeksiyon şırınganın iğne yerleştirmek için iki tarafta silin, enjeksiyon şırınga hareket ettirin. </li><li> , Bilgisayarda uygun çalışma parametrelerini ayarlamak. Deney, enzim ve alt tabaka konsantrasyonu gösterilebilir. <ol><li> M1 deneyde, tekrarlanabilirliğini doğrulamak için alt tabakanın en az iki ekleme (5-30 ul) ayarlayın. Her enjeksiyon arasındaki boşluk süresi sağlamak için yeterince büyük (örneğin, 1000 sn) bir sonraki ilave edilmeden önce bazal ısı sinyali geri döner. </li><li> M2 deneyde, (örneğin, 15 x 5-10 ul) enjeksiyonu birden ayarlayın. Sistem s izin enjeksiyonlar (örneğin 180 sn) arasındaki aralığı ayarlayınHer enjeksiyondan sonra yeni başlangıca termal güç civarında tutulması. Not: M2 deneyde enjeksiyonlar arasındaki aralık süresi ölçümleri kararlı hal şartları altında gerçekleştirilebilir izin vererek, alt-tabaka bir önemli miktarda dönüşümünü önlemek için yeterince kısa olmalıdır. </li><li> M2 deneyde, karşılık gelen değer sonraki veri analizi sırasında atılır ilk enjeksiyon için, küçük hacimli (örneğin, 2 ul) kullanır. Gerçekten de, genellikle, şırınga ucu ile ilk alt-tabaka difüzyon nedeniyle eserler sunar ve şırınga iğnesi sıkışmış hava kabarcıklarının varlığı için. </li><li> Referans güç ayarlama, taban reaksiyonundan önce yerleştirileceği olarak yaklaşık 20 düzeyinde bir değerde, başlar. Daha sonra deney enzim ve alt tabaka konsantrasyonları tanımlayan ve deney için bir isim seçtik. </li><li> Tipik olarak 25 ° C&#39;de, deney sıcaklığı tanımlar ITC sağlar 2 arasındaki çalışma sıcaklıkları<html> ° C ile 80 ° C. Deney çalıştırmak için hazırdır. Denemeyi başlatmak için &quot;Başla&quot; düğmesine basın. </li></ol></li><li> Deney tamamlandıktan sonra, üreticinin talimatlarına uygun olarak örnek hücre ve şırınga temizleyin. </li><li> En az bir veya iki kez daha verilerin tekrarlanabilirliği kontrol etmek için bir deney tekrarlayın. </li></ol> 3. Veri Analizi <ol><li> Analiz programı, &quot;verileri oku&quot; butonuna tıklayın, ve yapılan M2 deney. Itc dosyasının bulunduğu klasöre gidin. &quot;Dosya türü&quot; kaydırma aşağı oka tıklayın ve &quot;Enzim Assay (it?)&quot; Seçeneğini seçin. Daha sonra, tıklayın ve M2 deney. Itc dosyasını açın. </li><li> Denklem 5&#39;e göre deney M1 eğrisini entegre gelen reaksiyonun SH elde edilir. &quot;Width =&quot; 126 &quot;/&gt; (5) <ol><li> &quot;Verisini oku&quot; butonuna tıklayın ve yapılan M1 deney dosyası. ITC seçin. Origin kullanarak, bir tepe her içeren farklı yerlerinde iz bölmek ve bir. Opj dosyası olarak her tepe kaydedin. Tek bir enjeksiyon deney M1, entegre ve elde edilen alan değerine bölünür ve termogramında başlangıç ​​sapmadan kaynaklanan, birinci pik değerine karşılık gelen bir dosya açma, μcal olarak ifade edilen numune hücresinin nihai substrat konsantrasyonu, uM olarak ifade edilmiştir ve hücre hacmi ile Denklem 5, reaksiyonun AH göre belirlenmesi, litre olarak ifade edilmiştir. </li><li> M1 Deneyin ikinci zirve için aynı prosedürü tekrar ve iki SH ölçümleri için ortalama bir değer elde. </li></ol></li><li> Her bir enjeksiyonun ardından orijinal temel ve yeni taban arasındaki farkı ölçen M2 deneyden dQ / dt belirler. E dönüştürmekDenklem 4&#39;e göre reaksiyon oranları Xperimental verileri, M1 deneyde elde edilen entalpi değeri kullanılarak ve Michaelis-Menten denklemine verileri uygun. <ol><li> Analiz programı, &quot;verileri oku&quot; butonuna tıklayın, ve yapılan M2 deney dosyası. ITC seçin. &quot;Dosya türü&quot; kaydırma aşağı oka tıklayın ve &quot;Enzim Assay (it?)&quot; Seçeneğini seçin. </li><li> Enzim Testi iletişim kutusu dört modellerinden birini seçerek izin açılır. Penceresinden - &quot;sadece Yüzey Yöntem 2&quot; seçeneğini seçin. </li><li> SH penceresinde, aşama 4.2 &#39;de elde AH değerini göstermektedir. </li><li> Uygun prosedürde kullanılmak üzere konsantrasyon değerlerini kontrol etmek için &quot;Konsantrasyon&quot; butonuna tıklayın. &quot;Ortalama Süre (P)&quot; düğmesine tıklayın. Iletişim kutusu varsayılan değeri değiştirmek veya kabul etmek için bir fırsat vererek açar. Bu değer, her enjektö önce zamanı temsiliyon hangi araç ortalamalar her bir alt-tabaka konsantrasyonunda güç seviyesini belirlemek için güç sinyalinin. Varsayılan değeri onaylamak için Tamam&#39;a tıklayın. </li><li> &quot;Sıfır Y Eksen&quot; düğmesine tıklayın. İmleç y = 0 da yerleştirmek için, bir noktayı tıklatın çift izin haç dönüşür. Sadece ilk enjeksiyon noktasından önce çift tıklayın. </li><li> Hesapla Hızı düğmesine tıklayın. Oranı (hesap seyreltme etkiler dikkate alınarak) numune hücre hacmi için titrasyon sırasında eklenen alt-tabakanın bölünmesi ile elde edilen substrat konsantrasyonuna karşı çizilmiştir. Bu işlem, M K ve k cat elde etmek üzere takılabilir, tipik Michaelis-Menten grafiğini vermektedir. </li><li> Bazı noktaları silinecek olursa, &quot;Truncate Verileri&quot; düğmesini seçin. Kötü veri noktalarını ve girmek belirteçlerin basın veya birine çift tıklayın dışlamak için veri işaretçileri hareket ettirin. </li><li> Eğriye uyacak ve için &quot;model Fit&quot; işlevini kullanınkinetik sabitleri elde edilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Leavitt, S., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+protein+binding+energetics+by+isothermal+titration+calorimetry.">Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 560-566 (2001).</li><li>Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+the+biological+sciences:+things+are+heating+up!+BioTechniques.">Application of isothermal titration calorimetry in the biological sciences: things are heating up! BioTechniques.</a> 37, 885-887 (2004).</li><li>Zambelli, B., Bellucci, M., Danielli, A., Scarlato, V., Ciurli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ni2++binding+properties+of+Helicobacter+pylori+NikR.">The Ni2+ binding properties of Helicobacter pylori NikR.</a> Chem. Commun. , 3649-3651 (2007).