The authors would like to thank all the members of the "Insect Genetics and Genomics" Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE" (FS).

1. Deney Seti-up <ol><li> insectary gereksinimler <ol><li> Tüm C. bakımı capitata ömrü 25 ° C,% 65 nem ve 12/12 saat aydınlık / karanlık fotoperiyot de aşamaları. </li><li> Bir 6 L kafes yaklaşık 1,500-2,000 medfly pupa yerleştirin. Ovipozisyon 42 uyarmak için yeterince küçük delikleri olan bir tarafında örgü pirinç ile bir kafes kullanın. kılcal hareket aracılığı ile su ile sinekler sağlamak Cage tabanında küçük bir açıklıktan sünger şerit yerleştirin. Yetişkinler (Şekil 1A) için besin kaynağı olarak maya ve şeker (1:10) bir karışımı kullanın. maya miktarını artırmak (1&#39;e kadar: Şeker: 3, maya) kadın yumurtalarını bırakmak için başarısız gerekir. </li><li> ağ üzerinden yatırılan yumurtaları toplamak için kafesinin altında su ile dolu bir tabak koyun. bakire kadın yumurtlamaya gibi sinekler Mikroenjeksiyon deneyleri için yumurta toplama önce en az 6-7 gün eski kadar bekleyin. Bu kadın evlendirilen olacaktır sağlayacaktırve yumurta döllenmiş olacağı. </li><li> ince, net süzgeç ile suyun süzülmesi ile yumurta toplamak. Standart Konukçu (1.5 LH 2, O, 100 mi HCI,% 1 ihtiva eden bir plastik kutu içinde süzgeçten yumurta transferi geniş spektrumlu antimikrobiyal madde 50 mi etanol içinde eritildi, 5 g, 400 g şeker, 175 g minerali giderilmiş bira mayası, 1 Pasteur pipeti kullanarak) yumuşak buğday kepeği kg. </li><li> Hava sirkülasyonuna izin vermek için net kapakla kapatılmış saydam bir kap içinde her kutuyu yerleştirin ve kepek tabakası içeren pupa devresi (Şekil 1B) lehine. </li><li> Yaklaşık 10 gün sonra, larva gıda ortaya ve pupa devresi için kepek tabakası içine aşağı atlamak 3. instar larvaları kontrol edin. </li><li> 24 saat sonra, yumuşak bir fırça kullanarak küçük bir fincan pupa toplamak ve yeni bir yetişkin kafesine aktarabilirsiniz. Yetişkinler normalde 10 gün gelmesine sonra ortaya çıkar. Gelişmekte olan sinek ptilinum, th üzerinde kendi kafasına bulunan bir şişme cebi kullanırantenleri e tabanı, puparium sonuna kapalı zorlamak için. Çıkması sonrasında, ptilinum kalıcı geri kafasının içinde çöker. </li></ol></li><li> Microinjected larvalar için 1 L gıda hazırlanması <ol><li> 300 mi H2O 2.5 g agar çözülür </li><li> Sıcak 500 ml H 2 sıcak karıştırma plaka üzerinde Ç ve 4 g Sodyum benzoat çözülür, 4.5 ml% 37 HCI, 42 g maya özütü ve 115 gr kurutulmuş havuç tozu. </li><li> karışımına, 10 ml mutlak etanol içinde çözülmüş 2.86 g geniş spektrumlu antimikrobiyal elemanın bir solüsyonunu ilave edin. </li><li> Petri yuvarlak 15 cm orta dağıtın ve soğumaya bırakın. Gerekirse, 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> slayt hazırlama <ol><li> Bir mikroskop lamı (75 x 26 mm 2) çift taraflı bant 2 cm şerit yerleştirin ve bir çini işaretleyici ile kenarları işaretleyin, petrol yayılmasını ve enjekte edilen embriyoların sonucu kuruma önlemek için. </li></ol></li><li><stRong&gt; Nükleik Asit Hazırlama <ol><li> Ticari olarak temin edilebilen kitler 34 kullanılarak plazmid DNA izole edin. etanol kullanılarak plazmid çökelti ve arzu edilen