Yazarlar yararlı tartışmalar için yeşil laboratuvar üyeleri teşekkür etmek istiyorum. Bu eser kısmen NIH hibe R03AG052018 ve E.M.G. için R01GM124342 tarafından desteklenmiştir

1. ön bağlama antikor manyetik boncuklar için
<ol>
	<li>Protein A/G manyetik boncuklar karıştırın ve bir 1,5 mL tüp manyetik boncuklar bir immunoprecipitation (IP) örnek başına 20 µL aktarın. Not: boncuk pipetting, geniş-geçişli, yüksek tutma ipuçları kullanın.</li>
	<li>Boncuk ile tüp manyetik bir stand içine yerleştirin ve boncuk tüp tarafında toplamak sağlar. Süpernatant kaldırın.</li>
	<li>Boncuk 3 kez 1 mL soğuk Tris tamponlu tuz (TBS) (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl) ile yıkayın.</li>
	<li>TBS 200 µL boncuk ve uygun miktarda antikor ekleyin. Gecede 4 ° C'de 8 RPM döndürme Not: birçok Histon PTM antikor antikor IP başına 1-3 µg yeterlidir. Ancak, titrasyon deneyler uygun konsantrasyonlarda belirlemek için tavsiye edilir. İyi karakterize, ticari Histon PTM antikorlar için önerilen konsantrasyonları çoğu kez doğru ve yayımlanmış bir rapor veya ürün belgeleri içinde bulunabilir.</li>
	<li>Boncuk manyetik tribünde yer ve süpernatant kaldırın. TBS ile 1 mL yıkar</li>
	<li>TBS IP örnek başına 20 µL artı TBS. (pipetting hata) durumunda ek bir 5 µL boncuk resuspend Not: Boncuk kadar kullanmak 4 ° C, kısa süreli depolanabilir.</li>
</ol>
2. Maya hücreleri büyümek
<ol>
	<li>10 mL YPD (% 10 Maya ekstresi, % 20 pepton ve % 20 dekstroz) uygun zorlanma bir koloni ile aşılamak ve titreyen bir kuluçka makinesi 220 rpm'de geceleme 30 ° C'de büyür.</li>
	<li>600 optik yoğunluk ölçmek nm (OD600) bir Spektrofotometre kullanarak Maya kültür. Kültür bir OD600 seyreltik 0,2 100 ml YPD yeni bir şişe içinde =.</li>
	<li>Onlar orta log fazı ulaşana kadar 220 devirde titreyen bir kuluçka 30 ° C'de hücrelerin büyümesine (OD600 = 0,6-0,8).</li>
</ol>
3. proteinler DNA için polietilenin Vivo içinde
<ol>
	<li>Kültürler orta log fazı ulaştığınızda, 2.7 mL % 37 formaldehit doğrudan orta, % 1 formaldehit son konsantrasyonu için ekleyin. Bir shaker 25 ° C (ya da oda sıcaklığında) şişeye aktarmak ve 50 devirde 15 dakika salla.</li>
	<li>5 mL 2.5 M glisin de orta olarak ekleyin ve formaldehit gidermek 5 min için oda sıcaklığında 50 RPM sallayarak devam edin.</li>
	<li>Şişe santrifüj kapasitesi ve hücreleri 5800 x g 4 ° C'de 5 min için de spin için hücreleri transferi Süpernatant dikkatle boşaltmak.
	<ol>
		<li>45 mL soğuk TBS resuspending tarafından hücreleri yıkayın ve süspansiyon 50 mL konik tüp içine aktarın. Tüp 2800 x g 4 ° C'de 3 dk de spin Süpernatant kaldırın.</li>
		<li>10 mL soğuk hücrelerinde lizis arabellek (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA), %1 nonidet Oktil phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), 4 ° C'de depolanan) chIP yıkama.</li>
		<li>Hücreleri 2800 x g 4 ° C'de 3 dk de spin Süpernatant kaldırın. Not: Hücreler sıvı azot ile dondurulmuş ve başka işleme kadar-80 ° C'de depolanan.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Maya Lysates olun
<ol>
	<li>1 mL 1 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) ile soğuk çip lizis tampon ve Maya proteaz inhibitörü kokteyl 1:1,000 seyreltme hücrelerde resuspend. Süspansiyon cam boncuk 200 µL içeren 2.0 mL vidalı kapak tüp aktarın.</li>
	<li>Boncuk için 30 6 kere yendi ve hücreleri cihazları, yüksek hızlı ajitasyon için 4 ° C'de yenerek bir boncuk transfer her s. Hücreler yenerek her boncuk arasında en az 1 dk. için buz üzerinde tutmak.</li>
	<li>Lysate jel ipuçları yükleme kullanarak bir 1,5 mL tüp aktarın. Lysate 4 ° C'de 20 dk için 15.500 x g, santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Süpernatant atmak ve Pelet MNase sindirim arabellek 250 µL içinde resuspend (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 21 mM CaCl2, % 1 NP-40, depolanan 4 ° C'de) tarafından hafifçe yukarı ve aşağı pipetting.</li>
	<li>MNase 2.5 µL reaksiyonlar için ekleyin. Onları karışımı yavaşça ters çevirme tarafından 4 - 6 kez ve hemen 20 dk 37 ° C su banyosunda kuluçkaya. Not: MNase yeni bir hazır kullanıldığında Özet koşulları optimize edilmelidir. Adım 10 iletişim kuralı bkz:.</li>
	<li>Hemen tüpler reaksiyonu durdurmak ve 0,5 M EDTA 10 mM EDTA son bir konsantrasyon için 5 µL eklemek için buz üzerine yerleştirin. Onları karışımı yavaşça INVERSION tarafından.</li>
	<li>15,500 x g 4 ° C'de 15 dakika de tepki santrifüj kapasitesi ve süpernatant yeni bir 1,5 mL tüp aktarın. Not: Çözünür (sindirilir) Kromatin süpernatant içinde olacaktır. Pelet bir şey sindirilmemiş ve çözünmez hücre artıkları içerir.</li>
</ol>
5. Immunoprecipitate (IP) Histon modifiye
<ol>
	<li>Bir Bradford tahlil kullanarak her MNase yayımlanan Kromatin kesir protein konsantrasyonu belirlemek. Her 8 tek kullanımlık cuvettes artı test edilecek her protein örneği için 1 ek küvet Bradford reaktifi 1 mL ekleyin.
	<ol>
		<li>2 mg/mL sığır serum albumin (BSA) stok çözeltisi hazırlamak.</li>
		<li>BSA aşağıdaki konsantrasyonları Bradford reaktifi 1 ml elde etmek için uygun birim ekleme: 0 μg/mL, 0.5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL, 6 μg/mL, 8 μg/mL ve 10 μg/mL. MNase serbest bırakmak Kromatin fraksiyonunun 2 μL ek cuvettes ekleyin.</li>
		<li>Her küvet parafilm küçük bir parça ile üst kapak ve 4 - 6 kez cuvettes ters çözüm de karıştırmak için. 15 dakika oda sıcaklığında cuvettes kuluçkaya.</li>
		<li>Görünür ışık Spektrofotometre kullanarak ölçmek 595 Absorbans nm standart eğri ve deneysel örnekleri için. Not: küvet BSA olmadan kullanın (0 μg/e doğru önce ilk ölçüm alarak Spektrofotometre boş mL).</li>
		<li>BSA farklı konsantrasyonları Spektrofotometre ile ilişkili yazılım veya elektronik tablo yazılımı için Absorbans değerleri kullanarak standart bir eğri çizmek. Standart eğri ve kullanılan seyreltme faktörü (1:500) göre Absorbans değerleri her Kromatin kesir örnekleri için protein konsantrasyonu hesaplamak için kullanın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Her IP için toplam protein 50 µg çip lizis son hacim 1 ml ulaşmak için arabellek için MNase serbest Kromatin kesir ekleyin. Not: lysate başına birden fazla IP ayarlıyorsanız, lysate ana bir karışımını yapmak ve ChIP lizis tampon ve IP için bireysel tüpler için aliquot 1 mL.</li>
	<li>100 µL giriş örnek olarak işlemek için IP karışımı çıkarın. -20 ° C'de giriş örnek adım kadar 7.1 dondur. Not: Herhangi bir kalan Kromatin örnek ayrıca olabilir-20 ° C'de donmuş ve isterseniz bir sonraki IP için kullanılır.</li>
	<li>Manyetik Protein A/G boncuk ile antikor her IP örnek için önceden bağlı 20 µL ekleyin.</li></ol>Örnek 3 h (Standart) için 8 RPM döndürme veya bir gece 4 ° C'de Eğer (tercih edilen)

