Bu protokol, fare submandibuler bezlerindeki sıkı endotel kavşaklarının işlevini değerlendirmek için in vivo parasellüler geçirgenlik tespit önlemini açıklamaktadır. Bununla birlikte, iki foton lazer tarama mikroskobu, sadece geleneksel konfokal mikroskopinin avantajına sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda daha derin doku ve görüntüyü daha net bir şekilde tespit etmek için de kullanılabilir. Bu deney, farklı dokuların vasküler geçirgenliğini, özellikle de hayvanların yüzey dokularını ve organlarını değerlendirmek için iyi bir yöntem ölçüsü sağlar.
Geçirgenlik testi için floresan sinyalleri arasındaki paraziti en aza indirmek için floresein, izotiyosiyanat, etiketli dekstran ve farklı uyarma emisyon spektrumlarına sahip dekstran etiketli Rhodamine B gibi uygun izleyicileri seçerek başlayın. İzleri steril fosfat tamponlu salin halinde mililitre stoklar başına 100 miligram halinde seyreltin ve ışıktan korunan alikotları eksi 20 santigrat derecede saklayın. 8 ila 10 haftalık erkek vahşi tip fareyi anestezi altına aldıktan sonra, göz küresinin bir tarafının hafifçe çıkıntı yapmasını sağlamak için farenin başını ve boynunu yavaşça tutun.
Gözün köşesi boyunca 100 mikrolitre floresan izleyici çözeltisi karışımı içeren bir insülin şırıngasını göze dik açıyla yerleştirin. Enjeksiyondan sonra, fareyi kartonun üzerine, uzuvları ve başı bantlanmış olarak sırtüstü pozisyonda hızlı bir şekilde yerleştirin. Submandibuler bez veya SMG izolasyonu için, stereoskopik mikroskop altında, SMG'lerin her iki tarafını da açığa çıkarmak için boynun epidermisini genel doku makası ile kesin.
Daha sonra, bez dokusuna, kan damarlarına ve glandüler yapıya zarar vermeden kapsülü bez yüzeyinden nazikçe ayırmak için künt bir doku ayırma iğnesi kullanın. Özelleştirilmiş tutucuyu negatif basınç cihazına bağlayın ve negatif basınç etkisinin önceden uygun şekilde elde edilip edilmediğini kontrol edin. Açıkta kalan SMG'yi özelleştirilmiş tutucuya yavaşça yerleştirin ve solunum ve diğer koşulların neden olduğu hareket artefaktlarını azaltmak için negatif basınçlı emme yoluyla, fare gövdesinden mümkün olduğunca uzağa negatif basınçlı emme ile dokuyu emer.
Bezin yeri seçildikten kısa bir süre sonra görüntülemeye başlayın. Z ekseni boyunca sıralı görüntüler elde etmek, üç boyutlu bir yapı oluşturmak için bezin yüzeyinden 70 ila 140 mikrona kadar dokuya iki mikron adım attı. Daha sonra, SMG'de vasküler geçirgenliği ölçmek için damarların hızlandırılmış görüntülemesini edinin.
Explorer iletişim kutusunda, Yeni Klasör Ekle'ye tıklayın ve dosya adını değiştirin. Ardından, edinme sütununa geri dönün. XY'de, format 512 x 512'dir ve hız 400 hertz'dir.
Çift yönlü X" i açın, yakınlaştırma için yakınlaştırma faktörünü 0,75 ve 1,5 olarak ayarlayın. Ardından, hızlandırılmış görüntüleme elde etmek için "Edinme Modu" altında XYT'yi seçin. Süreyi deneysel ihtiyaca göre 20 saniye, 30 dakika veya daha uzun olarak ayarlayın.
Koşulları ayarladıktan sonra, fotoğraf oluşturan çerçevedeki iki kanalın ve üst üste binen kanalların vasküler görüntülemesini gözlemlemek ve ilgi alanlarını seçmek için "Canlı" ya tıklayın. Görüntülemeye başlamak için Başlat'a tıklayın. In vivo vasküler geçirgenlik testi ve farelerde kan damarlarının üç boyutlu görüntüleri.
Submandibuler bezler burada gösterilmiştir. Kontrol grubunda, her iki izleyici de SMG'nin kan damarlarında mevcuttu. Küçük moleküler ağırlığı nedeniyle, FD4 kan damarlarından acini ve kanalların bazal taraflarına sızabildi, böylece acini ve kanalların şeklini açıkça tasvir etti.
RD70, büyük boyutlu kan damarlarına ve mikro damarlara dağıtıldı. Kanal ligasyon grubunda, hem FD4 hem de RD70, aksinin bazal taraflarına ekstravaze edildi, bu da kanal ligasyonunun endotel bariyer fonksiyonunu bozabileceğini ve büyük moleküllere geçirgenliği artırabileceğini gösterdi. Ayrıca, yarı kantitatif FD4 ve RD70 floresan yoğunluğu sonuçları bu gözlemleri doğruladı.
Üç boyutlu görüntüler, ligasyon grubundaki kan damarları etrafında FD4 ve RD70'in kontrol grubuna kıyasla çok daha belirsiz floresansını gösterdi. Dikkatli SMG izolasyonu ve uygun yerleştirme ve mikroskop, başarılı bir tespit için temel ön koşullardır. İşlemleri takiben, kırmızı kan hücrelerinin hareketi evlenerek kan akış hızı hesaplanabilir ve floresan etiketli kan hücrelerinin infiltrasyonu kovalanabilir.
