저자는 유용한 토론에 대 한 녹색 연구소의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 NIH 교부 금 R03AG052018와 E.M.G.에 R01GM124342에 의해 부분적으로 지원

1. 미리 바인딩합니다 자성 구슬에 항 체
<ol>
	<li>단백질 A/G 자석 구슬을 잘 혼합 하 고 1.5 mL 튜브에의 한 immunoprecipitation (IP) 샘플 당 자석 구슬 20 µ L를 전송. 참고: pipetting 구슬, 넓은 구멍, 낮은 고정 팁 사용.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 구슬 가진 튜브를 놓고 구슬 튜브에 수집을 허용 합니다. 제거는 상쾌한.</li>
	<li>워시 3 번 감기 Tris 버퍼 염 분 (TBS) (50 mM Tris HCl pH 7.5, 150 mM NaCl)의 1 mL와 구슬.</li>
	<li>구슬 및 항 체의 적절 한 금액에 TBS의 200 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 8 rpm에 회전 참고: 많은 히스톤 PTM 항 체에 대 한 IP 당 항 체의 1-3 µ g은 충분 합니다. 그러나, 적정 실험은 적절 한 농도 결정 하기 위해 권장 됩니다. 잘 특징이, 상업 히스톤 PTM 항 체에 대 한 권장된 농도 정확 하 고 게시 된 보고서 또는 제품 문학에서 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 비즈를 놓고는 상쾌한을 제거 합니다. Tbs.의 1 mL와 함께 그들을 씻어합니다</li>
	<li>20 µ L IP 샘플 당 TBS의 플러스는 추가 5 µ L (pipetting 오류)의 경우 tbs.의 구슬 resuspend 참고: 구슬 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 단기 사용까지.</li>
</ol>
2. 성장 효 모 세포
<ol>
	<li>적절 한 긴장에의 한 식민지와 YPD (10% 효 모 추출 물, 펩 20% 및 20% 포도 당)의 10 mL를 접종 하 고 하룻밤 220 rpm에서 떨고 인큐베이터에서에서 30 ° C에서 그것을 성장.</li>
	<li>600에서 광학 밀도 측정 nm (OD600) 효 모 문화는 분 광 광도 계를 사용 하 여. OD600 문화를 희석 100 ml YPD 새로운 플라스 크에서 0.2 =.</li>
	<li>중간 로그 단계를 도달할 때까지 220 rpm에서 떨고 인큐베이터에서 30 ° C에서 세포를 성장 (OD600 = 0.6-0.8).</li>
</ol>
3. 생체 내에서 dna 단백질의 가교
<ol>
	<li>문화 중순 로그 단계에 도달, 1% 포름알데히드의 최종 농도 대 한 매체에 직접 37% 포름알데히드의 2.7 mL를 추가 합니다. 25 ° C (또는 상 온)에서 통에 플라스 크를 전송 하 고 15 분 동안 50 rpm에서 그것을 흔들어.</li>
	<li>매체에 2.5 M 글리신의 5 mL을 추가 하 고는 포름알데히드를 풀기 위해 5 분 동안 실 온에서 50 rpm에서 떨고 계속.</li>
	<li>병을 원심 회전 4 ° c.에서 5 분에 대 한 5800 x g에서 셀을 셀 전송 상쾌한을 가만히 따르다.
	<ol>
		<li>차가운 TBS의 45 ml에서 그들을 resuspending에 의해 세포를 세척 하 고 현 탁 액 50 mL 원뿔 튜브로 전송. 4 ° c.에 3 분 동안 2800 x g에서 튜브를 회전 제거는 상쾌한.</li>
		<li>세척 감기 10 mL에 세포 세포의 용 해 버퍼 (50 mM Tris HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), 1% nonidet octyl phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), 4 ° C에서 저장 된) 칩.</li>
		<li>2800 x g 4 ° c.에 3 분에 세포를 스핀 제거는 상쾌한. 참고: 셀 액체 질소로 냉동 고 추가 처리까지-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 효 모 Lysates 확인
<ol>
	<li>1mm phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF) 찬 칩 세포의 용 해 버퍼의 1 mL에 효 모 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 1:1,000 희석 셀 resuspend 유리 구슬의 200 µ L을 포함 하는 2.0 mL 스크류 캡 튜브에 정지를 전송.</li>
	<li>4 ° C에서 고속 교 반 장치를 치고 구슬 셀 전송 및 구슬 30 6 번 이길 각 s. 각 구슬 구타 사이 적어도 1 분 동안 얼음에 셀을 계속.</li>
	<li>젤 팁을 로드를 사용 하 여 1.5 mL 튜브에는 lysate 전송. 원심 lysate 15500 x g 4 ° c.에 20 분에서</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 펠 릿 MNase 소화 버퍼의 250 µ L에서 resuspend (10 mM Tris HCl pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 m m MgCl2, 21 m m CaCl2, 1 %NP-40, 4 ° C에서 저장 된) 부드럽게 위아래로 pipetting으로.</li>
	<li>반응에 MNase의 2.5 µ L를 추가 합니다. 반전 하 여 그들을 부드럽게 혼합 4-6 시간 및 즉시 20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 그것을 품 어. 참고: MNase의 새로운 주식을 사용 하는 경우 다이제스트 조건 최적화 되어야 합니다. 프로토콜에 대 한 10 단계를 참조 하십시오.</li>
	<li>즉시 반응을 중지 10 mM EDTA의 최종 농도 0.5 M EDTA의 5 µ L을 추가 하는 얼음에 튜브를 놓습니다. 반전에 의해 그들을 부드럽게 혼합.</li>
	<li>원심 15500 x g 4 ° C에서 15 분에 반응 하 고 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한 전송. 참고: 수용 성 (소화) chromatin는 상쾌한에 있을 것입니다. 펠 릿에는 아무것도 소화 하 고 불용 성 세포 파편을 포함 되어 있습니다.</li>
</ol>
5. Immunoprecipitate (IP) 히스톤 수정
<ol>
	<li>Bradford 분석 실험을 사용 하 여 각 MNase 출시 chromatin 분수의 단백질 농도 결정 합니다. 8 일회용 큐 벳 플러스 테스트할 각 단백질 샘플 1 추가 베트의 각 하 Bradford 시의 1 mL를 추가 합니다.
	<ol>
		<li>2 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 재고 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>브래드 퍼 드 시 약의 1 mL에 BSA의 다음 농도 달성 하기 위해 적절 한 볼륨 추가: 0 μ g/mL, 0.5 μ g/mL, 1 μ g/mL, 2 μ g/mL, 4 μ g/mL, 6 μ g/mL, 8 μ g/mL와 10 μ g/mL. 추가 큐 벳을 MNase 출시 chromatin 분수의 2 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>Parafilm의 작은 조각으로 각 베트의 상단을 커버 하 고 반전 있는 큐 벳 4-6 회 솔루션을 잘 혼합. 15 분 동안 실 온에서 큐 벳을 품 어.</li>
		<li>595에서 흡 광도 측정 표시 광 분 광 광도 계를 사용 하 여 표준 곡선과 실험 샘플에 대 한 nm. 참고: 사용 하지 않고 BSA 베트 (0 μ g/mL) 빈 첫 번째 측정 이전 분 광 광도 계.</li>
		<li>BSA의 다른 농도 분 광 광도 계와 관련 된 소프트웨어 또는 스프레드시트 소프트웨어에 대 한 흡 광도 값을 사용 하 여 표준 곡선을 플롯. 표준 곡선 및 희석 요소 사용 (1: 500)에 따라 각각 chromatin 분수 샘플의 단백질 농도 계산 하 흡 광도 값을 사용 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>각 IP에 대 한 1 mL의 최종 볼륨을 도달 칩 세포의 용 해 버퍼 사용 MNase 출시 chromatin 분수에서 총 단백질의 50 µ g을 추가 합니다. 참고: lysate 당 하나 이상의 IP를 설정 하는 경우 만들은 lysate의 마스터 믹스와 칩, 세포의 용 해 버퍼 및 IP에 대 한 개별 튜브에 aliquot 1 mL.</li>
	<li>입력된 샘플으로 처리할 수 있는 IP 믹스에서 100 µ L을 제거 합니다. 7.1 단계까지-20 ° C에서 입력된 샘플을 동결. 참고: 모든 나머지 chromatin 샘플 수 있습니다-20 ° C에서 냉동 수 있으며 필요한 경우 후속 IP에 대 한 사용.</li>
	<li>미리 바인딩된 각 IP 샘플에 항 체로 자기 단백질 A/G 구슬의 20 µ L를 추가 합니다.</li></ol>3 h (표준)에 대 한 8 rpm에서 샘플을 회전 또는 (선호) 하는 경우 4 ° c.에 하룻밤