</li><li>Zambelli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+Ni2++binding+selectively+promotes+binding+of+Helicobacter+pylori+NikR+to+its+target+urease+promoter.">High-affinity Ni2+ binding selectively promotes binding of Helicobacter pylori NikR to its target urease promoter.</a> J. Mol. Biol. 383, 1129-1143 (2008).</li><li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity.">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010.">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li><li>Todd, M. J., Gomez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+kinetics+determined+using+calorimetry:+a+general+assay+for+enzyme+activity.">Enzyme kinetics determined using calorimetry: a general assay for enzyme activity.</a> Anal. Biochem. 296, 179-187 (2001).</li><li>Bianconi, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorimetry+of+enzyme-catalyzed+reactions.">Calorimetry of enzyme-catalyzed reactions.</a> Biophys. Chem. 126, 59-64 (2007).</li><li>Demarse, N. A., Killian, M. C., Hansen, L. D., Quinn, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+enzyme+kinetics+via+isothermal+titration+calorimetry.">Determining enzyme kinetics via isothermal titration calorimetry.</a> Methods Mol. Biol. 978, 21-30 (2013).</li><li>Michaelis, L., Menten, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+kinetik+der+invertinwirkung.">Die kinetik der invertinwirkung.</a> Biochem. Z. 49, 333-369 (1913).</li><li>Walker, J., Wilson, K., Walker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principle and techniques of practical biochemistry. , 312-356 (2000).</li><li>Ciurli, S., Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nickel and its surprising impact in nature. 2, 241-278 (2007).</li><li>Zambelli, B., Musiani, F., Benini, S., Ciurli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+Ni2++in+urease:+sensing,+trafficking,+and+catalysis.">Chemistry of Ni2+ in urease: sensing, trafficking, and catalysis.</a> Acc. Chem. Res. 44, 520-530 (2011).</li><li>Zonia, L. E., Stebbins, N. E., Polacco, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+urease+in+germination+of+nitrogen-limited+Arabidopsis+thaliana+seeds.">Essential role of urease in germination of nitrogen-limited Arabidopsis thaliana seeds.</a> Plant Physiol. 107, 1097-1103 (1995).</li><li>Follmer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+role+and+structure+of+plant+ureases.">Insights into the role and structure of plant ureases.</a> Phytochemistry. 69, 18-28 (2008).</li><li>Sumner, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+crystallization+of+the+enzyme+urease.">The isolation and crystallization of the enzyme urease.</a> J. Biol. Chem. 69, 435-441 (1926).</li><li>Krajewska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureases+I.+Functional,+catalytic+and+kinetic+properties:+A+review.">Ureases I. Functional, catalytic and kinetic properties: A review.</a> J. Mol. Cat. B. 59, 9-21 (2009).</li><li>Callahan, B. P., Yuan, Y., Wolfenden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burden+borne+by+urease.">The burden borne by urease.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 10828-10829 (2005).</li><li>Krajewska, B., van Eldik, R., Brindell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-+and+pressure-dependent+stopped-flow+kinetic+studies+of+jack+bean+urease.+Implications+for+the+catalytic+mechanism.">Temperature- and pressure-dependent stopped-flow kinetic studies of jack bean urease. Implications for the catalytic mechanism.</a> J. Biol. Inorg. Chem. 17, 1123-1134 (2012).</li><li>Hausinger, R. P., Karplus, P. A., Huber, R., Poulos, T., Wieghardt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Metalloproteins. , 867-879 (2001).</li><li>Goldberg, R., Kishore, N., Lennen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+quantities+for+the+ionization+reactions+of+buffers.">Thermodynamic quantities for the ionization reactions of buffers.</a> J. Phys. Chem. Ref. Data. 31, 231-370 (2002).</li><li>Baumann, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+isothermal+titration+calorimetry+for+xylanase+kinetics+in+comparison+to+chemical-reducing-end+assays.">Advantages of isothermal titration calorimetry for xylanase kinetics in comparison to chemical-reducing-end assays.</a> Anal. Biochem. 410, 19-26 (2011).</li><li>Noske, R., Cornelius, F., Clarke, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+enzymatic+activity+of+the+Na+,K+-ATPase+via+isothermal+titration+microcalorimetry.">Investigation of the enzymatic activity of the Na+,K+-ATPase via isothermal titration microcalorimetry.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1797, 1540-1545 (2010).</li><li>Harmon, K. M., Niemann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+competitive+inhibition+of+the+urease-catalyzed+hydrolysis+of+urea+by+phosphate.">The competitive inhibition of the urease-catalyzed hydrolysis of urea by phosphate.</a> J. Biol. Chem. 177, 601-605 (1949).</li><li>Benini, S., Rypniewski, W. R., Wilson, K. S., Ciurli, S., Mangani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+rationalization+of+urease+inhibition+by+phosphate:+novel+insights+into+the+enzyme+mechanism.">Structure-based rationalization of urease inhibition by phosphate: novel insights into the enzyme mechanism.</a> J. Biol. Inorg. Chem. 6, 778-790 (2001).</li><li>Segel, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme kinetics: behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme systems. , (1993).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Mevcut yöntemlere göre enzimatik aktivitesini incelemek için ITC önemi Bağlama dengeleri incelemek için klasik uygulamalara ek olarak, izotermal titrasyon kalorimetrisi sistem modifikasyon veya etiketleme gerektirmeden, bir prob olarak reaksiyon ısısının kullanılarak çözelti içinde enzimatik reaksiyonları karakterize için güvenilir ve hızlı bir yöntem sağlar. Kinetik parametreler kedi k ve K M genellikle ürün for...