konsantrasyonda, enjeksiyon tamponu (0.1 mM fosfat tamponu pH 7.4, 5 mM KCI) &#39;de yeniden askıya. </li><li> Fenol-kloroform kullanılarak uzun dsRNA sentezlenmiş in vitro arındırmak, izopropanol kullanarak çöktürmek ve enjeksiyon tamponu 43 yeniden askıya. </li></ol></li></ol> 2. Embriyo Hazırlık <ol><li> 6-7 günlük yetişkin ihtiva eden bir kafes altında su ile dolu bir tepsiye yerleştirin. </li><li> kadın 30 dakika boyunca yumurtlamaya ve daha sonra ince bir süzgeç kullanarak suyun filtre embriyolar toplamak için izin verin. Her zaman embriyoların kuruma önlemek için suda süzgeç tutun. </li><li> ticari% 50 çamaşır suyu çözeltisi içinde 5 saniye boyunca süzgeç yükselmekte tarafından embriyolar Dechorionate. </li><li> art arda en az (temiz ultra saf suda süzgecin yükselmekte dikkatle embriyolar yıkayın4-5 kez). Son olarak, temiz ultra saf suya süzgeç yerleştirin. Maksimum 2 saat içinde embriyolar kullanın. NOT: Mikroenjeksiyon zamanlaması önce Hücreselleştirmeden nükleer bölünmelerin bir aşamasında, ön blastoderm embriyolar içine enjekte etmek gerekliliği ile ilgilidir. Bu enjekte DNA alınması-up gereken çekirdeklerin içine özellikle gamet kaynaklı olacak primordial germ hücre çekirdekleri içine sağlar. Medfly Hücreselleştirmeden 9 ve 12 saat 45,46 arasında yer alır, oysa Drosophila, kutup hücre Hücreselleştirmeden, blastoderm oluşumu yaklaşık 30 dakika, daha sonra 44 meydana gelen döllenmeden sonra yaklaşık 90 dakika ile (25 ° C&#39;de), başlar. </li><li> Satır Embriyo yönelimi <ol><li> ince bir fırça kullanarak, yaklaşık 50 embriyo toplamak ve su ile ıslatılmış siyah filtre kağıdı bir disk üzerine koyun. </li><li> Diseksiyon stereomikroskop altında, çift taraflı bant üst yüzeyi üzerine üst üste embriyolar düzenlemekince bir fırça (000) kullanılarak mikroskop lamı (Şekil 1C). NOT: Enjeksiyon germ-line köken olacak arka kutupta, yapılır gibi tüm aynı yönde embriyolar hizalayın; arka kutup mikropil bölgeye tersidir. </li><li> klorotrifloroetilen yağı tabakası yağı çin işaretleyici sınırları (1.3 bakınız) dökmek değil emin olan embriyolar örtün. Not: yağ embriyolar kapak, önce bir başka aşama gerçekleştirilebilir: embriyolar sıvı içeriğini azaltmak ve böylece enjekte DNA çözeltisi girişini kolaylaştırmak için bir kaç dakika için kurutulmuş olabilir. Bu yüksek bir sıvı basıncının bir sonucu olarak, enjeksiyon ya da enjekte çözeltinin aşırı sızıntıya sırasında embriyonun patlama önlemeye yardımcı olabilir. </li></ol></li></ol> 3. Embriyo Mikroenjeksiyon <ol><li> plazmid DNA ya da bir mikropipet kullanılarak dsRNA çözeltisi (1-2 ug / ul) ile bir iğne (1-2 ul) doldurun. </li><li&gt; Enjeksiyon süresi (0.5 sn) kontrol mikroenjeksiyon aparatı, iğne bağlayın basıncı (800 hPa) ve karşı basınç (150 hPa). </li><li> Iğne (Şekil 1D) hareketlerini kontrol etmek için bir mikro manipülatörün kullanılması, bir stereo mikroskop altında mikroenjeksiyon gerçekleştirin. slayt taşımak için mikroskop sahne kullanın. <ol><li> kapsam sahnede slayt yerleştirin. </li><li> Embriyo (Şekil 1E) arka kutupta içine iğne ucu yerleştirin. </li><li> pedalıyla mikroenjeksiyon sistemini aktive ederek çözüm enjekte