6. yıkayayım IP'leri ve Histon-DNA komplekslerinde Elute
<ol>
	<li>Bir manyetik tüplerde durup boncuklar yer tüp tarafında toplayın. Bir pipet kullanarak süpernatant kaldırın. Boncuk sırayla her aşağıdaki arabelleklerinin 1 mL ile yıkayın.
	<ol>
		<li>4 ° C'de 5 min için 8 rpm'de dönen bir manyetik tribünde boncuk yerleştirerek, süpernatant kaldırarak ve sonraki arabellek ekleyerek her yıkama gerçekleştirmek: 2 x - ChIP lizis tampon, 2 x - yüksek tuz yıkama arabellek (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA % 1 NP-40, depolanan 4 ° C'de), 1 x - LiCl/deterjan yıkama arabellek (4 ° C'de depolanan 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, %1 NP-40, % 1 sodyum deoxycholate,), 1 x - TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 4 ° C'de depolanan) ve 1 x - TE.</li>
		<li>Son TE yıkama ile boncuk boncuk TE tüp yıkayın ve kalan boncuk aktarmak için daha sonra başka bir 0.5 mL çoğunu aktarmak için TE 0.5 mL kullanarak yeni bir tüp aktarın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Taze yapılmış çip elüsyon arabelleği (%1 SDS, 1 mM NaHCO3) 250 µL ekleyin. Girdap çözüm kısa bir süre. 8 devirde 15 dakika oda sıcaklığında örnekleri döndürün.</li>
	<li>Tüp manyetik tribünde yer ve boncuk toplamak. Dikkatle süpernatant aktarmak için yeni bir tüp ve boncuk kaçının. Not: Eluate immunoprecipitated protein ve ilişkili DNA içerir.</li>
	<li>Başka bir 250 µL çip elüsyon arabelleği boncuk için ekleyin. 8 devirde 15 dakika oda sıcaklığında örnekleri döndürün.</li>
	<li>Dikkatle süpernatant ilk elüsyon içeren tüp aktarın. Gerekirse, küçük hacim (240 µL) boncuk rahatsız edici önlemek tüm IPS kaldırın.</li>
</ol>
7. Protein-DNA Glossar ters
<ol>
	<li>Giriş örnekleri çözülme ve 400 µL çip elüsyon arabelleği her girdi için ekleyin.</li>
	<li>Hem giriş hem de IP örnekleri için 5 M NaCl, 20 mg/mL glikojen 5 µL ve 20 mg/ml İndinavir K. Mix 12.5 µL 20 µL de ters çevirme veya tüpler flicking ekleyin. 65 ° C su banyosu örneklerinde gecede kuluçkaya.</li>
</ol>
8. arındırmak ve DNA konsantre
<ol>
	<li>10 mg/ml RNase A 10 µL giriş ve IP örnekleri için ekleyin. 37 ° C su banyosu için 30 dk örneklerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Fenol: chlorofrom:isoamyl alkol (25:24:1 PCI) 600 µL sulu ekleyin ve iyice karıştırın. Onları 15,500 x g oda sıcaklığında 5 min için de spin.
	<ol>
		<li>Yeni bir tüp sulu katmana kaldırın. PCI 600 µL ekleyin ve iyice karıştırın. Tüp 15,500 x g oda sıcaklığında 5 min için de spin. Sulu katmanı için yeni bir tüp aktarın. Dikkat: duman mahallede çalışma ve PCI ile çalışırken uygun kişisel koruyucu ekipman giymek. Sıvı ve katı atık kurumsal kurallar tarafından talimat olarak atın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3 M sodyum asetat ve DNA çökelti soğuk % 100 etanol 1 mL 0.1 x birim ekleme. Tüp 4 - 6 kez ters çözüm de karıştırmak için. -20 ° C'de gecede kuluçkaya.
	<ol>
		<li>Tüp 4 ° C'de 20 dk için 15.500 x g de spin Dikkatli bir şekilde süpernatant bir pipet ile çıkarın.</li>
		<li>Pelet 1 mL soğuk % 70 etanol yıkayın. 15,500 x g 4 ° C'de 10 dakika için de spin Dikkatli bir şekilde süpernatant bir pipet ile çıkarın.</li>
		<li>Yaklaşık 20 dakika kadar (tamamen kuru) başlıklı granül kuruması. IP örnekleri nükleaz ücretsiz su 50 µL içinde resuspend ve giriş örnekleri nükleaz ücretsiz su 100 µL içinde resuspend. DNA örnekleri-20 ° C'de qPCR performans kadar saklayın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. kantitatif PCR (qPCR) genomik bölgelere zenginleştirilmiş tespit
<ol>
	<li>Astar her dizi için bir qPCR ana karışımı olun. Bir reaksiyon 5 µL 2 x qPCR mix, 0,25 µL 20 µM ileri astar ve 20 µM ters astar 0,25 µL içerir. Not: Uygun astar tasarım ve qPCR deneyler için test başka bir14,15,16bölümünde.</li>
	<li>Her DNA örneği DNA ana karışımları yapmak. Bir reaksiyon DNA'ın 0.5 µL ve 4.0 µL nükleaz ücretsiz su içerir.</li>
	<li>5.5 µL uygun astar ana mix ve uygun DNA ana Mix 4,5 µL 384-şey qPCR plaka üzerinde her şey ekleyin. Not: her şey için 5.5 µL astar karışımı ekleyerek başlayın. Kalenin 200 x g oda sıcaklığında 1 dk. için de 4,5 µL DNA karışımı eklemeden önce spin.</li>
	<li>Mühür plaka ve 200 x g oda sıcaklığında 1 dk. için spin için uygun.</li>
	<li>Aşağıdaki koşullar ile gerçek zamanlı qPCR sistemle qPCR gerçekleştirmek: 95 ° C 3 dakika; 40 devredir 10 95 ° c s, 30 55 ° C s; erime eğrisi 65 ° C ila 95 ° C 0,5 ° C artışlarla, 5 s.</li>
	<li>Her astar çifti için IP örnek qPCR içinde kullanılan % 5 giriş örnek göre yüzde giriş hesaplayın. Teknik PCR triplicates araçlarının hesaplamaları gerçekleştirmek için kullanın. Not: önemli varyasyon gözlenen Eğer PCR triplicates ana mix kompozisyon, pipetting hataları ve kuyu 384-şey plaka arasında çapraz bulaşma için dikkat qPCR tekrarlamak daha iyi.<ol>
		<li>Cq değerleri % 100'e giriş için seyreltme faktörü çiğ Cq değerleri temsil eden döngü sayısı çıkarılarak ayarlayın. Not: Yüzde beş giriş 20, hangi 4,32 döngüsü (2 20 = 4,32 oturum) eşittir bir seyreltme faktörü temsil eder.</li>
		<li>2 olarak giriş yüzdesini hesaplamak ^ (Cqgiriş - CqIP) 100 ile çarpılmış.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. MNase Özet koşulları (önerilen öncesinde ilk tam çip deney) belirlemek
<ol>
	<li>2.1 4.4 önceki iletişim kuralı aracılığıyla adımları. Kromatin içeren Pelet MNase hazım birden çok örnekleri için yeterince lysate oluşturmak için protokol büyütmek. 4.4. adımda granül MNase sindirim arabellek 1,25 mL resuspend. Örnekleri 5 tüpler yani her aliquot MNase sindirim arabellekte resuspended Kromatin Pelet 250 µL içerir.</li>
	<li>0, 1.5, 2.5 veya 5 ekleyin MNase µL her tüp için. Onları karışımı yavaşça ters çevirme tarafından 4 - 6 kez ve hemen bir 37 ° C su banyosu için 20 dk tüplerde kuluçkaya.</li>
	<li>Hemen buza tüpler yerleştirerek ve 0,5 M EDTA 10 mM son yoğunlaşması 5 µL ekleyerek reaksiyonlar durdurmak.</li></ol>Çözüm karışımı yavaşça INVERSION tarafından.
	<li>15,500 x g 4 ° C'de 15 dakika, tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant yeni bir 1,5 mL tüp aktarın.</li>
	<li>SDS % 1 son konsantrasyonu (25 µL % 10 hisse senedi çözüm) ve NaHCO3 0.1 M son konsantrasyonu (1 M hisse senedi çözüm 25 µL) 1,5 mL tüpler örneklerinde için ekleyin.</li>
	<li>5 M NaCl, glikojen 5 µL ve 20 mg/mL İndinavir K 12.5 µL 20 µL 1,5 mL tüpler örneklerinde ekleyin. Onları gecede 65 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>10 mg/mL RNaseA 10 µL ekleyin. 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>PCI 300 µL sulu ekleyin ve iyice karıştırın. 15,500 x g oda sıcaklığında 5 min için de spin.
	<ol>
		<li>Yeni bir tüp sulu katmana kaldırın. PCI 300 µL ekleyin ve iyice karıştırın. 15,500 x g oda sıcaklığında 5 min için de spin. Sulu katmanı için yeni bir tüp aktarın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3 M sodyum asetat (genellikle ~ 30 µL) ve DNA çökelti soğuk % 100 etanol 1 mL 0.1 x birim ekleme. Tüp 4 - 6 kez ters çevir de karıştırmak için. Tüp-80 ° c-20 ° C veya 1 h için gecede kuluçkaya.
	<ol>
		<li>Tüp 4 ° C'de 20 dk için 15.500 x g de spin Dikkatli bir şekilde bir pipet ile süpernatant çıkarın.</li>
		<li>Granül 1 mL soğuk % 70 etanol yıkayın. 15,500 x g 4 ° C'de 10 dakika için de spin</li>
		<li>Hood yaklaşık 20 dk (veya kadar tamamen kuru) granül kurumasına izin verin. Granül nükleaz ücretsiz su 30 µL içinde resuspend.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Boya yükleme DNA ekleyin ve 20 µL % 2 özel üzerinde çalıştırmak görselleştirmek için jel DNA sindirilir.</li>