Biyokimyasal reaksiyonların kantitatif tayini hayatın temelinde biyolojik süreçlere bakış sağlar. Kalorimetre kantitatif çözelti içinde hemen hemen her kimyasal reaksiyon karakterize etmek için bir etiket içermeyen bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, ısı serbest ya da zaman içinde absorbe ölçer ve bu nedenle evrensel bir algılama sistemi ve reaksiyona moleküllerin (örneğin bağlanma termodinamik) yanı sıra, bu, reaksiyon oranını (yani kinetik) ölçmek için miktarını ölçmek için çok uygun bir yöntemdir. Özellikle, izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) protein-ligand, protein-protein, protein-metal iyonları ve protein-DNA etkileşim 1-6 dahil, biyomoleküler dengenin termodinamik karakterize etmek için tercih edilen bir yöntem olarak kabul edilmiştir. Bu uygulamanın potansiyel hala olmasına rağmen ek olarak, kinetik bilgi sağlamak için ITC yeteneği, bu enzim katalizi ölçmek için çok güçlü bir sistem yapar7-9 hafife. Michaelis sabiti (K M) ve katalitik oranı sabiti (k cat): iki kinetik parametrelere bağlı olarak, reaksiyon hızı ve alt tabaka konsantrasyonu arasında bir ilişki sağlayan olarak Michaelis-Menten denklemi 10, enzimatik reaksiyonların kantitatif açıklaması . K cat / K oranı, M, bir enzimin katalitik verimlilik olarak adlandırılır. Uygulamada, belirli bir reaksiyon için K M belirlenmesi ve k kedi kataliz tam bir açıklamasını sağlar. Tipik bir enzimatik reaksiyon (Şekil 1) olarak, bir alt-tabaka (S) daha sonra geçiş durumuna aktif enzim-alt-tabaka (ES) kompleks oluşturucu enzim (E), (ES *) ile etkileşime girer. Ikinci sonunda ayrışmaktadır enzim ürünü (EP) kompleksi haline dönüştürülür. Bu adımin aşağıdaki reaksiyon ile açıklanmıştır. <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq1.jpg" width="197" /> (1) k, 1 ES kompleksi, k -1 oluşumu için oran sabit olduğu k cat katalitik oranı sabit ya da devir sayısı iken, ES kompleksinin ayrışma için oran sabitidir. : Michaelis-Menten denklemine 10 göre, reaksiyonun oranı olarak hesaplanabilir <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq2.jpg" width="144" /> (2) burada K M = (k + -1 k cat) / k 1 ve k cat = v max / [E], v max tüm enzim alt-tabakaya bağlı olduğunda, ulaşılan maksimum hızı olmak üzere. Izotermal titrasyon kalorimetre üre enzimatik hidrolizi karakterize etmek için, bu çalışmada kullanılan bir araçtır. Bu cihaz iki icat şeklinde hücreleri (Şekil 1) ihtiva eden bir adiyabatik kalkanı yapılır. Bu dar giriş boruları ile dışarıdan bağlanır. Referans hücre, genellikle su ile ya da analiz için kullanılan çözücü ile dolu iken numune hücresi (yaklaşık 1.4 mi), enzim solüsyonu ile yüklenir. Genellikle alt-tabaka çözeltisi ca. 0.3 ml ihtiva eden bir uzun iğne ve bağlı bir karıştırma kürek ile dönen bir şırınga, numune hücresi üzerine monte edilir. Bir termoelektrik cihaz &quot;hücre geribildirim ağı&quot; kullanarak, örnek ve referans hücre arasındaki sıcaklık farkını ölçer, ısı eklenerek veya çıkarılarak sıfırdan bu farkı tutar. Deney esnasında, alt-tabaka sabit bir seçilen sıcaklıkta enzim çözeltisi içine enjekte edilir. Ne zaman trzymatic Reaksiyon serbest veya emilen ısı miktarı ürün moleküllerine dönüştürülür alt-tabaka moleküllerinin sayısı ile orantılıdır, gerçekleşir. Buna ek olarak, ısı akış oranının doğrudan reaksiyonun hızı ile ilgilidir. Ölçülen veriler, başlangıç ​​bazal ısı iz bir sapma (Şekil 1) olarak görülen, (μcal / saniye) numune hücresinin meydana gelen ısı akışı ile orantılıdır numune hücresinin, için cihaz tarafından verilen ısı gücü temsil zaman içinde. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1. Enzimatik reaksiyonları incelemek için izotermal titrasyon kalorimetre şematik temsili. (Örnek hücre olarak) Ther bir değişiklik ile sonuçlanır enzim çözeltisi içine (enjeksiyon şırınga içinde), substratın üzerine titre oluşan bir enzimatik reaksiyon,örnek hücre ve referans hücre sabiti arasındaki sıcaklık farkı tutmak için gerekli kalorimetre tarafından yayımlanan mal güç. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> Genel olarak, ısı değişim (Q) reaksiyonu (AH) ve sırayla toplam hacim kat konsantrasyonu verilir (n), üretilen ürünün mol sayısının molar entalpisi ile orantılıdır: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq3.jpg" width="200" /> (3) Ürün oluşumu, zaman içinde, reaksiyon hızına karşılık gelen (dP / dt), böylece, ilişki ile aynı zamanda (dQ / dt) üzerinden oluşan ısı miktarı ile ilişkili olabilir: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq4.jpg" width="150" /> (4) Bu denkleme göre, Michaelis-Menten elde etmek amacıyla it) toplam moler entalpisi AH i ölçmek için gerekli olan arsa ve değişik alt tabaka konsantrasyonunda ii) ısı akışı dQ / dt. Genellikle, bu, iki farklı deney yapılır: ilk deneyde (Yöntem 1, M1) olarak, alt-tabaka enzim çözeltisi içine enjekte edilir ve tam dönüşüm için alt-tabaka ısı ölçülür; İkinci deneyde (Yöntem 2, M2), alt-tabakanın birden çok enjeksiyon yapılmaktadır ve ısı üretim oranı, çeşitli substrat konsantrasyonlarında ölçülmüştür. Bu iki veri setleri kinetik parametreleri K, M ve k cat elde etmek için yeterlidir. Bu makalede, ITC kullanılarak gerçekleştirilmiştir enzimatik reaksiyonlar için kinetik parametrelerinin belirlenmesi için genel bir protokol tarif edilmektedir. Biz Canavalia ensiformis üre üre hidroliz yöntemi uygulananse, bir referans sistemi olarak. Bu yöntem kullanılarak elde edilen sonuçları ve literatürde bildirilen veriler arasında iyi bir uyum, bu yaklaşımın güvenilirliğini gösterir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="796">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td style="width:323px;">dissolving in water and adjusting pH with NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">TRIZMA-Base</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td>dissolving in water and adjusting pH with HCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:111px;">Riedel-de-Haen</td>
			<td style="width:119px;">4270</td>
			<td>dissolving in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:111px;">Riedel-de-Haen</td>
			<td style="width:119px;">30427</td>
			<td>dissolving in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Urea</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U4128</td>
			<td>dissolving in water at 40 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">Canavalia ensiformis urease (type C-3)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U0251</td>
			<td>dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">VP-ITC on Origin 7.0</td>
			<td style="width:111px;">MicroCal (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">SYS13901</td>
			<td>instrument&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0</td>
			<td style="width:111px;">MicroCal (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>data acquisition software supplied with the instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hot biological catalysis: isothermal titration calorimetry to characterize enzymatic reactions