edilir. püskürtülen sıvı embriyo hafif harekete yol açar, iç basınç bir artışa neden olur. </li><li> hemen pedalını ve bırakın, ama nazikçe, embriyo iğne çıkarılır. </li><li> Enjeksiyon yerinde biraz sitoplazmik kaçağı gözlemleyin. NOT: nedeniyle mikroenjeksiyon pro DNA / dsRNA / siRNA ve mortalite potansiyel öldürücü etkileri arasında ayrım yapmak içinkendisi mıknatıslarından çıkan, kontrol deneyleri gerçekleştirilmelidir. Bu karşıt genetik deneylerde durumunda, sadece tampon enjeksiyon içerir, ya da bir yeşil fluoresan protein (GFP) iki-şeritli RNA (dsRNA GFP) veya siRNA -türevli. </li></ol></li><li> Enjeksiyon, 25 ° C&#39;de inkübe embriyolar sonra. </li></ol> 4. Post-enjeksiyon İşlemleri <ol><li> İki gün enjeksiyonundan sonra, bir stereo mikroskop altında yumurtadan larva (Şekil 1F) için slaytlar kontrol edin. Larvalar yağda hareket ama en kısa sürede larva gıda transfer edilmesi gerekir olabilir. Bu nedenle, bir gün slaytlar birkaç kez kontrol edin. </li><li> ince bir fırça (000) kullanarak, yavaşça havuç tabanlı larva gıda yumurtadan larva transferi. Her bir Petri kabı başına 200 larva en fazla aktarın. </li><li> % 65 nem (25 ° C) larvaları kuluçkaya yatmaktadır. Kapak hava değişimi zarar, çanak yapışmaz emin olun. </li><li> Kapaklı Petri kapları tutmaklarvalara hava akımı hala böylece çoğunlukla kapattı. Aşırı kurumayı önlemek günlük yemekler kontrol etmek ve gerekirse, buharlaşma telafi etmek için su ekleyin. </li><li> net-kapakla kapatılmış bir açık kapta Petri kapları yerleştirin ve kepek tabakası içeren gelmesine lehine. Rutin insectary yetiştiriciliği için olduğu gibi, 3. instar larvaları larva gıda dışında atlama ve kepek pupa. </li><li> (Bu Nesil 0, G0 olan) pupa toplamak ve yetişkin yetiştirme ve tarama için küçük bir kafese koyun. Arka standart larva gıda döl. </li><li> Enjekte bireyler genellikle kimeralardır olarak germ-line dönüştürme deneylerinde durumunda, bir sonraki nesilde mümkün dönüştürülmüş bireyler (G1) kontrol edin. Transpozisyon olaylar, gerçekten de, mikrop hattı ya da soma da oluşturacak embriyonik Sinsityum çekirdekleri, herhangi meydana gelmiş olabilir. <ol><li> Kısa bir süre sonra ortaya çıkması, CO 2 kullanılarak G1 bireyleri uyutmak ve transf kontrolBir Epifloresans stereomicroscope altında ormation olaylar. ise yeşil floresan ekranına EYFP filtre kullanmak (.. EMM 535/30 Dahili 500/20); (EMM 605/75.. Dahili 546/12) kırmızı floresan varlığında taranması için, DsRedwide filtre kullanın . </li><li> karşı cinsten vahşi tip yetişkin ile küçük bir kafes içinde dönüştürülmüş bireyleri yerleştirin ve yeni, başlangıçta heterozigot, gerginlik kaynaklanır. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Böcek embriyolar nükleik asitlerin mikro enjeksiyonu gen fonksiyonu ve biyo teknolojik uygulamalarda analizi hem de kolaylaştırır evrensel bir tekniktir. böcek türlerinin artan sayıda genom dizilerinin yakın zamanlı henüz bilinmeyen fonksiyonun genlerin fonksiyonel karakterizasyonu için araçlar için acil bir ihtiyaca yol açar. RNA enterferans moleküler fonksiyonları 49 anlaması için en değerli yöntemlerden biri olduğu kanıtlanmıştır ve embriyo mikroenjeks...