<ol>
	<li>Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+Your+Own+Adventure:+The+Role+of+Histone+Modifications+in+Yeast+Cell+Fate.">Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate.</a> J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).</li><li>Suganuma, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+combinatorial+functions+of+histone+modifications.">Signals and combinatorial functions of histone modifications.</a> Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).</li><li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking:+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures.">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li><li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde:+evidence+that+histone+H4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene.">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li><li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo:+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes.">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li><li>Lefran&#231;ois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+yeast+ChIP-Seq+using+multiplex+short-read+DNA+sequencing.">Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing.</a> BMC Genomics. 10, 37 (2009).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins+associated+with+specific+genomic+Loci.">Purification of proteins associated with specific genomic Loci.</a> Cell. 136 (1), 175-186 (2009).</li><li>Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChAP-MS:+a+method+for+identification+of+proteins+and+histone+posttranslational+modifications+at+a+single+genomic+locus.">ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus.</a> Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).</li><li>Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+systems+approaches+for+the+analysis+of+histone+modification+readout.">Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout.</a> Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).</li><li>Soldi, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ChroP+approach+combines+ChIP+and+mass+spectrometry+to+dissect+locus-specific+proteomic+landscapes+of+chromatin.">The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Kuo, M. H., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cross-linking+and+immunoprecipitation+for+studying+dynamic+Protein:DNA+associations+in+a+chromatin+environment.">In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment.</a> Methods. 19 (3), 425-433 (1999).</li><li>Meluh, P. B., Broach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+analysis+of+yeast+chromatin.">Immunological analysis of yeast chromatin.</a> Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).</li><li>Rozen, S., Skaletsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers.">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).</li><li>Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+RT-qPCR-Publishing+data+that+conform+to+the+MIQE+guidelines.">A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines.</a> Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).</li><li>Rodr&#237;guez, A., Rodr&#237;guez, M., C&#243;rdoba, J. J., Andrade, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+primers+and+probes+for+quantitative+real-time+PCR+methods.">Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods.</a> Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).</li><li>Briggs, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+lysine+4+methylation+is+mediated+by+Set1+and+required+for+cell+growth+and+rDNA+silencing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).</li><li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation+of+histone+H3+Lys+4+in+coding+regions+of+active+genes.">Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes.</a> P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).</li><li>Pokholok, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+map+of+nucleosome+acetylation+and+methylation+in+yeast.">Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast.</a> Cell. 122 (4), 517-527 (2005).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Paf1+complex+is+required+for+histone+H3+methylation+by+COMPASS+and+Dot1p:+linking+transcriptional+elongation+to+histone+methylation.">The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation.</a> Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).</li><li>South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K4+methyltransferase+Set1+is+involved+in+maintenance+of+ergosterol+homeostasis+and+resistance+to+Brefeldin+A.">H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A.</a> P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).</li><li>Margaritis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+repressive+mechanisms+for+histone+3+lysine+4+methylation+through+promoting+3'-end+antisense+transcription.">Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3'-end antisense transcription.</a> PLoS Genet. 8 (9), e1002952 (2012).</li><li>Jezek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+methyltransferases+Set5+and+Set1+have+overlapping+functions+in+gene+silencing+and+telomere+maintenance.">The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance.</a> Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).</li><li>Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sir2p+and+Sas2p+opposingly+regulate+acetylation+of+yeast+histone+H4+lysine16+and+spreading+of+heterochromatin.">Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin.</a> Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).</li><li>Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+gradient+of+histone+acetylation+established+by+Sas2p+and+Sir2p+functions+as+a+shield+against+gene+silencing.">Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing.</a> Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).</li><li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity.">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada açıklanan yordamı immunoprecipitation tarafından değiştirilmiş Histon Maya hücreleri ile ilgili DNA'ın verimli kurtarma sağlar. Bu bölgelerde yerel zenginleştirme belirlemek ilgi veya belirli Histon değişiklikler tükenmesi yükseltmek primerler kullanılarak qPCR tarafından takip ediyor. Bir yöntem olarak varlık gelişmiş rağmen neredeyse 20 yıl önce çip Histon değişiklik durum farklı genomik bölgeler ve farklı koşullar altında soruşturma için belirleyici tahlil kalır. Her ne kadar...

