Yazarlar Yardımcısı ve bilimsel tartışma Tessem ve Hancock Labs'in üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar Andrew Neilson, doktora (Virginia Tech) kakao türetilmiş epikateşin monomer kesir verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu çalışmada JST için bir hibe-diyabet eylem araştırma ve Eğitim Vakfı tarafından desteklenmiştir.

1. hücre kültürü
<ol><li>Kültür INS-1 832/13 beta hücrelerinde RPMI % 10 fetal sığır serum (FBS), % 1 penisilin-streptomisin, 10 mM HEPES, 2 mM glutamin, 1 mM sodyum Pyruvate ve 0.05 mM 2-mercaptoethanol9,10,11 ile desteklenmiş 1640 türetilmiş ,12,13.</li>
	<li>832/13 hücreleri bir T75 şişesi 2 mL % 0.25 Tripsin, 8 mL tam RPMI 1640 medya ekleyerek 10 dk. Nötrleştir tripsin için 37 ° C'de kuluçka kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve adım 1.2 içinde 900 µL PBS, hücre birimden 100 µL oranında seyreltin.</li>
	<li>2 x 106 hücre/mL 6 yoğunluğu plaka 832/13 hücreleri de çanağı.</li>
	<li>Kültür hücreleri oksijen kuluçka solunum deney başlamadan önce 37 ° C ve % 5 CO2 48 h için.</li>
</ol>2. yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri için hücreleri hazırlanması
<ol><li>
Kakao türetilmiş epikateşin monomer 832/13 hücrelerle tedavi.
	<ol>
<li>832/13 hücreler için 24 saat sonra kaplama 37 ° C ve % 5 CO2oksijen bir kuluçka kültür.</li>
		<li>Medya 24 saat sonra kaplama değiştirmek ve araç kontrolü (3 Kuyu) veya kültür için bir ek 24 h (48 h toplam) oksijen kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2ardından 100 nM kakao monomer (3 Kuyu), 832/13 hücrelerle tedavi.</li>
		<li>1 x düşük glukoz salgılanmasını tahlil arabellek (SAB) 5 dk. aspiratı arabelleği için hücrelerde 832/13 yıkama ve 3 h, 1 x düşük glikoz SAB her saat değiştirme için düşük glikoz SAB x 1 832/13 hücrelerde kuluçkaya.<ol>
<li>Yapmak 10 x SAB ile 33.32 gram NaCl, KCl, 1.73 gr KH2PO4, MgSO4 0.7 g 0,82 g ve H2O 500 mL son bir hacim için ekleyin. Steril filtre nihai çözüm.</li>
			<li>Yapmak 1 düşük glikoz SAB ile 10 SAB, 100 µL % 45 glikoz, 1 m HEPES, 1 mL 2 mL x 10 mL x 0,25 M CaCl2, 0,57 mL % 35 BSA çözeltisi, NaHCO3 0,21 g ve H2O son hacmi 100 mL için ekleyin. Steril filtre nihai çözüm.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Curcumin 832/13 hücrelerle tedavi.
	<ol>
<li>832/13 hücreler için 48 saat sonra kaplama 37 ° C ve % 5 CO2oksijen bir kuluçka kültür.</li>
		<li>1 düşük glikoz SAB x 5 dk. aspiratı arabelleği için hücrelerde 832/13 yıkama ve 3 h, 1 x düşük glikoz SAB her saat değiştirme için düşük glikoz SAB x 1 832/13 hücrelerde kuluçkaya.</li>
		<li>2,5 h, 1 düşük glikoz SAB x 3 h kuluçka sonra arabellek Aspire edin ve 1 x düşük glikoz SAB araç kontrolü ile ya da 30 dk 40 µM curcumin hücrelerde kuluçkaya. Kuluçka, arabellek Aspire edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tripsin yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri için hücrelerle hasat
	<ol>
<li>1 düşük glikoz SAB x 3 h kuluçka sonra hücrelerin % 0.25 tripsin iyi başına 250 µL plakalı kaldırın.</li>
		<li>Tripsin araç kontrolü ile veya bileşik faiz SAB 4 mL 15 mL konik tüp ile tedavi 3 kuyulardan hücrelerde birleştirir.</li>
		<li>Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve adım 2.3.2 900 µL PBS, hücre birimden 100 µL oranında seyreltin.</li>
		<li>1 x düşük glikoz her odası için uygun toplama at 3 mL yapmak SAB hücrelerde uygun sayıda sulandırmak. Veri 1 x 106 hücre/mL konsantrasyonu en etkili olduğunu gösterir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri için mekanik ayrışma hücrelerle hasat
	<ol>