Akdeniz meyve sineği (medfly) Ceratitis capitata kozmopolit bir tür yaygın zarar meyve ve ekili bitkileri olduğunu. Bu tür genera Bactrocera ve Anastrepha ait olanlar gibi bazı böcek türleri içerir Tephritidae ailesine aittir. Medfly Bu ailenin en çok çalışılan türler olduğunu ve böcek istilaları 1 çalışma için değil, aynı zamanda zararlı yönetimi stratejileri 2 optimize etmek için değil, sadece bir model haline gelmiştir. Medfly 300&#39;den fazla vahşi türler ve ekili bitkiler 3,4 saldırabilir bir multivoltine türdür. hasar yetişkin ve larva aşamaları hem kaynaklanır: çiftleşen dişiler mikroorganizmalar ticari kalitesini etkileyecek izin yumurtlama için meyve yüzeyini delip, pestil üzerinde larva besleme oysa. Üç larva aşamasından sonra, larvalar konak ortaya ve toprağa pupa. Ceratitiscapitata Afrika, Orta Doğu, Batı Avustralya, Orta ve Güney Amerika, Avrupa ve Amerika Birleşik Devletleri 5 alanlar dahil olmak üzere neredeyse tüm dünyada dağıtımı görüntüler. En yaygın stratejiler medfly enfestasyonlar insektisit kullanımını içerir sınırlamak için (örneğin, Malathion, Spinosad) ve çevre dostu Steril Böcek Tekniği (SIT) 6. İkinci yaklaşım, radyoterapi iyonizan maruz steril hale erkeklerin yüz binlerce vahşi serbest bırakılmasını gerektirir. Yabani dişilere, sterilize erkeklerin birleşme en sonunda ortadan kaldırılması neden popülasyon boyutu bir azalmaya neden hiçbir döl sonuçlanır. SIT dünya çapında birden fazla kampanya etkili olduğu kanıtlanmıştır rağmen, onun büyük dezavantajları yetiştirme ve tahliye edilecek böcekler milyonlarca sterilizasyon yüksek maliyetleri içerir. serbest bireylerin işaretleme sırasında alanda yakalanan yabani böcekler steril ayırmak gerekirfaaliyetlerinin izlenmesi ve şu anda floresan tozu kullanılarak elde edilir. Bu prosedürler, yüksek maliyetli ve istenmeyen yan etkileri 7 vardır. sipariş optimize etmek ve / veya bu zararlının kontrolünde daha etkili yaklaşımlar geliştirmek için, medfly biyoloji ve genetik yaygın olarak dünya çapında sayısız araştırmacılar tarafından incelenmiştir. Medfly genom dizisinin 8,9 kullanılabilirliği, gen fonksiyonları üzerinde yeni araştırmalar kolaylaştıracaktır. RNA interferans gibi çalışmalar için güçlü bir araç olup, dsRNA (çift zincirli RNA) veya siRNA&#39;nın (küçük müdahale edici RNA) mikroenjeksiyon yoluyla elde edilebilir. Bu teknik göstermek için, örneğin, kullanılmış olduğunu C cinsiyet tespiti moleküler kaskad capitata kısmen Drosophila 10&#39;dakine göre muhafaza edilir. Protokollerin geliştirilmesi C. izin medfly embriyolar Microinject için capitata olmayan ilk olmak-Drosophilid Sinek türleri genetiği değiştirilmiş olması. Bunu yumurta 11 kuruma hem morfolojik ve direnç açısından, Drosophila benzer olduğu için, protokol önce D. geliştirilmiş ön blastoderm embriyolara plazmid DNA teslim melanogaster 12,13 Başlangıçta C. kullanım için uyarlanmıştır capitata. Bu ilk deneyler transpoze edilebilir elemanın Minos 11 göre medfly germ çizgili transformasyon sağladı. Daha sonra, özgün sistem diğer transpozon tabanlı yaklaşımlar kullanılarak 14 modifiye edildi. Bu Lepidoptera Trichoplusia ni 15 den piggyBac durumdur. Protokol beri daha da optimize edilmiştir ve bu diğer birçok Diptera 22-31 de diğer tephritid türlerinin 16-21 dönüşümü ve izin verdi. Bütün bu sistemler tipik bir ikili vektör / yardımcı plazmid dönüşüm sistemi kullanımına dayanmaktadır: Yapay arızalı transpoİstenen genleri içeren oğulları plasmid DNA içine monte transposaz enzimi 32 tedarik böcek genomuna entegre edilir. Transgenik medfly çizgilerin bir dizi doğruluğunu geliştirmek olabilir, floresan sperm ile suşlar erkek sadece döl üreten ve böylece ilave cinsiyet tayini stratejilerini gerektirmeyen ve suşları, ölümcül uyaran bir koşullu dominant letal geni taşıyan suşlar dahil birden çok özellik ile oluşturulan edilmiştir SİT izleme aşamasında 33-37 arasında. Transgenik organizmaların vahşi salma sivrisinekler, sadece 38,39 karşı Pilot testlerinde meydana gelse de, en az bir adet işletme alanı 40 kullanımları için transgenik medfly bir çok suş veya değerlendirmektedir. Embriyo mikroenjeksiyon ayrıca (CR gibi transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazların (Talens), kümelenmiş düzenli interspaced kısa yineleyen tekrarlar gibi yeni genom düzenleme araçları, gelişimini desteklemek içinISPR) / CRISPR ilişkili protein 9 nükleaz (Cas9) ve yeni evrimsel ve gelişimsel çalışmaları sağlayacak, hem de mevcut biyoteknolojik araç kutusu genişleyen olacak homing endonükleaz genler (HEGs). Genom düzenleme yaklaşımları zaten sivrisinekler 41 gen-sürücü sistemleri nesil izin ve medfly onların transferi yakındır. Burada her şeyden önce bahsedilen uygulamalarda yararlı olabilir medfly embriyolar nükleik asitlerin microinjecting için evrensel bir protokol açıklar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="791">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1 x injection Buffer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Buffer</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5mM KCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Construct Plasmid</td>
			<td style="width:107px;">DNA</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Helper Plasmid</td>
			<td style="width:107px;">DNA</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dsRNA</td>
			<td style="width:107px;">RNA</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">Phenol-Chloroform purified</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Standard Larval food</td>
			<td style="width:107px;">Rearing Food&#160;</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products&#160; dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer&#8217;s yeast, 1 kg soft wheat bran</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Carrot Larval Food</td>
			<td style="width:107px;">Rearing food</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">2.5 g Agar, 4 g Sodium Benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adult Food</td>
			<td style="width:107px;">Rearing food</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>yeast extract and sugar (1:10)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z692247</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Injection needles&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">5242956000</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloaders</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">5242956003</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Double slided tape</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Whatman Black circle paper</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bleach</td>
			<td style="width:107px;">Generic reagent</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">Diluite 1:2 before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paintbrush (000)</td>
			<td style="width:107px;">Generic tool</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:107px;">Instrument</td>
			<td style="width:93px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">MN-153</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjector</td>
			<td style="width:107px;">Instrument</td>
			<td style="width:93px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Femtojet</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adult cages</td>
			<td style="width:107px;">Generic tool</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Halocarbon oil 700</td>
			<td style="width:107px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H8898</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ceratitis capitata</td>
			<td style="width:107px;">Animal</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">The strain used is ISPRA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of nucleic acids through embryo microinjection in the worldwide agricultural pest insect, ceratitis capitata