6. 워시 IPs 및 히스톤 DNA 복합 Elute
<ol>
	<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 구슬 튜브 측에 수집 하자. 상쾌한 한 피 펫을 사용 하 여 제거 합니다. 씻어 아래 버퍼의 각각의 1 mL와 연속적으로 구슬.
	<ol>
		<li>4 ° C에서 5 분 동안 8 rpm에 회전 하 고, 마그네틱 스탠드에 비즈를 배치 하 고, 상쾌한, 제거 하 고 다음 버퍼를 추가 하 여 각 세척을 수행: 2 x-칩 세포의 용 해 버퍼, 2 x-높은 소금 워시 버퍼 (50 mM Tris HCl pH 7.5, 500 m m NaCl, 1 mM EDTA 1 %NP-40, 4 ° C에 저장), 1 x-LiCl/세제 워시 버퍼 (10 mM Tris HCl pH 8.0, 250mm LiCl, 1 mM EDTA, 1 NP-40%, 1% 나트륨 deoxycholate, 4 ° C에 저장), 1 x-테 (10 mM Tris HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 4 ° C에서 저장 된), 및 1 x-테.</li>
		<li>마지막 테 세척, 구슬 구슬의 대부분 다른 0.5 mL 튜브를 세척 하 고 나머지 구슬 전송 하 테의 전송 테의 0.5 mL를 사용 하 여 새로운 튜브를 전송할.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>갓 만든된 칩 차입 버퍼 (1 %SDS, 1mm NaHCO3)의 250 µ L를 추가 합니다. 짧게 솔루션 소용돌이입니다. 실 온에서 15 분 동안 8 rpm에서 샘플을 회전 합니다.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 구슬 수집 합니다. 신중 하 게 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 구슬 피하십시오. 참고:는 eluate immunoprecipitated 단백질 및 관련된 DNA를 포함 한다.</li>
	<li>구슬에 칩 차입 버퍼의 또 다른 250 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 15 분 동안 8 rpm에서 샘플을 회전 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 포함 하는 첫 번째 차입 튜브는 상쾌한 전송. 필요한 경우, 구슬 방해를 피하기 위해 모든 IPs에 대 한 작은 볼륨 (240 µ L)를 제거 합니다.</li>
</ol>
7. 역 단백질-DNA Crosslinks
<ol>
	<li>입력된 샘플을 해 동 하 고 각 입력에 칩 차입 버퍼의 400 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>모두 입력 및 IP 샘플, 반전 또는 튜브를 flicking 여 잘 5 M NaCl, 20 mg/mL glycogen의 5 µ L 및 가수분해 K. 믹스 20 mg/mL의 12.5 µ L의 20 µ L를 추가 합니다. 밤새 65 ° C 물 욕조에 샘플을 품 어.</li>
</ol>
8. 정화 하 고 DNA를 집중
<ol>
	<li>입력 및 IP 샘플 10 mg/mL RNase A의 10 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 37 ° C 물 욕조에 샘플을 품 어.</li>
	<li>수성 솔루션을 페 놀: chlorofrom:isoamyl 알코올 (25:24:1 PCI)의 600 µ L을 추가 하 고 그들을 잘 섞는다. 실 온에서 5 분 동안 15500 x g에서 그들을 회전 합니다.
	<ol>
		<li>새로운 튜브에 수성 층을 제거 합니다. PCI의 600 µ L을 추가 하 고 그들을 잘 섞는다. 실 온에서 5 분 동안 15500 x g에서 튜브를 회전 합니다. 새로운 튜브에 수성 층을 전송. 주의: 증기 두건 및 PCI 작업할 때 적절 한 개인 보호 장비를 착용 합니다. 기관 지침에 의해 지시 하는 대로 액체와 고체 폐기물을 처분.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>0.1 x 볼륨 3 M 나트륨 아세테이트의 DNA를 침전 시키기 위하여 감기 100% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 반전 튜브 4-6 회 솔루션을 잘 혼합. 하룻밤-20 ° C에서 품 어.
	<ol>
		<li>4 ° c.에 20 분 동안 15500 x g에서 튜브를 회전 조심 스럽게 제거는 피 펫과 상쾌한.</li>
		<li>차가운 70% 에탄올의 1 mL에 펠 릿을 세척. 4 ° c.에서 10 분 동안 15500 x g에서 회전 조심 스럽게 제거는 피 펫과 상쾌한.</li>
		<li>약 20 분 (때까지 완전히 건조) 후드에서 펠 릿 건조 IP 샘플 nuclease 무료 물 50 µ L에서 resuspend 그리고 nuclease 무료 물 100 µ L 입력된 샘플을 resuspend. 정량 Pcr 수행까지-20 ° C에서 DNA 샘플을 저장 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 양이 많은 PCR (정량) 풍부한 게놈 지역 검색
<ol>
	<li>뇌관의 각 집합에 대 한 정량 마스터 믹스를 확인 합니다. 한 반응 2 x qPCR 믹스의 5 µ L, 20 µ M 앞으로 뇌관의 0.25 µ L 및 20 µ M 역 뇌관의 0.25 µ L를 포함 한다. 참고: 적절 한 뇌관 디자인 및 정량 실험을 위한 테스트 설명 다른14,,1516.</li>
	<li>각 DNA 샘플에 대 한 DNA 마스터 믹스를 확인 합니다. 한 반응 DNA의 0.5 µ L 및 nuclease 무료 물 4.0 µ L를 포함 한다.</li>
	<li>384 잘 정량 접시에 각 잘을 5.5 µ L의 적절 한 뇌관 마스터 믹스와 적절 한 DNA 마스터 믹스의 4.5 µ L를 추가 합니다. 참고: 각 음에 뇌관 믹스의 5.5 µ L를 추가 시작 합니다. 4.5 µ L의 DNA 혼합을 추가 하기 전에 실내 온도에 1 분 동안 200 x g에서 접시를 회전 합니다.</li>
	<li>접시와 상 온에서 1 분 동안 200 x g에서 스핀을 인감을 준수 합니다.</li>
	<li>정량 Pcr 실시간 정량 시스템을 사용 하 여 다음 조건 수행: 95 ° C 3 분;에 대 한 10 95 ° C의 40 주기 s, 55 ° C 30에 대 한 s; 녹는 곡선 65 ° C ~ 0.5 ° C 증가, 5와 95 ° C s.</li>
	<li>각 뇌관 쌍 계산는 정량에 사용 하는 5% 입력된 샘플을 기준으로 IP 샘플의 백분율 입력 합니다. 기술 PCR triplicates의 의미를 사용 하 여 계산을 수행 하. 참고: 경우 상당한 변이에서 관찰 PCR triplicates 마스터 믹스 구성, pipetting 오류 및 384-잘 접시에 우물 사이의 교차 오염에 주의와 정량 Pcr을 반복 하는 것이 좋습니다.<ol>
		<li>원시 Cq 값에서 희석 비율을 대표 하는 사이클의 수를 빼서 Cq 100%에 대 한 입력 값을 조정 합니다. 참고: 5% 입력 20-fold,는 4.32 사이클 (로그2 20 = 4.32)와의 희석 비율을 나타냅니다.</li>
		<li>%2로 입력 계산 ^ (Cq입력 -CqIP) 100을 곱한.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. (권장 하기 전에 첫 번째 전체 칩 실험) MNase 다이제스트 조건 결정
<ol>
	<li>2.1 이전 프로토콜의 4.4 통해 단계. 충분히 lysate chromatin 포함 된 펠 릿의 MNase 소화의 여러 샘플을 생성 하는 프로토콜을 확장. 4.4 단계에서 MNase 소화 버퍼의 1.25 mL에 산 탄을 resuspend. 5 샘플 튜브는 각 약 수 MNase 소화 버퍼에 resuspended chromatin 펠 릿의 250 µ L를 포함 합니다.</li>
	<li>0, 1.5, 2.5, 5 추가 각 튜브를 MNase의 µ L. 반전 하 여 그들을 부드럽게 혼합 4-6 시간 및 즉시 20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 튜브를 품 어.</li>
	<li>즉시 얼음에 튜브를 배치 하 고 10mm 최종 농도 0.5 M EDTA의 5 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 합니다.</li></ol>반전 하 여 솔루션을 부드럽게 혼합.
	<li>4 ° C에서 15 분 동안 15500 x g에서 튜브 원심 고 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한 전송.</li>
	<li>1% 최종 농도 (10% 주식 솔루션의 25 µ L)와 NaHCO3 1.5 mL 튜브에 샘플을 0.1 m M 최종 농도 (1 M 재고 솔루션의 25 µ L)에 SDS을 추가 합니다.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 샘플 5 M NaCl, 5 µ L의 glycogen, 그리고 20 mg/mL 가수분해 K의 12.5 µ L의 20 µ L를 추가 합니다. 품 어 그들 65 ° C에서 하룻밤.</li>
	<li>10 mg/mL RNaseA의 10 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>수성 해결책에 PCI의 300 µ L을 추가 하 고 그들을 잘 섞는다. 실 온에서 5 분 동안 15500 x g에서 회전 합니다.
	<ol>
		<li>새로운 튜브에 수성 층을 제거 합니다. PCI의 300 µ L을 추가 하 고 잘 혼합. 실 온에서 5 분 동안 15500 x g에서 회전 합니다. 새로운 튜브에 수성 층을 전송.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>0.1 x 볼륨 3 M 나트륨 아세테이트 (보통 ~ 30 µ L)의 DNA를 침전 시키기 위하여 감기 100% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 반전 튜브 4-6 회를 잘 섞어. 밤새-80 ° C 1 시간 또는-20 ° C에서 튜브를 품 어.
	<ol>
		<li>4 ° c.에 20 분 동안 15500 x g에서 튜브를 회전 조심 스럽게 제거는 피 펫과 상쾌한.</li>
		<li>차가운 70% 에탄올의 1 mL에 펠 릿을 세척. 4 ° c.에서 10 분 동안 15500 x g에서 회전</li>
		<li>펠 릿 후드 약 20 분에서 (또는 때까지 완전히 건조) 건조 보자. Nuclease 무료 물 30 µ L에 산 탄을 resuspend.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>염료를 로드 하는 DNA를 추가 하 고 2 %agarose 20 µ L을 실행 시각화 하 젤 소화 DNA.</li>

<ol>
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J., Andrade, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+primers+and+probes+for+quantitative+real-time+PCR+methods.">Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods.</a> Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).</li><li>Briggs, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+lysine+4+methylation+is+mediated+by+Set1+and+required+for+cell+growth+and+rDNA+silencing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).</li><li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation+of+histone+H3+Lys+4+in+coding+regions+of+active+genes.">Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes.</a> P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).</li><li>Pokholok, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+map+of+nucleosome+acetylation+and+methylation+in+yeast.">Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast.</a> Cell. 122 (4), 517-527 (2005).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Paf1+complex+is+required+for+histone+H3+methylation+by+COMPASS+and+Dot1p:+linking+transcriptional+elongation+to+histone+methylation.">The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation.</a> Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).</li><li>South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K4+methyltransferase+Set1+is+involved+in+maintenance+of+ergosterol+homeostasis+and+resistance+to+Brefeldin+A.">H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A.</a> P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).</li><li>Margaritis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+repressive+mechanisms+for+histone+3+lysine+4+methylation+through+promoting+3'-end+antisense+transcription.">Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3'-end antisense transcription.</a> PLoS Genet. 8 (9), e1002952 (2012).</li><li>Jezek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+methyltransferases+Set5+and+Set1+have+overlapping+functions+in+gene+silencing+and+telomere+maintenance.">The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance.</a> Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).</li><li>Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sir2p+and+Sas2p+opposingly+regulate+acetylation+of+yeast+histone+H4+lysine16+and+spreading+of+heterochromatin.">Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin.</a> Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).</li><li>Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+gradient+of+histone+acetylation+established+by+Sas2p+and+Sir2p+functions+as+a+shield+against+gene+silencing.">Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing.</a> Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).</li><li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity.">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기에 설명 된 절차는 immunoprecipitation에 의해 효 모 세포에 수정 된 히스톤과 관련 된 DNA의 효율적인 복구에 대 한 수 있습니다. 이것은 정량 Pcr 증폭 지역 농축 결정 관심 영역 또는 특정 히스톤 수정의 소모는 뇌관을 사용 하 여 옵니다. 개발 되 고 있는 방법으로 거의 20 년 전에 불구 하 칩 히스톤 수정 상태 다른 게놈 영역에 다양 한 조건 하에서 조사 정의 분석 결과 남아 있습니다. 칩 결합 차세...

히스톤의 동적 포스트 번역 상 수정 (PTM) 녹음 방송, 복제, DNA 수리1,2를 포함 하 여 많은 DNA 템플릿 프로세스에 대 한 주요 규제 메커니즘입니다. 풍부 하 고 이러한 프로세스와 부수적인 수정된 히스톤의 정확한 지 방화를 결정 하는 능력은 따라서 셀에 서로 다른 조건 하에서 그들의 규칙을 이해 중요 합니다. Chromatin immunoprecipitation (칩)의 개발을 주로 dna, 단백질의 상호 작용의 생 화 확 적인 연구에서 특히 생체 외에서 방법 화학 crosslinkers를 사용 하 여 비롯 된 방법으로 평가 하는 필요와 결합 된 동적 자연 단백질 DNA 상호 작용에서 vivo에서 그리고 게놈3,,45의 특정 지역에서. 정량 PCR (정량) 및 시퀀싱 기술의 발전 또한 양적 비교와 전체 게놈, DNA 단백질 상호 작용에서 해 부를 위한 강력한 도구를 만드는 걸쳐 칩 실험을 수행 하는 기능을 확장 했다 여러 수준입니다.
현재, 칩은 연구 그룹 게놈의 chromatin 중재 규정에 관심이 필요한 메서드 수정된 히스톤과는 특정 genomic 소재 시 에 사이의 물리적 링크를 직접 심문 없습니다 유사한 방법으로 vivo. 다음 세대 시퀀싱 게놈6,7 통해 히스톤 수정 지도를 사용 하 여이 방법의 변이 사용할 수 있지만 이러한 접근 다른 과학적인 질문 및 그들의 규모, 비용을 해결할 수 있습니다. 그리고 기술 리소스 일부 연구 그룹에 대 한 제한 될 수 있습니다. 또한, 대상된 칩-정량은이 보완 하기 위해 필요한 접근 방법을 모두를 제공 하 여 epigenomic 데이터 집합에서 결과 유효성을 검사 하 고 시퀀싱 전에 칩 프로토콜 최적화. 그러나 질량 분석 기반 접근,8,,910,11, 등장 게놈 지역 연관 표시는 또한 히스톤의 완전 한 보완을 식별이 접근 제한이 몇 가지는 게놈의 지구를 탐색할 수 및 그들이 필요한 전문 기술 및 계측을 모든 연구 그룹을 사용할 수 없습니다. 따라서, 칩 풍부 및 히스톤 수정 epigenetics, chromatin의 게놈 기능 규정에 관심이 모든 연구 단체에 대 한 다양 한 조건에서의 배포를 분석 하는 기초 방법에 남아 있다.
여기, 신진 누 룩을 사용 하 여 칩 모델 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) 히스톤 PTMs chromatin에서의 분포를 조사 하는 방법을 설명 합니다. 이 이렇게 다양 한 칩 프로토콜 누 룩 개발 하 고 다양 한 모델 시스템12,13에 적용의 핵심 구성 요소에 의존 합니다. 수정된 히스톤과 DNA는 셀에서 간의 상호 작용은 포름알데히드와 가교에 의해 유지 됩니다. Lysate 준비 다음 염색 질 조각은 micrococcal nuclease와 소화에 의해 균일 하 게 크기의 조각으로 solubilized는. Immunoprecipitation 수정된 히스톤의 상업적 또는 실험실에서 생성 된 항 체와 함께 수행 되 고 모든 관련된 DNA 분리 및 정량 (그림 1)를 사용 하 여 게놈 지역에서 농축에 대 한 분석. 많은 히스톤 수정에 대 한이 프로토콜에서 얻은 DNA의 양을 정량 하 여 25 개 이상의 다른 게놈 loci를 테스트 하기 위해 충분 하다.
이 칩 방법은 매우 다양 한 여러 개의 돌연변이 체 긴장 또는 환경 조건, 단일 히스톤 수정 배포 모니터링을 위한 또는 wildtype 세포 게놈 loci의 숫자에 여러 개의 히스톤 수정 테스트입니다. 또한, 프로토콜의 수많은 구성 요소 중 높은-또는 미 천 한-풍부한 히스톤 부호의 최적화를 쉽게 조정 가능 하다. 마지막으로, 싹 트는 효 모에 수정 된 히스톤의 칩을 수행 크게 다른 시스템에서 사용할 수 있는 항 체 특이성에 대 한 주요 컨트롤을 사용 하 여 기회를 제공 한다. 즉, 효 모 종자 수 수정에 대 한 타겟으로하는 히스톤 잔류물에서 점 돌연변이 생성 되 고, 어떤 경우에는 특정 히스톤 잔류물에 수정 catalyzes만 단일 효소 (예. 히스톤 lysine methyltransferases)입니다. 따라서, 칩 중 히스톤 돌연변이 또는 효소 삭제 긴장 시험의 범위는 비 특정 바인딩 항 체의 발생 그리고 거짓 긍정적인 결과 생성 하에서 수행할 수 있습니다. 이 컨트롤은 새로 개발 된 항 체에 특히 중요 하 고 심지어 다른 시스템에서 사용 하기 전에 보존된 히스톤 수정에 대 한 항 체 특이성을 확인 하는 데 사용할 수 있습니다. 이 이렇게 보완 (예: 모노-디-, 트라이-메 틸), 다른 수정 상태 사이에서 구별 하는 항 체 특이성을 테스트 하려면 다른 방법 수정된 펩 티 드의 배열 조사 등 수행 하는 히스톤의 서쪽 오 점 또는 nucleosomes 정의 수정입니다. 전반적으로, 싹 트는 효 모에 칩 게놈 전체 PTMs 히스톤의 역학을 평가 하 고 그들의 규칙을 경 세 하는 메커니즘을 해 부에 대 한 강력한 방법입니다.

<table><tbody><tr><td>Yeast Extract</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20025-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>P20250-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>ThermoScientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12007-0050</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ThermoScientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td>Equivalent to NP-40</td></tr><tr><td>MgCl</td><td>ThermoScientific</td><td>S25533</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20899-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>ThermoScientific</td><td>AC413271000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Amresco</td><td>M107-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>ThermoScientific</td><td>S25533</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>Yeast protease inhibitor cocktail</td><td>VWR</td><td>10190-076</td><td></td></tr><tr><td>25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol</td><td>VWR Life Science</td><td>97064-824</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water</td><td>VWR</td><td>100720-992</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004797</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>ThermoScientific</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>P50220-0.1</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513-50MG</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Bradford Assay Reagent</td><td>ThermoScientific</td><td>23238</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;BSA Standard 2 mg/mL</td><td>ThermoScientific</td><td>23210</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha; H4</td><td>EMD Millipore</td><td>04-858</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha; H4K16ac</td><td>EMD Millipore</td><td>ABE532</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha; H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha; H3K4me2</td><td>Active Motif</td><td>39142</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;High Rox qPCR Mix</td><td>Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix</td><td>ACC-PR2000-L-1000</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G Magnetic Beads</td><td>ThermoScientific</td><td>88803</td><td></td></tr><tr><td>magnetic stand for 1.5mL tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-21359</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Washed Glass Beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Microtube Homogenizer</td><td>Benchmark</td><td>D1030</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z763837-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Gel loading tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-288</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-476-476</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>384-Well PCR Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB-1384W</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Gyratory Floor Shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Model G10</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855485</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation (chip) of histone modifications from saccharomyces cerevisiae

Acetylation, 메 틸 화, 인 산화, 같은 히스톤 포스트 번역 상 수정 (PTMs), 동적으로 추가 하거나 셀에서 수신 하는 신호에 대 한 응답에서 이러한 마크를 제거 하는 효소에 의해 통제 된다. 이러한 PTMS 유전자 식 제어 등 프로세스의 규정을 주요 참여자 이며 DNA 복구. Chromatin immunoprecipitation (칩) 풍요로 움과 응답 셀에 다양 한 섭으로 게놈에 걸쳐 많은 히스톤 PTMs의 지역화 해 부를 위한 경 음악 접근 되었습니다. 여기, 싹 트는 효 모 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) 에서 post-translationally 수정된 히스톤의 칩을 수행 하기 위한 다양 한 방법을 설명 합니다. 이 방법은 단백질 및 효 모 문화의 포름알데히드 처리를 사용 하 여 DNA의 가교에 의존 구슬 치고, micrococcal nuclease에 의해 chromatin 파편의 가용 화 및 히스톤 DNA의 immunoprecipitation에 의해 효 모 lysates의 세대 단지입니다. DNA의 히스톤 마크와 관련 된 정화는 게놈에 걸쳐 여러 loci에서 그것의 농축을 평가 하기 위해 정량 PCR 분석에 복종 하 고. Wildtype에 돌연변이 효 모 히스톤 부호 H3K4me2와 H4K16ac의 지역화를 조사 하는 대표적인 실험 데이터 분석 및 해석 설명 되어 있습니다. 이 메서드는 다양 한 히스톤 PTMs 적합 하며 다른 돌연변이 체 긴장 또는 그것에 게 다른 조건 하에서 chromatin 역학에서 변경 내용을 조사 하기 위한 훌륭한 도구를 만드는 다양 한 환경 스트레스의 존재를 수행할 수 있습니다.

이 프로토콜의 한 핵심 구성 요소는 단계 10에서 설명한 녹는 조각으로는 염색 질을 소화 하는 데 사용 된 micrococcal nuclease (MNase)의 농도 최적화입니다. 이것은 관심의 게놈 영역에서 히스톤 수정 배포에 대 한 고해상도 데이터를 얻기 위해 중요입니다. MNase 적정 수용 성 염색 질 분수에 디 nucleosomes의 작은 금액으로 주로 모노 nucleosomes를 달성 하기 위해 가장 적합 한 농도 결...

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Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

히스톤 수정 Saccharomyces cerevisiae 에서 chromatin Immunoprecipitation (칩)

여기, 우리는 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에서 수정 된 히스톤의 염색 질 immunoprecipitation에 대 한 프로토콜을 설명합니다. Immunoprecipitated DNA가 풍부 하 고 지역화의 게놈을 통해 히스톤 포스트 번역 상 수정 양이 많은 PCR 이후에 사용 됩니다.

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

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Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Unit 1

DNA and Chromosome Structure

SCIENTISTS IN ACTION

12.6K 조회수.  University of Maryland. 여기, 우리는 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에서 수정 된 히스톤의 염색 질 immunoprecipitation에 대 한 프로토콜을 설명합니다. Immunoprecipitated DNA가 풍부 하 고 지역화의 게놈을 통해 히스톤 포스트 번역 상 수정 양이 많은 PCR 이후에 사용 됩니다.

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Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

대상<em&gt; 현장에서</em신진 효모에서&gt; 돌연변이 유발 히스톤의 유전자

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

연구

유전학

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

효 모 신경 Proteinopathy 모델에서 특성화 히스톤 포스트 번역 상 수정 변경

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription factors (TFs), chromatin regulators, and histone modifications, as well as detecting entire genomes for uncovering TF binding patterns and histone posttranslational modifications. Chromatin-modifying activities, such as histone methylation, are often recruited to specific gene regulatory sequences, causing localized changes in chromatin structures and resulting in specific transcriptional effects. The rice blast is a devastating fungal disease on rice throughout the world and is a model system for studying fungus-plant interaction. However, the molecular mechanisms in how the histone modifications regulate their virulence genes in Magnaporthe oryzae remain elusive. More researchers need to use ChIP-seq to study how histone epigenetic modification regulates their target genes. ChIP-seq is also widely used to study the interaction between protein and DNA in animals and plants, but it is less used in the field of plant pathology and has not been well developed. In this paper, we describe the experimental process and operation method of ChIP-seq to identify the genome-wide distribution of histone methylation (such as H3K4me3) that binds to the functional target genes in M. oryzae. Here, we present a protocol to analyze the genome-wide distribution of histone modifications, which can identify new target genes in the pathogenesis of M. oryzae and other filamentous fungi.

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Here, we present a protocol to analyze the genome-wide distribution of histone modifications, which can identify new target genes in the pathogenesis of M. oryzae and other filamentous fungi.

마그나포테 오리자에서 크로마틴 면역 침전 시퀀싱 방법을 이용한 히스톤 수정 분포의 게놈 전체 분석

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

효모 세포에서 locus-specific Chromatin 분리

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone octamer. Chromatin is defined as the entity of NCPs and numerous other protein complexes, including transcription factors, chromatin remodeling and modifying enzymes. It is still unclear how these protein-DNA interactions are orchestrated at the level of specific genomic loci during different stages of the cell cycle. This is mainly due to the current technical limitations, which make it challenging to obtain precise measurements of such dynamic interactions. Here, we describe an improved method combining site-specific recombination with an efficient single-step affinity purification protocol to isolate a single-copy gene locus of interest in its native chromatin state. The method allows for the robust enrichment of the target locus over genomic chromatin, making this technique an effective strategy for identifying and quantifying protein interactions in an unbiased and systematic manner, for example by mass spectrometry. Further to such compositional analyses, native chromatin purified by this method likely reflects the in vivo situation regarding nucleosome positioning and histone modifications and is, therefore, amenable to further structural and biochemical analyses of chromatin derived from virtually any genomic locus in yeast.

저자 스포트라이트: Advancing Chromatin Research and Overcoming Limitations with a High-Enrichment Locus-Specific Chromatin Isolation Protocol (고농축 유전자좌 특이적 크로마틴 분리 프로토콜로 크로마틴 연구 발전 및 한계 극복) 

This protocol presents a locus-specific chromatin isolation method based on site-specific recombination to purify a single-copy gene locus of interest in its native chromatin context from budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae (맥주효모균의 단일 복제 유전자 자리, 염색질 정제)

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...

생화학

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. Additionally, epigenetic chromatin modifications, like histone methylation, have an important role for establishing and maintaining specific cell fates within this process. The vast majority of histone methylation occurs on the flexible histone tail, which is accessible to histone modifiers, erasers, and histone reader proteins. In contrast, H3K79 methylation is located in the globular domain of histone 3 and is implicated in different developmental functions. H3K79 methylation is evolutionarily conserved and can be found in a wide range of species from Homo sapiens to Saccharomyces cerevisiae. The modification occurs in different cell populations within organisms, including neural progenitors. The location of H3K79 methylation in the globular domain of histone 3 makes it difficult to assess. Here, we present methods to isolate and culture cortical progenitor cells (CPCs) from embryonic cortical brain tissue (E11.5-E14.5) or cerebellar granular neuron progenitors (CGNPs) from postnatal tissue (P5-P7), and to efficiently immunoprecipitate H3K79me2 for quantitative PCR (qPCR) and genome-wide sequencing.

We present an effective and reproducible method to isolate and culture neural progenitor cells from embryonic and postnatal brain tissue for chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - a histone mark located within the globular domain of histone 3.

절연 및 신경 창시자 Chromatin-Immunoprecipitation 히스톤 3 리 79 Dimethylation 마크의 뒤의 재배

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

신경과학

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

생물학

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

히스톤 수정 Saccharomyces cerevisiae 에서 chromatin Immunoprecipitation (칩)

요약

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대상

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑

효 모 신경 Proteinopathy 모델에서 특성화 히스톤 포스트 번역 상 수정 변경

마그나포테 오리자에서 크로마틴 면역 침전 시퀀싱 방법을 이용한 히스톤 수정 분포의 게놈 전체 분석

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae (맥주효모균의 단일 복제 유전자 자리, 염색질 정제)

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ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술