Histon dinamik translasyonel modifikasyon (PTM) transkripsiyon, çoğaltma ve DNA onarım1,2de dahil olmak üzere birçok DNA şablonu esas alan işlemler için anahtar yasal bir mekanizmadır. Bereket ve değiştirilmiş Histon bu işlemlerle eşlik eden hassas yerelleştirme belirlemek için bu nedenle onların yönetmelik hücrenin farklı koşullar altında anlamak için kritik yeteneğidir. Kromatin immunoprecipitation (çip) gelişimi büyük ölçüde protein etkileşimler DNA, biyokimyasal çalışmalar özellikle vitro yöntemleri kullanarak kimyasal crosslinkers kaynaklandığını bir yöntem olarak değerlendirmek için ihtiyaç ile birleştiğinde dinamik yapısı protein-DNA etkileşimleri vivo içinde ve özel bölgeler genom3,4,5. Kantitatif PCR (qPCR) ve sıralama teknolojileri gelişme da çip deneyler ile kantitatif karşılaştırmalar ve bütün genleri, DNA-protein etkileşimleri, anatomi için güçlü bir araç yapma arasında gerçekleştirme olanağı genişledi birden çok düzeyi.
Doğrudan bir değiştirilmiş Histon ve içinde belirli genomik locus arasındaki fiziksel bağlantıyı sorguya için karşılaştırılabilir hiçbir yöntem olduğundan şu anda, genom kopyası Kromatin aracılı yönetmelikte baktılar herhangi bir araştırma grubu için gerekli bir yöntem yongadır vivo. Histon değişiklikler genom6,7 boyunca eşlemek için sonraki nesil sıralama kullanma bu yöntem varyasyonları mevcut olmasına rağmen bu yaklaşımların adresi olabilir farklı bilimsel sorular ve ölçek, maliyet ve teknik kaynaklar için bazı araştırma grupları sınırlama. Buna ek olarak, hedeflenen chIP-qPCR bunlar tamamlayacak gereklidir yaklaşımlar yöntemleri her ikisine de sağlayarak en iyi duruma getirme çip protokol sıralama öncesinde ve epigenomic veri kümesinden gelen sonuçları doğrulamak için. Kütle spektrometresi dayalı yaklaşımlar genomik bölgeleri ile ilişkili işaretleri var Ayrıca Histon tam Kompleman belirlenmesi8,9,10,11, ancak, ortaya için bunlar yaklaşımlar ile ilgili hangi bölgelerinde genom probed ve teknik uzmanlık ve tüm araştırma gruplarına kullanılamaz araçları gerektirir bazı kısıtlamalar bulunmaktadır. Bu nedenle, çip bolluk ve dağıtım Histon değişiklikler tüm araştırma grupları epigenetik, Kromatin ve genomik fonksiyonları düzenleme ilgi için çeşitli koşullar altında analiz etmek için temel bir yöntem kalır.
Burada, mayası kullanarak çip Histon PTMs, Kromatin dağılımı araştırmaya Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) model için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım bir dizi çekirdek bileşen Maya geliştirilen ve aynı zamanda çeşitli model sistemleri12,13için uygulanan çip iletişim kuralları kullanır. Değiştirilmiş Histon ve hücredeki DNA arasındaki etkileşimler crosslinking formaldehit ile tarafından korunur. Lysate hazırlık Kromatin parçaları sindirim micrococcal nükleaz ile eşit büyüklükte parçalara çözündürüldükten. Değiştirilmiş Histon Immunoprecipitation ticari veya laboratuvar tarafından üretilen antikorlar ile gerçekleştirilir ve ilişkili herhangi bir DNA izole ve zenginleştirme, qPCR (şekil 1) kullanarak belirli genomik bölge için analiz. Birçok Histon değişiklikler için bu protokolü elde edilen DNA miktarı 25'ten fazla farklı genomik loci qPCR tarafından test etmek için yeterlidir.
Bu çip yöntem çok yönlü bir tek Histon değişiklik dağıtımını birden fazla mutant suşları veya çevre koşulları üzerinde izlemek için veya birden fazla Histon değişiklik, genomik loci birkaç wildtype hücrelerinde test etmek için kullanılabilir. Ayrıca, çok sayıda protokol ya da son derece - veya aşağı-bol Histon işaretleri tespiti en iyi duruma getirmek için kolayca ayarlanabilir bileşenleridir. Son olarak, değiştirilmiş Histon parçasının içinde mayası gerçekleştirmek büyük ölçüde diğer sistemlerde kullanılamaz antikor özgüllük için anahtar denetimlerini kullanmak için fırsat sağlar. Yani, Maya suşları değiştirilmesi için hedeflenir Histon artıkları nokta mutasyon taşıyan oluşturulabilir ve, bazı durumlarda, orada belirli Histon kalıntısı üzerinde değişiklik tromboksan yalnızca tek bir enzim (örn. Histon lizin methyltransferases). Bu nedenle, çip için non-spesifik antikor bağlanması olabilir meydana gelen ve yanlış pozitif sonuçlar üreten ölçüde tahlil için her iki Histon mutant veya enzim silme suşları içinde gerçekleştirilir. Bu denetim yeni geliştirilmiş antikorlar için özellikle değerlidir ve hatta antikor özgüllük bunların kullanımı öncesi korunmuş Histon değişiklikler için diğer sistemlerde doğrulamak için kullanılabilir. Bu yaklaşım (mono-, di - ve gibi tri-metilasyonu), farklı değişiklik devletler arasında ayırt antikor özgüllük test etmek için diğer yöntemleri tamamlar sondalama değiştirilmiş peptidler dizileri ve Histon Batı lekesi gerçekleştirmek de dahil olmak üzere veya oluşturarlar tanımlanmış değişiklikler ile. Genel olarak, mayası yongasında Histon PTMs genom boyunca dinamikleri değerlendirilmesi ve onların yönetmelik yönetim mekanizmaları dissekan için güçlü bir yöntemdir.