Akdeniz meyve sineği (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) son derece yüksek tarımsal alaka ile bir haşere türüdür. Bu, üreme davranışları nedeniyle: Onlar yumurta ve hamuru üzerinde yumurtadan larva yemi yatıyordu zaman kadın meyve ve sebzelerin dış yüzeyine zarar. Vahşi C. capitata popülasyonları geleneksel püskürtme ve / veya çevre dostu yaklaşımlar, en başarılı Steril Böcek Tekniği (SIT) olmak insektisit ile kontrol edilir. SIT kitle yetiştirme, radyasyon bazlı sterilizasyon ve çiftleşmek için kapasitelerini korumak ama verimli döl üretmek mümkün değildir erkeklerin alan salınımı dayanır. gelişi ve birlikte medfly genom dizisinin durumu ile biyoteknolojik araçlar müteakip hızlı bir gelişme, bu türün biyolojisi anlayışımızı artırdı ölçüde olmuştur. Bu genom manipülasyon, ca için yeni stratejiler çoğalmasını tercihn nüfus kontrolü uygulanabilir. Bu bağlamda, embriyo mikroenjeksiyon medfly kontrolü için araç kutusunu genişleyen ikili bir rol oynar. Anahtar biyolojik süreçleri düzenleyen genlerin fonksiyonu ile müdahale yeteneği, gerçekten, medfly invaziv altında yatan moleküler makine anlayışımızı genişler. Bundan başka, tohum-hattı dönüşümü gerçekleştirmek için yeteneği, yeni SIT ayarları gelecek alan uygulamalar için test edilebilir çok sayıda transgenik soylarının üretilmesini kolaylaştırır. Gerçekten de, genetik manipülasyon, örneğin, alanda erkek steril performansını izlemek için kullanılabilir istenen özellikleri kazandırmak için kullanılabilir, ya da erken yaşam aşamalı öldürücülüğü neden olabilir. İşte bu iki temel hedeflere ulaşmak için medfly embriyolar içine nükleik asitlerin Microinject için bir yöntem açıklanmaktadır.