Izotermal titrasyon kalorimetre (ITC) ısı hemen hemen her kimyasal süreci karakterize etmek için içsel bir prob olarak kullanarak, kimyasal bir reaksiyon esnasında salınan veya emilen ölçen iyi tanımlanmış bir tekniktir. Günümüzde, bu teknik kapsamlı bağlama biyomoleküler termodinamik denge parametreleri belirlemek için uygulanır. Buna ek olarak, bu uygulama ITC doğrudan hala yeterince faydalanılmayan olduğu halde, enzimatik reaksiyonların kinetik ve termodinamik parametreleri (k cat, K E, AH) ölçüm yapabilmek için gösterilmiştir. Isı değişiklikler kendiliğinden enzim katalizi sırasında meydana geldiğinde, ITC analiz edilen sistemin herhangi bir değişiklik ya da etiketleme gerektirmez ve çözelti içinde gerçekleştirilebilir. Ayrıca, yöntem malzemenin az miktarda ihtiyaç duyar. Bu özellikler ITC gibi çeşitli uygulamalar, örneğin, ilaç keşfi enzim kinetiğinin araştırılması için, paha biçilmez güçlü ve benzersiz bir araç yapmak. k cat belirlemek için uygulanır ve Canavalia ensiformis (jack bean) üreaz tarafından enzimatik üre hidrolizinin K M. Reaksiyonun içsel molar entalpisi (AH int) hesaplanması gerçekleştirilir. Bu şekilde elde edilen değerler, metodolojisinin güvenilirliğini gösteren, literatürde bildirilen daha önceki veriler ile tutarlıdır.