<li>Düşük glikoz SAB, 1 x 3 h kuluçka sonra 1 mL 1 x düşük glikoz SAB her şey ve yavaşça havaya hücreleri mekanik ayrışma ile plaka dışına 1000 µL pipet ucu ile pipetting tarafından ekleyin.</li>
		<li>Araç kontrolü ile veya bileşik ilgi 3 mL SAB solunum için 15 mL konik tüp içinde toplam tedavi 3 kuyulardan hücreleri birleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri
<ol><li>Yüksek çözünürlüklü respirometer hazırlanması.
	<ol>
<li>Yüksek çözünürlüklü respirometer açın ve respirometer analiz programı başlatarak masaüstüne bağlayın.</li>
		<li>Her iki odalarından % 70 etanol Aspire edin. Bu odaları 45 dk en az % 70 etanol içinde bekletin.</li>
		<li>Odalar her adımdan sonra alıyorum iki kez % 70 etanol ile yıkayın.</li>
		<li>Chambers GKD2her adımdan sonra alıyorum O, üç kez ile yıkayın.</li>
		<li>GKD2' O. odası itici durulama Bu kalıntı etanol itici ve titanyum bağlantı noktası kapalı temizler.</li>
	</ol></li>
	<li>Polarographic oksijen sensör kalibrasyonu.
	<ol>
<li>Sürekli manyetik heyecan çubukları kullanarak veri kayıt aralığı ile 750 rpm ve 37 ° C odasında 2.0 arabellek karıştırarak her oxygraph Odası'na, 1 düşük glikoz SAB arabellek x 2.4 mL ekleyin F7 butona da sekmesini açarak s "Sistemler" etiketli. İtici itmek ta ve İngiliz anahtarı havalandırma ayarına geri çek. En az 1 saat kadar istikrarlı oksijen akı elde edilir için equilibrate makine izin.</li>
		<li>Makine 37 ° C'de deneme süresini belirleyin. Polarizasyon gerilimi 800 için ayarla bir kazancı F7 butona da "Oksijen, O2"etiketli sekmesini açarak 2 mV. Oksijen konsantrasyonu da değişimdir kararlı iken en az 30 dk, SAB arabellek oksijen konsantrasyonu equilibrate (az 2 pmol/(s*mL)).</li>
		<li>Oksijen konsantrasyonu sabitleme oksijen konsantrasyonu üstü arka plan ölçü değişim oksijen konsantrasyonu kurmaya kararlı nerede bir bölge seçin.<ol>
<li>Üst karakter tuşunu, sol üzerinde fareyi tıklatmak itip seçili bölgede fareyi sürükleyerek bir bölge seçin. Her iki odaları ile karşılık gelen her iz için seçilen bölge ve "R1" değişiklik ile ilişkili adını tıklatın.</li>
			<li>Sol altta "O2 kalibrasyon" kutusuna çift tıklayın ve köşeleri ekranın sağ, R1 olarak "hava kalibrasyon" "işaretini seçin" düğmesini tıklatın ve sonra "kalibre ve panoya kopyala" her iki salonları için seçin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Solunum 832/13 beta hücre 2.1.5 veya 2.2.5 adımda hazırlanan değerlendirme.
	<ol>
<li>Her odası (kontrol tedavi araç hücreleri, bileşik işlem görmüş hücreleri ile bir odası ile bir odası) örnekte 2.4 mL 1 x düşük glikoz SAB. yük Hücre örneği protein Nefelometri için 0.5 mL BCA (Bicinchoninic asit) tahlil tarafından Eğer mekanik ayrışma yaklaşım (daha sonra ölçüm için donma-20 ° C'de) kullanarak korur.<ol>
<li>Dalgıç sonuna kadar itin ve rezidüel hacim Aspire edin. Hücreleri 750 devir/dakika ve 37 ° C tüm sonraki adımlar için denemeyi boyunca sürekli karıştırın. F4'e tıklayarak ve örnekleri yüklendiğinde "hücreler olarak" etiketleme bir işareti yapmak.</li>
			<li>30 dk için ölçü örnekleri. Sinyal sabitleme sonra oksijen konsantrasyonu düşük glikoz koşulları (2.5 mM glikoz) 3.2.3 içinde açıklandığı gibi karşılık gelen değişim bir bölge seçin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sinyal sabitleme ulaşıldıktan sonra 12.5 µL % 45 steril glikoz çözüm (16,7 mM son konsantrasyonu) kullanarak bağlantı noktası yükleme titanyum ile her odaya içine ekleyin. Bir işareti "tedavi eklendiğinde 3.3.1 içinde açıklanan glikoz" olarak ölçülen olun. Let sinyal stabilize etmek ve kayıt hücresel solunum kadar istikrarlı oksijen akı elde edilir. Bu bölge değişikliği oksijen konsantrasyonu 3.2.3 içinde açıklandığı gibi seçin. Bu 16,7 mM glikoz okuma ve uyarıcı koşullar7ile karşılık gelir.</li>