Burada sırasıyla ilgi genin işlevsel karakterizasyonu yönelik embriyo mikroenjeksiyon iki uygulama (Olgu 1) rapor ve transgenik suşlar nesil (Olgu 2) de. embriyoların içine dsRNA teslim gen fonksiyonunu çözülmeye. Innexin-5 geninin, böceklerde, erkek ve dişi gonadlar 43,47,48 spesifik olarak ifade edilen bir boşluk kavşak kodlar. ya...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata at JoVE.com

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

delivery-nucleic-acids-through-embryo-microinjection-worldwide

Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

8.9K Görüntüleme.  University of Pavia. The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Video: Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to particular habitats and management practices. This article shows how certain terroir signatures can be detected in the berry metabolome and transcriptome of the grapevine cultivar Corvina using multivariate statistical analysis. The method first requires an appropriate sampling plan. In this case study, a specific clone of the Corvina cultivar was selected to minimize genetic differences, and samples were collected from seven vineyards representing three different macro-zones during three different growing seasons. An untargeted LC-MS metabolomics approach is recommended due to its high sensitivity, accompanied by efficient data processing using MZmine software and a metabolite identification strategy based on fragmentation tree analysis. Comprehensive transcriptome analysis can be achieved using microarrays containing probes covering ~99% of all predicted grapevine genes, allowing the simultaneous analysis of all differentially expressed genes in the context of different terroirs. Finally, multivariate data analysis based on projection methods can be used to overcome the strong vintage-specific effect, allowing the metabolomics and transcriptomics data to be integrated and analyzed in detail to identify informative correlations.

This article describes the application of untargeted metabolomics, transcriptomics and multivariate statistical analysis to grape berry transcripts and metabolites in order to gain insight into the terroir concept, i.e., the impact of the environment on berry quality traits.

Üzüm Berry metabolomik ve transkriptomik aracılığıyla yorumlanır Terroir Kavramı

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Genetik

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Lazer destekli Hayvancılık Zigotlann Sitoplazmik Mikroenjeksiyon