Üreaz (EC 3.5.1.5, üre amidohidrolaz) archea, bakteri, tek hücreli, ökariyotlar ve bitkilerde bulunan bir multisubunit nikel ihtiva eden bir enzimdir. Kendiliğinden amonyak ve bikarbonat (denklem 6) 12, ikinci bir molekül vermek için parçalanır amonyak ve karbamata üre hidrolizini katalize organik nitrojen mineralizasyon son adımda bu protein etki eder,. <img fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq6.jpg" width="450" /> (6) <p clas...

Watch this Scientific Journal Video about Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions at JoVE.com

Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Izotermal titrasyon kalorimetre önlemler ısı akışı serbest veya kimyasal reaksiyonlarda absorbe. Bu yöntem, enzim katalizi ölçmek için kullanılabilir. Bu yazıda, enstrümantal kurulumu için protokol, deneme çalışan ve veri analizi genel olarak anlatılmıştır, ve jack fasulye üreazla enzimatik üre hidroliz karakterizasyonu uygulanır.

Sıcak Biyolojik kataliz: İzotermal Titrasyon Kalorimetre enzimatik reaksiyonların Characterize

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

hot-biological-catalysis-isothermal-titration-calorimetry-to

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Organic Chemistry

Chemistry

Unit 1

Thermochemistry

Thermodynamics and Chemical Kinetics

SCIENTISTS IN ACTION

20.4K Görüntüleme.  University of Bologna.  Izotermal titrasyon kalorimetre önlemler ısı akışı serbest veya kimyasal reaksiyonlarda absorbe. Bu yöntem, enzim katalizi ölçmek için kullanılabilir. Bu yazıda, enstrümantal kurulumu için protokol, deneme çalışan ve veri analizi genel olarak anlatılmıştır, ve jack fasulye üreazla enzimatik üre hidroliz karakterizasyonu uygulanır. 

Video: Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Preparation of Silica Nanoparticles Through Microwave-assisted Acid-catalysis

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle diameters ranging from 30-250 nm by varying the reaction conditions. Through the selection of a microwave compatible solvent, silicic acid precursor, catalyst, and microwave irradiation time, these microwave-assisted methods were capable of overcoming the previously reported shortcomings associated with synthesis of silica nanoparticles using microwave reactors. The siloxane precursor was hydrolyzed using the acid catalyst, HCl. Acetone, a low-tan &#948; solvent, mediates the condensation reactions and has minimal interaction with the electromagnetic field. Condensation reactions begin when the silicic acid precursor couples with the microwave radiation, leading to silica nanoparticle sol formation. The silica nanoparticles were characterized by dynamic light scattering data and scanning electron microscopy, which show the materials&#39; morphology and size to be dependent on the reaction conditions. Microwave-assisted reactions produce silica nanoparticles with roughened textured surfaces that are atypical for silica sols produced by St&#246;ber&#39;s methods, which have smooth surfaces.

Silica nanoparticles were prepared using acid-catalysis of a siloxane precursor and microwave-assisted synthetic techniques resulting in the controlled growth of nanomaterials ranging from 30-250 nm in diameter. The growth dynamics can be controlled by varying the initial silicic acid concentration, time of the reaction, and temperature of reaction.

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle ...