		<li>Sinyal sabitleme ulaşıldıktan sonra 5 mM oligomycin bir (2.5 µM son konsantrasyonu) her odasına yükleme limanı üzerinden 1 µL ekleyin. Bir işareti "tedavi eklendiğinde 3.3.1 içinde açıklanan OligoA" olarak ölçülen olun. Let sinyal stabilize etmek ve kayıt hücresel solunum kadar istikrarlı oksijen akı elde edilir. Bu alan eğrinin 3.2.3 içinde açıklandığı gibi seçin. Oligomycin A ATP sentaz engeller ve böylece akı tek oksijen meydana gelen yolu ile elektron ve oksidatif fosforilasyon7sızıntı.</li>
		<li>Sinyal sabitleme ulaşıldıktan sonra en fazla solunum oranı kurulana kadar 1 mM FCCP 1 µL artışlarla ekleyin. Bu maksimal edilişi solunum temsil eder. 3-4 µL arasında FCCP (maksimal edilişi solunum INS-1 832/13 hücre ikna etmek için yeterli 1.5-2.0 µM son konsantrasyonu) olduğunu. Tedavi eklendiğinde 3.3.1 içinde açıklandığı gibi "FCCP" etiketli bir işareti yapmak. Let sinyal stabilize etmek ve kayıt hücresel solunum kadar istikrarlı oksijen akı elde edilir. Bu alan eğrinin 3.2.3 içinde açıklandığı gibi seçin. FCCP uncoupling bir ajandır. Bu bize edilişi solunum7ölçmek sağlar.</li>
		<li>Sinyal sabitleme ulaşıldıktan sonra yükleme limanı ile her odaya içine 1 µL 5 mm Antimycin A (2.5 µM son konsantrasyonu) ekleyin. Tedavi eklendiğinde 3.3.1 içinde açıklandığı gibi "AntiA" etiketli bir işareti yapmak. Let sinyal stabilize etmek ve kayıt hücresel solunum kadar istikrarlı oksijen akı elde edilir. Bu alan eğrinin 3.2.3 içinde açıklandığı gibi seçin. Not: Antimycin A sitokrom C redüktaz bağlar, ubiquinone oksidasyonu engeller ve tüm solunum engeller. Bu tamamen solunum7durdurmak için bize izin verir.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 beta hücreleri protein konsantrasyonu ve solunum normalleştirme için ölçme.
	<ol>
<li>Örnek yükleme BCA yöntemi13kullanarak ölçü protein örnek muhafaza 0.5 mL kullanarak.</li>
		<li>Her örnek nüsha, seyreltme, üreticinin yönergelerini takip olmadan çalışır.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 beta hücre solunum hesaplamaları trypsinized hücrelerden.<ol>
<li>ML kullanım başına hücre sayısı tahlil F3 respirometer analiz programı düğmeye basarak girin. Hücre/mL birimlerini değiştirin, hücresel konsantrasyon girin ve orta SAB. için değiştirin</li>
		<li>Arka plan okuma seçerek ve O2 3.2.3 içinde açıklandığı gibi kalibrasyon formu içine girerek verileri normalleştirmek için seçin.</li>
		<li>Okumalar 2.5 mm glikoz, 16,7 mM glikoz, Oligomycin A, FCCP ve Antimycin 3.3.1 içinde açıklandığı gibi bir seçim yapın.</li>
		<li>Respirometer analiz programında, her odası için okuma protein konsantrasyonu girerek ve her tedavi sırasında solunum ölçümü için uygun ortalama değerleri seçerek sonra dışa aktarın. Bu tıklayarak F2 ve "kopya" Pano çalışması için bastırıyor tarafından yapılır. Bu diğer analiz programlarda kullanmak için veri verir. "O2 eğim negatif" değerler hesaplamalar için kullanın.</li>
		<li>Veri denetimleri araç 3-5 bağımsız ishal tedavi ve doğal olduğu gibi hücresel solunum INS-1 832/13 beta hücre üzerindeki etkisini belirlemek için işlem görmüş hücreleri bileşikler derleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 beta hücre solunum hesaplamalar mekanik hücre ayrışmış.<ol>
<li>Protein hesaplamalar BCA tahlil F3 respirometer analiz programı düğmeye basarak girin. Mg birimlerini değiştirin, BCA konsantrasyon girin ve orta SAB. için değiştirin</li>
		<li>Arka plan okuma seçerek ve O2 3.2.3 içinde açıklandığı gibi kalibrasyon formu içine girerek verileri normalleştirmek için seçin.</li>