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands for the recognition of RNA sequence and structure. Chemically modified Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers have been recently developed that can recognize RNA duplexes in a sequence-specific manner. PNAs are chemically stable with a neutral peptide-like backbone. PNAs can be synthesized relatively easily by the manual Boc-chemistry solid-phase peptide synthesis method. PNAs are purified by reverse-phase HPLC, followed by molecular weight characterization by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF). Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) technique facilitates the imaging of the triplex formation, because carefully designed free RNA duplex constructs and PNA bound triplexes often show different migration rates. Non-denaturing PAGE with ethidium bromide post staining is often an easy and informative technique for characterizing the binding affinities and specificities of PNA oligomers. Typically, multiple RNA hairpins or duplexes with single base pair mutations can be used to characterize PNA binding properties, such as binding affinities and specificities. 2-Aminopurine is an isomer of adenine (6-aminopurine); the 2-aminopurine fluorescence intensity is sensitive to local structural environment changes, and is suitable for the monitoring of triplex formation with the 2-aminopurine residue incorporated near the PNA binding site. 2-Aminopurine fluorescence titration can also be used to confirm the binding selectivity of modified PNAs towards targeted double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorbance-detected thermal melting experiments allow the measurement of the thermal stability of PNA-RNA duplexes and PNA&#183;RNA2 triplexes. Here, we describe the synthesis and purification of PNA oligomers incorporating modified residues, and describe biochemical and biophysical methods for characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs.

We report the protocols for the synthesis and purification of Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers incorporating modified residues. The biochemical and biophysical methods for the characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs are described.

Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell culture system. This system was developed to express foreign genes under the control of the baculoviral promoter in transient expression plasmids. Furthermore, this system can be applied to a functional assay of either the baculovirus itself or foreign proteins. The most widely and commercially available transient gene expression system is developed based on the immediate-early gene (IE) promoter of Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). However, a low expression level of foreign genes in insect cells was observed. Therefore, a transient gene expression system was constructed for improving protein expression. In this system, recombinant plasmids were constructed to contain the target sequence under the control of the Drosophila heat shock 70 (Dhsp70) promoter. This protocol presents the application of this heat shock-based pDHsp/V5-His (V5 epitope with 6 histidine)/Spodoptera frugiperda cell (sf9 cell) system; this system is available not only for gene expression but also for evaluating the anti-apoptotic activity of candidate proteins in insect cells. Furthermore, this system can be either transfected with one recombinant plasmid or co-transfected two potentially functionally antagonistic recombinant plasmids in insect cells. The protocol demonstrates the efficiency of this system and provides a practical case of this technique.

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

This protocol describes a heat shock-induced protein expression system (pDHsp/V5-His/sf9 cell system), which can be used for either expressing foreign proteins or evaluating the anti-apoptotic activity of potential foreign proteins and their truncated amino acids in insect cells.

Geçici ifade, yabancı genlerin Protein fonksiyonel tahlil için böcek hücrelerindeki (sf9)

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

Sitogenetik teknikle Bemisia tabaci yumurta döllenme oranı belirleme

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

Protein-Nüklik asit etkileşimlerini Incelemek için biotin etiketlerini kullanarak In vitro biyokimyasal asder

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the TILLING system has less applicability for insertion/deletion (Indel) detection and traditional TILLING needs more complex steps, like CEL I nuclease digestion and gel electrophoresis. To improve the throughput and selection efficiency, and to make the screening of both Indels and single base substitions (SBSs) possible, a new high-resolution melting (HRM)-based TILLING system is developed. Here, we present a detailed HRM-TILLING protocol and show its application in mutation screening. This method can analyze the mutations of PCR amplicons by measuring the denaturation of double-stranded DNA at high temperatures. HRM analysis is directly performed post-PCR without additional processing. Moreover, a simple, safe and fast (SSF) DNA extraction method is integrated with HRM-TILLING to identify both Indels and SBSs. Its simplicity, robustness and high throughput make it potentially useful for mutation scanning in rice and other crops.

In this article, we present the protocol that is described as high-resolution melting analysis (HRM)-based Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING). This method utilizes fluorescence changes during the melting of the DNA duplex and is suitable for high-throughput screening of both insertion/deletion (Indel) and single base substition (SBS).

Pirinç Bir TILLING Popülasyonyüksek Çözünürlükte Erime mutasyonları belirlenmesi

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

Filamentöz Ascomycete Huntiella omanensis'te CRISPR-Cas9 Aracılı Genom Düzenleme

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler