Bu yöntem, insan olmayan primatlar ve insanlar gibi ilgili türlerden gelen az sayıda adacıktan gelen az sayıdaki adacıklardan oksijen tüketiminin ölçülmesine olanak sağlayarak mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesine olanak sağlar. Bu teknik, az sayıda birincil adacıkla, teknik çoğaltmaların artırılması, birden fazla koşulun test edilmesine olanak tanıyan ve testin katılığını ve tekrarlanabilirliğini geliştirerek gerçekleştirilebilir. Bu teknik, adacık fonksiyonu ve insülin salgısının önemli bir belirleyicisi olan ve genellikle diyabette bozulmuş olan ve başarılı adacık naklinin önemli bir belirleyicisi olan mitokondriyal sağlığı değerlendirir.
Adacıkların transferden sonra kuyuların merkezine lokalize olduğundan emin olmak esastır. Aksi takdirde tutarsız oksijen tüketimi ölçümleri ile sonuçlanır. Bu prosedürü gösteren, Valerie Ricciardi, benim laboratuvarımda çalışan bir lisans öğrencisi olacak.
Bir gün önce, 0,1 molar sodyum bikarbonat çözeltisi 2.8 mililitre hücre ve doku yapıştırıcı 200 mikrolitre ekleyin ve 96 iyi küresel mikroplaka her kuyunun altına elde edilen çözelti nin 20 mikrolitre ekleyin. Herhangi bir hava kabarcıkları pipet ucu kaldırılır emin olun. Tüm kuyular yüklendiğinde, plakayı 37 derece lik karbondioksit olmayan bir inkübatöre yerleştirin.
Bir saat sonra, steril bir ortamda plaka dan hücre yapışkan çözeltiaspire ve 37 derece santigrat steril su 400 mikrolitre ile her kuyu iki kez yıkayın. Daha sonra kuyuların 4 santigrat derecede geceleme için plakayı kaplamadan önce 30 ila 40 dakika boyunca kurumasını bekleyin. Sensör kartuşunu nemlendirmek için steril bir ortamda sensör kartuş paketini açın ve içindekileri çıkarın.
Sensör kartuşunu yardımcı plakanın yanına ters yerleştirin ve yardımcı plakanın her kuyusunu 200 mikrolitre steril suyla doldurun. Tüm kuyular yüklendiğinde, sensör kartuşu yardımcı plakaya indirin ve monte edilmiş sensör kartuşu ve yardımcı plakayı bir gecede 37 derece santigrat derece karbondioksit olmayan inkübatöre yerleştirin. Tgörünüşe gününde, sensör kartuşu kapağını çıkarın ve suyu servis plakasının kuyularından çıkarın.
Her kuyuya 200 mililitre önceden ısıtılmış kalibran ekleyin ve sensör kartuş kapağını değiştirin. Daha sonra sensör kartuşu yla yaklaşık bir saat boyunca kuvöze geri yerleştirin. Adacıkları transfer için hazırlamak için, adacıkları yaklaşık %100 saflıkta biraraya getirilmiş ortam içeren 60 ila 15 milimetrelik hücre kültür yemeğine yerleştirin.
Tüm adacıklar toplandığında, hazırlanan küresel mikroplakanın her kuyuyu 175 mikrolitre bir araya getirilmiş ortamla yükleyin ve hücre kültürü çanaktan 15 mikrolitrelik orta 15 adacık aspire etmek için 15 mikrolitreye ayarlanmış bir P20 pipet kullanın. Adacıkları küresel mikroplakaya tohumlamak için pipet ucunu kuyunun dibine indirin, ucu zar zor kaldırın ve yaklaşık beş mikrolitre orta litre orta yığın. Adacıkları kuyulara yüklemek için, adacıkların pipet ucuna yerleşmelerine izin verin ve bunları kuyu merkezinin alt kısmından küçük bir hacimde yavaşça serbest bırakın.
Tüm adacıkların pipet ucunu bıraktığını doğrulayın, ara sıra mikroskop altında küresel mikroplakayı kontrol edin ve adacıkların plakanın alt kısmında tohumlu olduğunu ve kuyuların kenarlarına yapışmadığını doğrulayın. Tüm adacıklar transfer edildiğinde, mikroplakayı 37 derece karbondioksit olmayan inkübatöre yerleştirin. Teşp prosedürünü başlatmadan önce, sensör kartuşunun 20 mikrolitresi ile sensör kartuşuna yeni hazırlanmış 45 mikromolar oligomisin, 22 mikrolitre taze hazırlanmış 10 mikromolar FCCP ile Port B'yi ve 25 mikrolitre taze hazırlanmış 25 mikromolar rotenon AA ile Port C'yi yükleyin. Daha sonra, program 30 dakikalık temel solunum dönemi, 42 dakika oligomisin ölçüm dönemi, 30 dakika FCCP dönemi ve 30 dakikalık rotenon AA dönemi için bir ekstrasellüler akı analizörü testi.
Daha sonra sensörü kalibre etmek ve mikro plakayı yerleştirmek için ekrandaki talimatları izleyerek testi çalıştırın. Adacık teslimi için, 15 adacık gösterildiği gibi orta 15 mikrolitre aspire edilmelidir. Bu teknik, adacıkların her bir mikroplakanın alt ortasına tutarlı bir şekilde yerleştirilmesine ve doğru oksijen tüketimi ölçümlerinin alınmasına olanak sağlamasına neden olacaktır.
Bireysel kuyuların oksijen tüketimini gösteren bu temsili deneyde, kuyular kötü yüklenmiş ve bu da çok düşük bir temel oksijen tüketimi düzeyine ve FCCP'ye yanıt vermeye naz ına neden olarak yüklenmiştir. Bu deneyde, kuyuların çoğu önemli bir temel solunum ve ilaçlara yanıt gösterdi. Ancak, iki kuyu rotenone hiçbir yanıt sergiledi, ilacın düzgün kuyuya serbest olmadığını düşündüren.
Bu kuyular daha ileri analizler dışında tutuldu. Burada, kuyuların adacıklarla doğru bir şekilde yüklendiği ve doğru bir şekilde ilaç enjekte edildiği başarılı bir tahkikatsonuçları gözlemlenebilir. Adacıkların izole edildikten veya alındıktan kısa bir süre sonra kullanılmasına izin vermek için, tetkikleri gerçekleştirmeden bir gün önce reaktiflerin ve plakaların hazırlanması faydalıdır.
Testin ardından, adacıklar oksijen tüketimi verilerini normalleştirmek veya mitokondriyal DNA içeriğini ölçmek için protein veya DNA çıkarma için geri kazanılabilir. Mitokondriyal fonksiyonu az sayıda birincil primat adacıklarında ölçebilme yeteneği, birden fazla ilaç ve diğer manipülasyonların tek bir biyolojik çoğaltmada test edilmesine olanak sağlar. Birincil primat adacıkları ile çalışan bireyler bu dokular ile doğru ve güvenli kullanım konusunda eğitilmiş olması emin olmalısınız.
Özellikle, uygun kişisel koruyucu ekipman kullanımı ve bu örneklerin uygun bertaraf.