		<li>Okumalar 2.5 mm glikoz, 16,7 mM glikoz, Oligomycin A, FCCP ve Antimycin 3.3.1 içinde açıklandığı gibi bir seçim yapın.</li>
		<li>Respirometer analiz programında, her odası için okuma protein konsantrasyonu girerek ve her tedavi sırasında solunum ölçümü için uygun ortalama değerleri seçerek sonra dışa aktarın. Bu tıklayarak F2 ve "kopya" Pano çalışması için bastırıyor tarafından yapılır. Bu diğer analiz programlarda kullanmak için veri verir. "O2 eğim negatif" değerler hesaplamalar için kullanın.</li>
		<li>Veri denetimleri araç 3-5 bağımsız ishal tedavi ve doğal olduğu gibi hücresel solunum INS-1 832/13 beta hücre üzerindeki etkisini belirlemek için işlem görmüş hücreleri bileşikler derleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Mueckler, M., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SLC2+(GLUT)+family+of+membrane+transporters.">The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters.</a> Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).</li><li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes.">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53 Suppl 3, S16-S21 (2004).</li><li>Strat, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+by+which+cocoa+flavanols+improve+metabolic+syndrome+and+related+disorders.">Mechanisms by which cocoa flavanols improve metabolic syndrome and related disorders.</a> J Nutr Biochem. 35, 1-21 (2016).</li><li>Rowley, T. J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomeric+cocoa+catechins+enhance+&#946;-cell+function+by+increasing+mitochondrial+respiration.">Monomeric cocoa catechins enhance &#946;-cell function by increasing mitochondrial respiration.</a> J Nutr Biochem. 49, 30-41 (2017).</li><li>Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+Respirometry+to+Assess+Mitochondrial+Function+in+Permeabilized+and+Intact+Cells.">High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li><li>Reynolds, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Cell+deletion+of+Nr4a1+and+Nr4a3+nuclear+receptors+impedes+mitochondrial+respiration+and+insulin+secretion.">beta-Cell deletion of Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors impedes mitochondrial respiration and insulin secretion.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 311 (1), E186-E201 (2016).</li><li>Hals, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Respiration+in+Insulin-Producing+beta-Cells:+General+Characteristics+and+Adaptive+Effects+of+Hypoxia.">Mitochondrial Respiration in Insulin-Producing beta-Cells: General Characteristics and Adaptive Effects of Hypoxia.</a> PLoS One. 10 (9), e0138558 (2015).</li><li>Ray, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nkx6.1-mediated+insulin+secretion+and+beta-cell+proliferation+is+dependent+on+upregulation+of+c-Fos.">Nkx6.1-mediated insulin secretion and beta-cell proliferation is dependent on upregulation of c-Fos.</a> FEBS Lett. 590 (12), 1791-1803 (2016).</li><li>Schisler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+human+and+rat+islet+beta-cell+proliferation+with+retention+of+function+by+the+homeodomain+transcription+factor+Nkx6.1.">Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1.</a> Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).</li><li>Tessem, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nkx6.1+regulates+islet+beta-cell+proliferation+via+Nr4a1+and+Nr4a3+nuclear+receptors.">Nkx6.1 regulates islet beta-cell proliferation via Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (14), 5242-5247 (2014).