<table><tbody><tr><td>Yeast Extract</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20025-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>P20250-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>ThermoScientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12007-0050</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ThermoScientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td>Equivalent to NP-40</td></tr><tr><td>MgCl</td><td>ThermoScientific</td><td>S25533</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20899-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>ThermoScientific</td><td>AC413271000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Amresco</td><td>M107-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>ThermoScientific</td><td>S25533</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>Yeast protease inhibitor cocktail</td><td>VWR</td><td>10190-076</td><td></td></tr><tr><td>25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol</td><td>VWR Life Science</td><td>97064-824</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water</td><td>VWR</td><td>100720-992</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004797</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>ThermoScientific</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>P50220-0.1</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513-50MG</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Bradford Assay Reagent</td><td>ThermoScientific</td><td>23238</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;BSA Standard 2 mg/mL</td><td>ThermoScientific</td><td>23210</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha; H4</td><td>EMD Millipore</td><td>04-858</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha; H4K16ac</td><td>EMD Millipore</td><td>ABE532</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha; H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha; H3K4me2</td><td>Active Motif</td><td>39142</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;High Rox qPCR Mix</td><td>Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix</td><td>ACC-PR2000-L-1000</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G Magnetic Beads</td><td>ThermoScientific</td><td>88803</td><td></td></tr><tr><td>magnetic stand for 1.5mL tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-21359</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Washed Glass Beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Microtube Homogenizer</td><td>Benchmark</td><td>D1030</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z763837-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Gel loading tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-288</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-476-476</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>384-Well PCR Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB-1384W</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Gyratory Floor Shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Model G10</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855485</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation (chip) of histone modifications from saccharomyces cerevisiae