Kimya

Retropinacol/Cross-pinacol Coupling Reactions - A Catalytic Access to 1,2-Unsymmetrical Diols

Unsymmetrical 1,2-diols are hardly accessible by reductive pinacol coupling processes. A successful execution of such a transformation is bound to a clear recognition and strict differentiation of two similar carbonyl compounds (aldehydes &#8594; secondary 1,2-diols or ketones &#8594; tertiary 1,2-diols). This fine-tuning is still a challenge and an unsolved problem for an organic chemist. There exist several reports on successful execution of this transformation but they cannot be generalized. Herein we describe a catalytic direct pinacol coupling process which proceeds via a retropinacol/cross-pinacol coupling sequence. Thus, unsymmetrical substituted 1,2-diols can be accessed with almost quantitative yields by means of an&#160;operationally simple performance under very mild conditions. Artificial techniques, such as syringe-pump techniques or delayed additions of reactants are not necessary. The procedure we describe provides a very rapid access to cross-pinacol products (1,2-diols, vicinal diols). A further extension of this new process, e.g. an enantioselective performance could provide a very useful tool for the synthesis of unsymmetrical chiral 1,2-diols.

A novel account for the synthesis of unsymmetrical 1,2-diols based on a retropinacol/cross-pinacol coupling mechanism is described. Due to the catalytic execution of this reaction a considerable improvement compared to conventional cross-pinacol couplings is achieved.

Retropinacol / Çapraz pinakol Kavrama Reaksiyonları - 1,2-Asimetrik Diollerin A Katalitik Erişim

Unsymmetrical 1,2-diols are hardly accessible by reductive pinacol coupling processes. A successful execution of such a transformation is bound to a clear ...

Mizoroki-Heck Cross-coupling Reactions Catalyzed by Dichloro{bis[1,1',1''-(phosphinetriyl)tripiperidine]}palladium Under Mild Reaction Conditions

Dichloro-bis(aminophosphine) complexes of palladium with the general formula of [(P{(NC5H10)3-n(C6H11)n})2Pd(Cl)2] (where n = 0-2), belong to a new family of easy accessible, very cheap, and air stable, but highly active and universally applicable C-C cross-coupling catalysts with an excellent functional group tolerance. Dichloro{bis[1,1',1''-(phosphinetriyl)tripiperidine]}palladium [(P(NC5H10)3)2Pd(Cl)2] (1), the least stable complex within this series towards protons; e.g. in the form of water, allows an eased nanoparticle formation and hence, proved to be the most active Heck catalyst within this series at 100 &#176;C and is a very rare example of an effective and versatile catalyst system that efficiently operates under mild reaction conditions. Rapid and complete catalyst degradation under work-up conditions into phosphonates, piperidinium salts and other, palladium-containing decomposition products assure an easy separation of the coupling products from catalyst and ligands. The facile, cheap, and rapid synthesis of 1,1',1"-(phosphinetriyl)tripiperidine and 1 respectively, the simple and convenient use as well as its excellent catalytic performance in the Heck reaction at 100 &#176;C make 1 to one of the most attractive and greenest Heck catalysts available.
We provide here the visualized protocols for the ligand and catalyst syntheses as well as the reaction protocol for Heck reactions performed at 10 mmol scale at 100 &#176;C and show that this catalyst is suitable for its use in organic syntheses.

Mizoroki-Heck Cross-coupling Reactions Catalyzed by Dichloro{bis[1,1&#039;,1&#039;&#039;-phosphinetriyltripiperidine]}palladium Under Mild Reaction Conditions

Dichloro{bis[1,1',1''-(phosphinetriyl)tripiperidine]}palladium [(P(NC5H10)3)2Pd(Cl)2] (1) is an easy accessible, cheap, and air stable, but highly active Heck catalyst with an excellent functional group tolerance that efficiently operates under mild reaction conditions to give the coupling products in very high yields.

Hafif reaksiyon koşulları altında paladyum - Dikloro {bis [(phosphinetriyl) tripiperidine 1,1 &#39;, 1&#39;&#39;]} katalize Mizoroki-Heck Çapraz bağlama reaksiyonları

Dichloro-bis(aminophosphine) complexes of palladium with the general formula of [(P{(NC5H10)3-n(C6H11)n})2Pd(Cl)2] (where n = 0-2), belong to a new family ...

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. Recycling of the electron donors NADH or NADPH requires the use of additional enzymes and sacrificial substrates. Interestingly, several oxidoreductases accept hydrogen peroxide as electron donor. While being inexpensive, this reagent often reduces the stability of enzymes. A solution to this problem is the in situ generation of the cofactor. The continuous supply of the cofactor at low concentration drives the reaction without impairing enzyme stability. This paper demonstrates a method for the light-catalyzed in situ generation of hydrogen peroxide with the example of the heme-dependent fatty acid decarboxylase OleTJE. The fatty acid decarboxylase OleTJE was discovered due to its unique ability to produce long-chain 1-alkenes from fatty acids, a hitherto unknown enzymatic reaction. 1-alkenes are widely used additives for plasticizers and lubricants. OleTJE has been shown to accept electrons from hydrogen peroxide for the oxidative decarboxylation. While addition of hydrogen peroxide damages the enzyme and results in low yields, in situ generation of the cofactor circumvents this problem. The photobiocatalytic system shows clear advantages regarding enzyme activity and yield, resulting in a simple and efficient system for fatty acid decarboxylation.