</li><li>Hobson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+Kinase+A+is+critical+for+the+Nkx6.1+mediated+beta-cell+proliferation+pathway.">Aurora Kinase A is critical for the Nkx6.1 mediated beta-cell proliferation pathway.</a> Islets. 7 (1), e1027854 (2015).</li><li>Draney, C., Hobson, A. E., Grover, S. G., Jack, B. O., Tessem, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5r1+Overexpression+Induces+Primary+beta-Cell+Proliferation.">Cdk5r1 Overexpression Induces Primary beta-Cell Proliferation.</a> J Diabetes Res. 2016, 6375804 (2016).</li><li>Rouse, M., Younes, A., Egan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+and+curcumin+enhance+pancreatic+beta-cell+function+by+inhibiting+phosphodiesterase+activity.">Resveratrol and curcumin enhance pancreatic beta-cell function by inhibiting phosphodiesterase activity.</a> J Endocrinol. 223 (2), 107-117 (2014).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+reduces+beta-cell+mitochondria+and+induces+distinct+morphological+abnormalities,+which+are+reproducible+by+high+glucose+in+vitro+with+attendant+dysfunction.">Diabetes reduces beta-cell mitochondria and induces distinct morphological abnormalities, which are reproducible by high glucose in vitro with attendant dysfunction.</a> Islets. 4 (3), 233-242 (2012).</li><li>Chavanelle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+high-intensity+interval+training+and+moderate-intensity+continuous+training+on+glycaemic+control+and+skeletal+muscle+mitochondrial+function+in+db/db+mice.">Effects of high-intensity interval training and moderate-intensity continuous training on glycaemic control and skeletal muscle mitochondrial function in db/db mice.</a> Sci Rep. 7 (1), 204 (2017).</li><li>Jelenik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Insulin+Resistance+in+Primary+and+Secondary+Nonalcoholic+Fatty+Liver.">Mechanisms of Insulin Resistance in Primary and Secondary Nonalcoholic Fatty Liver.</a> Diabetes. 66 (8), 2241-2253 (2017).</li><li>Spacek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-stimulated+insulin+secretion+of+insulinoma+INS-1E+cells+is+associated+with+elevation+of+both+respiration+and+mitochondrial+membrane+potential.">Glucose-stimulated insulin secretion of insulinoma INS-1E cells is associated with elevation of both respiration and mitochondrial membrane potential.</a> Int J Biochem Cell Biol. 40 (8), 1522-1535 (2008).</li><li>Jezek, J., Dlaskova, A., Zelenka, J., Jaburek, M., Jezek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2O2-Activated+Mitochondrial+Phospholipase+iPLAgamma+Prevents+Lipotoxic+Oxidative+Stress+in+Synergy+with+UCP2,+Amplifies+Signaling+via+G-Protein-Coupled+Receptor+GPR40,+and+Regulates+Insulin+Secretion+in+Pancreatic+beta-Cells.">H2O2-Activated Mitochondrial Phospholipase iPLAgamma Prevents Lipotoxic Oxidative Stress in Synergy with UCP2, Amplifies Signaling via G-Protein-Coupled Receptor GPR40, and Regulates Insulin Secretion in Pancreatic beta-Cells.</a> Antioxid Redox Signal. 23 (12), 958-972 (2015).</li><li>Johnson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressed+insulin+signaling+and+increased+apoptosis+in+CD38-null+islets.">Suppressed insulin signaling and increased apoptosis in CD38-null islets.</a> Diabetes. 55 (10), 2737-2746 (2006).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralının amacı olduğu gibi pankreas beta hücrelerinde solunum oranları ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri kullanmaktır. Bu yöntem beta hücre yanıt olarak artan şekeri ölçüm sağlar. Protokol için de Önarıtma ile çeşitli bileşenleri, bu doğal olarak meydana gelen monomeric epikateşin veya curcumin4,5iletişim kuralıyla gösterildiği gibi sağlar. Bu iletişim kura...