Histon translasyonel modifikasyonlar (PTMs), metilasyon, fosforilasyon ve asetilasyon gibi dinamik olarak bir dizi hücre tarafından alınan sinyaller yanıt olarak bu işaretleri ekleyip enzimler tarafından düzenlenmektedir. Bu PTMS gibi işlemleri gen ifadesi denetim Yönetmeliği için önemli katkı kaynağı sağlamaktadır ve DNA tamir. Kromatin immunoprecipitation (çip) bolluk ve çeşitli tedirginlikler hücreye karşılık olarak genom boyunca birçok Histon PTMs lokalizasyonu dissekan için enstrümantal bir yaklaşım oldu. Burada, post-translationally değiştirilmiş Histon da tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) gerçekleştirmek için çok yönlü bir yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem proteinler ve DNA formaldehit tedavi maya kültürleri kullanarak polietilenin dayanır mantar lysates yenerek, solubilization, Kromatin parçacıkları tarafından micrococcal nükleaz ve Histon DNA'ın immunoprecipitation boncuk tarafından nesil kompleksleri. Faiz Histon işareti ile ilgili DNA saflaştırılmış ve onun zenginleştirme genom boyunca birden çok loci, değerlendirmek için kantitatif PCR analize tabi. Histon işaretleri H3K4me2 ve H4K16ac wildtype ve mutant Maya lokalizasyonu sondalama temsilcisi deneyler veri analizi ve yorumu göstermek için ele alınmıştır. Bu yöntem Histon PTMs çeşitli için uygundur ve farklı mutant suşları ile veya değişiklikleri Kromatin dinamikleri farklı koşullar altında soruşturma için mükemmel bir araç yapma farklı çevresel stresleri varlığında yapılabilir.