We describe a protocol for the light-catalyzed generation of hydrogen peroxide &#8212; a cofactor for oxidative transformations.

Işık odaklı enzimatik dekarboksilasyonu

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of metabolic transformations. Hyperpolarization via dissolution DNP circumvents part of the sensitivity issues thanks to the large out-of-equilibrium nuclear magnetization stemming from the electron-to-nucleus spin polarization transfer. The high NMR signal obtained can be used to monitor chemical reactions in real time. The downside of hyperpolarized NMR resides in the limited time window available for signal acquisition, which is usually on the order of the nuclear spin longitudinal relaxation time constant, T1, or, in favorable cases, on the order of the relaxation time constant associated with the singlet-state of coupled nuclei, TLLS. Cellular uptake of endogenous molecules and metabolic rates can provide essential information on tumor development and drug response. Numerous previous hyperpolarized NMR studies have demonstrated the relevancy of pyruvate as a metabolic substrate for monitoring enzymatic activity in vivo. This work provides a detailed description of the experimental setup and methods required for the study of enzymatic reactions, in particular the pyruvate-to-lactate conversion rate in presence of lactate dehydrogenase (LDH), by hyperpolarized NMR.

The sensitivity enhancement provided by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) enables following metabolic processes in real time by NMR and MRI. The characteristics and performances of a dedicated dissolution DNP setup designed for study enzymatic reactions are discussed.

NMR ile Gerçek zamanlı enzimatik Reaksiyon Hızı Ölçümleri için çözünme Dinamik Nükleer Polarizasyon Aletler

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

A Protocol for Safe Lithiation Reactions Using Organolithium Reagents

Organolithium reagents are powerful tools in the synthetic chemist&#39;s toolbox. However, the extreme pyrophoric nature of the most reactive reagents warrants proper technique, thorough training, and proper personal protective equipment. To aid in the training of researchers using organolithium reagents, a thorough, step-by-step protocol for the safe and effective use of tert-butyllithium on an inert gas line or within a glovebox is described. As a model reaction, preparation of lithium tert-butyl amide by the reaction of tert-butyl amine with one equivalent of tert-butyl lithium is presented.

The safe and proper use of organolithium reagents is described.

Organolityum Reaktifleri kullanarak Güvenli litiasyon Reaksiyonlar için Protokol

Organolithium reagents are powerful tools in the synthetic chemist&#39;s toolbox. However, the extreme pyrophoric nature of the most reactive reagents ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. Their synthesis by conventional organic chemistry often requires tedious multi-step synthesis processes, with difficult control of the stereochemical outcome. We present a protocol to enzymatically synthetize amino alcohols starting from the readily available L-lysine in 48 h. This protocol combines two chemical reactions that are very difficult to conduct by conventional organic synthesis. In the first step, the regio- and diastereoselective oxidation of an unactivated C-H bond of the lysine side-chain is catalyzed by a dioxygenase; a second regio- and diastereoselective oxidation catalyzed by a regiodivergent dioxygenase can lead to the formation of the 1,2-diols. In the last step, the carboxylic group of the alpha amino acid is cleaved by a pyridoxal-phosphate (PLP) decarboxylase (DC). This decarboxylative step only affects the alpha carbon of the amino acid, retaining the hydroxy-substituted stereogenic center in a beta/gamma position. The resulting amino alcohols are therefore optically enriched. The protocol was successfully applied to the semipreparative-scale synthesis of four amino alcohols. Monitoring of the reactions was conducted by high performance liquid chromatography (HPLC) after derivatization by 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Straightforward purification by solid-phase extraction (SPE) afforded the amino alcohols with excellent yields (93% to &#62;95%).

Chiral amino alcohols are versatile molecules for use as scaffolds in organic synthesis. Starting from L-lysine, we synthesize amino alcohols by an enzymatic cascade reaction combining diastereoselective C-H oxidation catalyzed by dioxygenase followed by cleavage of the carboxylic acid moiety of the corresponding hydroxyl amino acid by a decarboxylase.

Enzimatik Cascade reaksiyonlardan L-lizin Amino kiral alkoller sentezi için

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

Employing Pressurized Hot Water Extraction (PHWE) to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory

A recently developed pressurized hot water extraction (PHWE) method which utilizes an unmodified household espresso machine to facilitate natural products research has also found applications as an effective teaching tool. Specifically, this technique has been used to introduce second- and third-year undergraduates to aspects of natural products chemistry in the laboratory. In this report, two experiments are presented: the PHWE of eugenol and acetyleugenol from cloves and the PHWE of seselin and (+)-epoxysuberosin from the endemic Australian plant species Correa reflexa. By employing PHWE in these experiments, the crude clove extract, enriched in eugenol and acetyleugenol, was obtained in 4-9% w/w from cloves by second-year undergraduates and seselin and (+)-epoxysuberosin were isolated in yields of up to 1.1% w/w and 0.9% w/w from C. reflexa by third-year students. The former exercise was developed as a replacement for the traditional steam distillation experiment providing an introduction to extraction and separation techniques, while the latter activity featured guided-inquiry teaching methods in an effort to simulate natural products bioprospecting. This primarily derives from the rapid nature of this PHWE technique relative to traditional extraction methods that are often incompatible with the time constraints associated with undergraduate laboratory experiments. This rapid and practical PHWE method can be used to efficiently isolate various classes of organic molecules from a range of plant species. The complementary nature of this technique relative to more traditional methods has also been demonstrated previously.

Employing Pressurized Hot Water Extraction PHWE to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory

Here, we employ a pressurized hot water extraction (PHWE) method, which utilizes an unmodified household espresso machine to introduce undergraduates to natural products chemistry in the laboratory. Two experiments are presented: PHWE of eugenol and acetyleugenol from cloves and PHWE of seselin and (+)-epoxysuberosin from the Australian plant Correa reflexa.

Basınçlı sıcak su ayıklama (PHWE) doğal ürünler Kimya Lisans Laboratuvarı keşfetmek için istihdam

A recently developed pressurized hot water extraction (PHWE) method which utilizes an unmodified household espresso machine to facilitate natural products ...

Imine Metathesis by Silica-Supported Catalysts Using the Methodology of Surface Organometallic Chemistry

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared according to the methodology developed by surface organometallic chemistry (SOMC). In this framework, catalytic cycles can be determined by isolating crucial intermediates. All air-sensitive materials are handled under inert atmosphere (using gloveboxes or a Schlenk line) or high vacuum lines (HVLs, &#60;10-5 mbar). The preparation of SiO2-700 (silica dehydroxylated at 700 &#176;C) and subsequent applications (the grafting of complexes and catalytic runs) requires the use of HVLs and double-Schlenk techniques. Several well-known characterization methods are used, such as Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR), elemental microanalysis, solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy (SSNMR), and state-of-the-art dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy (DNP-SENS). FTIR and elemental microanalysis permit scientists to establish the grafting and its stoichiometry. 1H and 13C SSNMR allows the structural determination of the hydrocarbon ligands coordination sphere. DNP SENS is an emerging powerful technique in solid characterization for the detection of poorly sensitive nuclei (15N, in our case). SiO2-700 is treated with about one equivalent of the metal precursor compared to the amount of surface silanol (0.30 mmol&#183;g-1) in pentane at room temperature. Then, volatiles are removed, and the powder samples are dried under dynamic high vacuum to afford the desired materials [(&#8801;Si-O-)Hf(&#951;2&#960;-MeNCH2)(&#951;1-NMe2)(&#951;1-HNMe2)]. After a thermal treatment under high vacuum, the grafted complex is converted into metal imido silica complex [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)]. [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] effectively promotes the metathesis of imines, using the combination of two imine substrates, N-(4-phenylbenzylidene)benzylamine, or N-(4-fluorobenzylidene)-4-fluoroaniline, with N-benzylidenetert-butylamine as substrates. A significantly lower conversion is observed with the blank runs; thus, the presence of the imido group in [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is correlated to the catalytic performance.

A new group IV metal catalyst for imine metathesis is prepared by grafting amine metal complex onto dehydroxylated silica. Surface metal fragments are characterized using FT-IR, elemental microanalysis, and solid-state NMR spectroscopy. Further dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy experiments complement the determination of the coordination sphere.

Yüzey Organometalik Kimya metodolojisini kullanan Silika Destekli Katalizörler tarafından Imine Metatez

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared ...

A Microwave-Assisted Direct Heteroarylation of Ketones Using Transition Metal Catalysis

Heteroarylation introduces heteroaryl fragments to organic molecules. Despite the numerous available reactions reported for arylation via transition metal catalysis, the literature on direct heteroarylation is scarce. The presence of heteroatoms such as nitrogen, sulfur and oxygen often make heteroarylation a challenging research field due to catalyst poisoning, product decomposition and the rest. This protocol details a highly efficient direct &#945;-C(sp3) heteroarylation of ketones under microwave irradiation. Key factors for successful heteroarylation include the use of XPhos Palladacycle Gen. 4 Catalyst, excess base to suppress side reactions and the high temperature and pressure achieved in a sealed reaction vial under microwave irradiation. The heteroarylation compounds prepared by this method were fully characterized by proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H NMR), carbon nuclear magnetic resonance spectroscopy (13C NMR) and high-resolution mass spectrometry (HRMS). This methodology has several advantages over literature precedents including broad substrate scope, rapid reaction time, greener procedure and operational simplicity by eliminating the preparation of intermediates such as silyl enol ether. Possible applications for this protocol include, but are not limited to, diversity-oriented synthesis for the discovery of biologically active small molecules, domino synthesis for the preparation of natural products and ligand development for new transition metal catalytic systems.

Heteroaryl compounds are important molecules utilized in organic synthesis, medicinal and biological chemistry. A microwave-assisted heteroarylation using palladium catalysis provides a rapid and efficient method to attach heteroaryl moieties directly to ketone substrates.

Geçiş Metal Kataliz Kullanarak Ketonların Mikrodalga Destekli Doğrudan Heteroarylasyon

Heteroarylation introduces heteroaryl fragments to organic molecules. Despite the numerous available reactions reported for arylation via transition metal ...