Pankreas beta hücre birincil amacı sistem normoglycemia glikoz uyarılmış insülin salgılanması ile muhafaza etmektir. Beta hücreleri glikoz büyük ölçüde nedeniyle düşük benzeşme, yüksek kapasiteli glikoz taşıyıcı GLUT2 dolaşan fizyolojik değişiklikler hissediyorum (glikoz taşıyıcı 2, Km 16,7 mM)1. Dolaşım Glikoz seviyesi yükseldikçe, bu yüksek kapasiteli düşük-benzeşme ışınlama beta hücre içinde hücre içi glikoz orantılı bir artış kolaylaştırır. Glikoz Glikoliz, TCA döngüsü (tricarboxylic asit döngüsü) ve mitokondrial solunum yükseltilmiş hücresel ATP (adenozin trifosfat) seviyelerinde kaynaklanan metabolize edilir. Yükseltilmiş ATP konsantrasyon membran depolarizasyon sonucu ATP hassas K+ kanalları, engeller. Membran depolarizasyon voltaj Kapılı Ca2 + kanal açılması neden olur ve sonraki sürümü vezikül insülin granülleri2bağlı. Beta hücre fonksiyon bozukluğu tip 2 diyabet (T2D) özelliğidir ve azalmış ve kötü kontrollü insülin salgılanması ve sonuçta beta hücre ölüm3ile sonuçlanır. Korumak veya beta hücre fonksiyonu geliştirmek mekanizmaları T2D için bir tedavi olarak kullanılabilir.
Çalışmaları doğal olarak meydana gelen yararlı etkilerini göstermiştir pankreas beta hücre4bileşikler bitkisel kökenli. Bu bileşiklerin onların etkisi ile artan beta hücre çoğalması, hayatta kalma veya glikoz uyarılmış insülin salgılanması olabilir. Örnek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda monomeric epikateşin mitokondrial solunum artan aracılığıyla glikoz uyarılmış insülin salgılanması artırır ve hücresel ATP artan5düzeyleri gösterdi. Bu nedenle, bu bileşiklerin fonksiyonel beta hücre artırabilir nasıl anlama kitle bu bileşikler potansiyel therapeutics kaldıraç önemlidir.
Hücresel solunum bir dizi araç ölçülebilir. Yüksek çözünürlüklü bir respirometer bir permeabilized ya da sağlam hücre nüfus6kimyasal modülatörler titrasyon için sağlar. Bu araç çeşitli bileşenleri, ek böylece geniş bir dizi bilgi veren farklı konsantrasyonları verir.
Glikoz metabolizması ve beta hücre fonksiyonu arasındaki samimi bağlantı göz önüne alındığında, hücresel solunum ölçümleri kritik öneme sahiptir. Hücresel solunum ölçümleri-ebilmek kılınmak istimal beta hücreleri, ya permeabilized ya da olduğu gibi her avantajları ve dezavantajları7,8, kendi kümesini having ile. Beta hücrelerinin permeabilization bir elektron taşıma zinciri farklı yönlerini ölçmek izin verirken, bunu solunum beta hücre, glikoz alımı ve metabolizma inducing mekanizmasını açısından olmadan yapar. Bu nedenle, unpermeabilized beta hücre solunum kullanımı oksijen tüketim göstergesi kullanarak çeşitli glikoz düzeyleri için beta hücreleri yanıt belirlemek için çok kullanışlı bir yöntemdir.
Bu teknik amacı sağlam INS-1 oksijen tüketimi ölçmek için 832/13 beta hücreleri türetilmiştir. Bu teknik bize beta hücreleri yanıt unstimulatory glikoz koşullarına (2.5 mM glikoz) belirlemek uyarıcı glikoz koşulları (16,7 mM glikoz) yanı sıra sağlar. Unpermeabilized hücreleri tek tek karmaşık test bize izin vermez iken ben, II veya III. elektron taşıma zinciri, tekniği ile karmaşık IV edilişi inhibisyon (Oligomycin A), solunum (FCCP-karbonil siyanür-ilgili ölçümler izin vermez 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone) ve tamamen inhibe solunum (Antimycin A). Bu çalışmada solunum sağlam unpermeabilized pankreas beta hücreleri yanı sıra iki doğal olarak meydana gelen bileşikler, monomeric epikateşin ve curcumin, beta hücre solunum üzerindeki etkisini ölçme etkinliği gösterir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>O2k Core: Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10000-02</td>
			<td>Instrument for high-resolution respirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DatLab 6 Program</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>27141-01</td>
			<td>Computer program for analysing high-reolution respirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INS-1 832/13 cell line</td>
			<td>Duke University Medical Center</td>
			<td>NONE</td>
			<td>Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7727</td>
			<td>Pre-treatment of beta cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocoa epicatechin monomer</td>
			<td>Virginia Polytechnic Institute and State University</td>
			<td>NONE</td>
			<td>Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>832/13 beta cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4458</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3662</td>
			<td>832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>GLL01</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td>Component of 10x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Component of 10x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Component of 10x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td>Component of 10x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td>Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Component of 1x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35% BSA Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7979</td>
			<td>Component of 1x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Component of 1x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459844</td>
			<td>Washing Oxygraph O2k Chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Chemicals for respiration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Chemicals for respiration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anitmycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Chemicals for respiration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td>For determining protein concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution respirometry to measure mitochondrial function of intact beta cells in the presence of natural compounds

Yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri izole mitokondri, hücre ve dokulara oksijen tüketimi ölçüm için sağlar. Beta hücreleri vücut tarafından kontrol kan şekeri düzeyleri insülin salgılanması yanıt olarak yükseltilmiş glikoz konsantrasyonu ile kritik bir rol oynamaktadır. İnsülin salgılanması glikoz metabolizması ve mitokondrial solunum tarafından kontrol edilir. Bu nedenle, bozulmamış beta hücre solunum ölçme şeker hastalığı için bir tedavi olarak beta hücre fonksiyonu geliştirmek için önemlidir. Sağlam 832/13 INS-1'i kullanarak beta hücreleri hücresel solunum glikoz konsantrasyonu artan etkisini ölçebilirsiniz türetilmiş. Bu iletişim kuralı bir etkilerini belirlemenize izin vererek çeşitli bileşenleri, başka yerde içinde beta hücre solunum ölçmek için bize izin verir bileşikler sağlam hücre solunum üzerinde verilen. Burada iki doğal olarak meydana gelen bileşikler, monomeric epikateşin ve curcumin, low (2.5 mM) veya yüksek glikoz (16,7 mM) koşulları altında varlığı beta hücre solunum üzerindeki etkisini göstermektedir. Bu teknik, çeşitli bileşikler etkisi olduğu gibi beta hücre solunum huzurunda farklı glikoz konsantrasyonu belirlemek için kullanılabilir.

Hazırlanan ve iletişim kuralında tanımlandığı gibi hasat INS-1 832/13 beta hücreleri oksijen tüketimi çeşitli kimyasal müdahaleler (şekil 1A) göre modülasyon gösterecektir. Glikoz konsantrasyonu 16,7 mM glikoz (şekil 1B) arttı zaman solunum bir artış gözlenir. Sağlam hücreleri Oligomycin A. ile tedavi ederken solunum azalacak Bu solunum Bazal, nonphosphorylating solunum durumu olarak tanımlanır kaçak olarak bilinir. Beta hücreleri unco...

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds at JoVE.com

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Bu iletişim kuralı bozulmadan 832/13 beta yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri kullanarak hücreleri glikoz-aracılı değişiklikler doğal bileşikler huzurunda mitokondrial solunum etkisini ölçmek için hedeftir.

Doğal bileşikler varlığında olduğu gibi Beta hücrelerinin mitokondriyal işlev ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

high-resolution-respirometry-to-measure-mitochondrial-function-intact

Research

JoVE Journal

Biology

11.8K Görüntüleme.  Brigham Young University. Bu iletişim kuralı bozulmadan 832/13 beta yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri kullanarak hücreleri glikoz-aracılı değişiklikler doğal bileşikler huzurunda mitokondrial solunum etkisini ölçmek için hedeftir.

Video: High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

Bitki damarları ve Üç Boyutlu Yapı ve Fonksiyon Visualize&#39;a Yüksek Çözünürlüklü Bilgisayarlı Tomografi Kullanımı

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Biyoloji

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı<em&gt; Yerinde</emGen İfade ve Fonksiyon Eğitim için Zebra balığı Embriyolar içinde&gt; Hibridizasyon

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Gap Junctional Hücreler arası iletişim: Doğal Ürünler Toksikantların ve Toksinler Yan Etkileri değerlendirmek için Fonksiyonel Biyomarker ve Sağlık Faydaları

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

Yüksek çözünürlüklü Solunum permeabilize ve bozulmamış Hücreleri Mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Mitokondriyal Yapısı ve İşlevi incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurtalıklar

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Yüksek çözünürlüklü Solunum Ölçümleri için Diferansiyel Santrifüj tarafından İskelet Kası Bozulmamış Mitokondri izolasyonu

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many doses, allow sensitive measurement of drug interactions. However, these assays are costly and do not scale well for measuring interaction among many drugs. Several recent studies have reported drug interaction measurements using a diagonal sampling of the traditional checkerboard assay. This alternative methodology greatly decreases the cost of drug interaction experiments and allows interaction measurement for combinations with many drugs. Here, we describe a protocol to measure the three pairwise interactions and one three-way interaction among three antibiotics in duplicate, in five days, using only three 96-well microplates and standard laboratory equipment. We present representative results showing that the three-antibiotic combination of Levofloxacin + Nalidixic Acid + Penicillin G is synergistic. Our protocol scales up to measure interactions among many drugs and in other biological contexts, allowing for efficient screens for multi-drug synergies against pathogens and tumors.

In this protocol, we describe how to make Loewe additivity-based drug interaction measurements for pairwise and three-way drug combinations.

Ölçü sinerji arasında pek çok uyuşturucu için köşegen yöntemi

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Zebra balığı adacıkları tek hücreli çözünürlük kalsiyum Imaging'i kullanma Beta hücre fonksiyonu Analizi

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and assessment of respiratory complexes using diversified substrate-uncoupler-inhibitor titration (SUIT) protocols. Here, the usage of two high-resolution respirometry devices is demonstrated, and a basic collection of protocols applicable for the analysis of cultured cells, skeletal and heart muscle fibers, and soft tissues such as the brain and liver are presented. Protocols for cultured cells and tissues are provided for a chamber-based respirometer and cultured cells for a microplate-based respirometer, both encompassing standard respiration protocols. For comparative purposes, CRISPR-engineered HEK293 cells deficient in mitochondrial translation causing multiple respiratory system deficiency are used with both devices to demonstrate cellular defects in respiration. Both respirometers allow for comprehensive measurement of cellular respiration with their respective technical merits and suitability dependent on the research question and model under study.

Assessing oxidative phosphorylation using high-resolution respirometers has become an integral part of the functional analysis of mitochondria and cellular energy metabolism. Here, we present protocols for the analysis of cellular energy metabolism using chamber and microplate-based high-resolution respirometers and discuss the key benefits of each device.

Oda ve Plaka Tabanlı Respirometreler Kullanarak Hücrelerdeki ve Dokulardaki Biyoenerjetik Değerleri Değerlendirmek için Yüksek Çözünürlüklü Respirometri