Bu iletişim kuralı bir anahtar bileşeni micrococcal nükleaz (MNase) adım 10 içinde özetlenen Kromatin çözünür parçaları sindirmek için kullanılan konsantrasyonu optimize ediyor. Bu ilgi Histon değişiklikler genomik bölgeler itibariyle dağılımı ile ilgili yüksek çözünürlüklü veri elde etmek için önemlidir. Bir MNase titrasyon öncelikle mono-oluşturarlar di-oluşturarlar çözünür Kromatin kesir daha küçük miktarda elde etmek için en uygun konsantrasyo...

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histon değişiklikler Saccharomyces cerevisiae üzerinden Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Burada, tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeüzerinden değiştirilmiş Histon Kromatin immunoprecipitation için bir protokol açıklayın. Immunoprecipitated DNA kantitatif PCR için daha sonra bereket ve Histon translasyonel modifikasyonlar genom boyunca yerelleştirilmesini sorguya eskiden.

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

chromatin-immunoprecipitation-chip-histone-modifications-from

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Unit 1

DNA and Chromosome Structure

SCIENTISTS IN ACTION

12.6K Görüntüleme.  University of Maryland. Burada, tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeüzerinden değiştirilmiş Histon Kromatin immunoprecipitation için bir protokol açıklayın. Immunoprecipitated DNA kantitatif PCR için daha sonra bereket ve Histon translasyonel modifikasyonlar genom boyunca yerelleştirilmesini sorguya eskiden.

Video: Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Hedeflenen<em&gt; In situ</emBudding Maya&gt; Mutajenezis Histon ve Genler

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Genetik

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Histon translasyonel modifikasyon değişiklikler Maya nörodejeneratif Proteinopathy modellerinde karakterize

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription factors (TFs), chromatin regulators, and histone modifications, as well as detecting entire genomes for uncovering TF binding patterns and histone posttranslational modifications. Chromatin-modifying activities, such as histone methylation, are often recruited to specific gene regulatory sequences, causing localized changes in chromatin structures and resulting in specific transcriptional effects. The rice blast is a devastating fungal disease on rice throughout the world and is a model system for studying fungus-plant interaction. However, the molecular mechanisms in how the histone modifications regulate their virulence genes in Magnaporthe oryzae remain elusive. More researchers need to use ChIP-seq to study how histone epigenetic modification regulates their target genes. ChIP-seq is also widely used to study the interaction between protein and DNA in animals and plants, but it is less used in the field of plant pathology and has not been well developed. In this paper, we describe the experimental process and operation method of ChIP-seq to identify the genome-wide distribution of histone methylation (such as H3K4me3) that binds to the functional target genes in M. oryzae. Here, we present a protocol to analyze the genome-wide distribution of histone modifications, which can identify new target genes in the pathogenesis of M. oryzae and other filamentous fungi.

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Here, we present a protocol to analyze the genome-wide distribution of histone modifications, which can identify new target genes in the pathogenesis of M. oryzae and other filamentous fungi.

Magnaporthe oryzae'de Kromatin İmmün Önkapipitasyon Dizileme Yöntemi Kullanılarak Histone Modifikasyonlarının Genom Çapında Analizi

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

Maya Hücrelerinden Locus'a Özgü Kromatin İzolasyonu

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone octamer. Chromatin is defined as the entity of NCPs and numerous other protein complexes, including transcription factors, chromatin remodeling and modifying enzymes. It is still unclear how these protein-DNA interactions are orchestrated at the level of specific genomic loci during different stages of the cell cycle. This is mainly due to the current technical limitations, which make it challenging to obtain precise measurements of such dynamic interactions. Here, we describe an improved method combining site-specific recombination with an efficient single-step affinity purification protocol to isolate a single-copy gene locus of interest in its native chromatin state. The method allows for the robust enrichment of the target locus over genomic chromatin, making this technique an effective strategy for identifying and quantifying protein interactions in an unbiased and systematic manner, for example by mass spectrometry. Further to such compositional analyses, native chromatin purified by this method likely reflects the in vivo situation regarding nucleosome positioning and histone modifications and is, therefore, amenable to further structural and biochemical analyses of chromatin derived from virtually any genomic locus in yeast.

Yazar Spotlight: Kromatin Araştırmalarını Geliştirme ve Yüksek Zenginleştirme Locus'a Özgü Kromatin İzolasyon Protokolü ile Sınırlamaların Üstesinden Gelme 

This protocol presents a locus-specific chromatin isolation method based on site-specific recombination to purify a single-copy gene locus of interest in its native chromatin context from budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...

Biyokimya

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. Additionally, epigenetic chromatin modifications, like histone methylation, have an important role for establishing and maintaining specific cell fates within this process. The vast majority of histone methylation occurs on the flexible histone tail, which is accessible to histone modifiers, erasers, and histone reader proteins. In contrast, H3K79 methylation is located in the globular domain of histone 3 and is implicated in different developmental functions. H3K79 methylation is evolutionarily conserved and can be found in a wide range of species from Homo sapiens to Saccharomyces cerevisiae. The modification occurs in different cell populations within organisms, including neural progenitors. The location of H3K79 methylation in the globular domain of histone 3 makes it difficult to assess. Here, we present methods to isolate and culture cortical progenitor cells (CPCs) from embryonic cortical brain tissue (E11.5-E14.5) or cerebellar granular neuron progenitors (CGNPs) from postnatal tissue (P5-P7), and to efficiently immunoprecipitate H3K79me2 for quantitative PCR (qPCR) and genome-wide sequencing.

We present an effective and reproducible method to isolate and culture neural progenitor cells from embryonic and postnatal brain tissue for chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - a histone mark located within the globular domain of histone 3.

Yalıtım ve sinirsel ataları Kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lizin 79 Dimethylation Mark tarafından takip tarımı

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Nörobilim

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

Biyoloji

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Histon değişiklikler Saccharomyces cerevisiae üzerinden Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Hedeflenen

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması

Histon translasyonel modifikasyon değişiklikler Maya nörodejeneratif Proteinopathy modellerinde karakterize

Magnaporthe oryzae'de Kromatin İmmün Önkapipitasyon Dizileme Yöntemi Kullanılarak Histone Modifikasyonlarının Genom Çapında Analizi

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

Saccharomyces cerevisiae'de Tek Kopya Gen Lokus Kromatin Saflaştırması

Yalıtım ve sinirsel ataları Kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lizin 79 Dimethylation Mark tarafından takip tarımı

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Sumoylation ve geliştirici Maya Kinetokor Proteinler Ndc10 ve Ndc80 ve ubikuitinasyomınun Tespiti verir Protein Saflaştırma Tekniği