המחברים רוצה להודות חברי המעבדה ירוק לדיונים מועיל. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מענקים NIH R03AG052018 ו- R01GM124342 כדי E.M.G.

1. מראש לאגד נוגדנים כדי Beads מגנטי
<ol>
	<li>מערבבים היטב את חלבון A/G beads מגנטי ולהעביר µL 20 של beads מגנטי לכל אחד immunoprecipitation (IP) מדגם צינור 1.5 מ. הערה: כאשר pipetting חרוזים, השתמש בעצות נשא רחב, נמוך-השמירה.</li>
	<li>למקם את הצינור עם חרוזים עמדה מגנטי ולאפשר חרוזים לאסוף בצד של הצינור. הסר את תגובת שיקוע.</li>
	<li>לשטוף את החרוזים 3 פעמים עם 1 מ ל תמיסת מלח קרות באגירה טריס (TBS) (50 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 150 מ מ NaCl).</li>
	<li>להוסיף 200 µL של TBS חרוזים, הכמות המתאימה של נוגדן. סובב ב rpm 8 בן לילה ב 4 º C. הערה: עבור רבים היסטון PTM נוגדנים, 1-3 µg של נוגדנים לכל IP מספיקה. עם זאת, ניסויים טיטור מומלצים לקביעת ריכוזים המתאים. ריכוזי המומלצת עבור מסחר, מאופיין היטב היסטון PTM נוגדנים לעיתים קרובות מדויק, ניתן למצוא דיווחים שפורסמו או מסמכי מוצרים.</li>
	<li>הכנס את החרוזים עמדה מגנטי ולהסיר את תגובת שיקוע. לשטוף אותם עם 1 מ"ל של TBS.</li>
	<li>Resuspend את החרוזים µL 20 של TBS IP לדגימה בתוספת של µL 5 נוספים (במקרה של שגיאה pipetting) של TBS. הערה: החרוזים ניתן לאחסן לטווח קצר ב 4 ° C עד השימוש.</li>
</ol>
2. לגדל תאי שמרים.
<ol>
	<li>לחסן 10 מ"ל של YPD (תמצית שמרים 10%, 20% peptone ו- 20% דקסטרוז) עם מושבה בודדת של המתח המתאים, לגדל את זה ב 30 מעלות צלזיוס לילה ב חממה חזק-220 סל"ד.</li>
	<li>מודדים את צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) של התרבות שמרים באמצעות ספקטרופוטומטרים. לדלל את תרבות יתר600 = 0.2 ב- 100 מ ל בקבוקון חדש YPD.</li>
	<li>לגדל את התאים ב- 30 מעלות צלזיוס חממה חזק-220 סל"ד עד שיגיעו יומן באמצע שלב (OD600 = 0.6-0.8).</li>
</ol>
3. in Vivo Crosslinking של חלבונים ל- DNA
<ol>
	<li>כאשר תרבויות מגיעים יומן באמצע שלב, להוסיף מ 2.7 ל 37% פורמלדהיד ישירות אל המדיום, עבור ריכוז סופי של 1% פורמלדהיד. להעביר את הבקבוקון מטרף-25 ° C (או בטמפרטורת החדר), לנער את זה ב-50 סל ד למשך 15 דקות.</li>
	<li>הוסף 5 מ של 2.5 מטר גליצין למדיום ולהמשיך רועד ב-50 סל ד בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות כדי להרוות את הפורמלדהייד.</li>
	<li>העבר את התאים כדי צנטריפוגה בקבוקים, לסובב את התאים ב 5800 g x עבור 5 דקות ב 4 º C. Decant תגובת שיקוע.
	<ol>
		<li>לשטוף את התאים על ידי resuspending אותם ב- 45 מ של TBS קר ולהעביר את המתלים לתוך צינור חרוטי 50 מ. לסובב את הצינור ב 2800 g x עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>שטיפת שהתאים 10 מ"ל של קור צ'יפ פירוק מאגר (50 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 150 מ מ NaCl, 1 מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), nonidet 1% תמצית phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), המאוחסנים ב 4 ° C).</li>
		<li>לסובב את התאים ב 2800 g x עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע. הערה: התאים יכולים להיות קפוא עם חנקן נוזלי, המאוחסנים ב- 80 ° C עד עיבוד נוסף.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. הפוך שמרים Lysates
<ol>
	<li>Resuspend התאים 1 מ"ל קר מאגר פירוק שבב עם 1 מ phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF), 1:1,000 דילול של מעכב פרוטאז שמרים קוקטייל. להעביר את המתלים צינור פקקי בורג 2.0 mL המכיל 200 µL של חרוזי זכוכית.</li>
	<li>העבר את התאים חרוז להכות מכשירי עצבנות במהירות גבוהה ב 4 ° C והיכו חרוז 6 פעמים במשך 30 s כל. שמור את התאים על קרח לפחות 1 דקות בין כל חרוז פועם.</li>
	<li>להעביר את lysate אל צינור 1.5 mL באמצעות ג'ל טעינת טיפים. Centrifuge lysate-g x 15,500 עבור 20 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב µL 250 MNase עיכול מאגר (10 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 10 מ מ NaCl, 3 מ מ MgCl2, 21 מ מ CaCl2, 1% NP-40, המאוחסנים ב 4 ° C) על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה.</li>
	<li>להוסיף 2.5 µL של MNase התגובות. מערבבים בעדינות על-ידי היפוך 4 - 6 פעמים מיד דגירה אותו באמבט מים 37 º C למשך 20 דקות. הערה: תקציר תנאים צריך להיות מותאם כאשר מלאי חדש של MNase משמש. ראה שלב 10 לפרוטוקול.</li>
	<li>מיד במקום הצינורות על קרח כדי לעצור את התגובה ולהוסיף 5 µL של EDTA 0.5 M עבור ריכוז סופי של 10 מ מ EDTA. מערבבים בעדינות אותם על-ידי היפוך.</li>
	<li>Centrifuge את התגובה ב g x 15,500 למשך 15 דקות ב 4 ° C, להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5 מ. הערה: מסיסים כרומטין (מתעכל) יהיה תגובת שיקוע. בגדר מכיל שאריות תאים מעוכל משהו ואני לא מסיסים.</li>
</ol>
5. Immunoprecipitate (IP) שונו שינויים היסטוניים
<ol>
	<li>לקבוע ריכוז חלבון של כל שבר כרומטין שפורסמו MNase שימוש assay ברדפורד. להוסיף 1 מ"ל של ברדפורד מגיב אחד של וואקום חד פעמיות 8 בתוספת 1 cuvette נוספים עבור כל דגימה חלבון להיבדק.
	<ol>
		<li>להכין פתרון מניות של 2 מ"ג/מ"ל אלבומין שור (BSA).</li>
		<li>הוסף את אמצעי האחסון המתאים כדי להשיג את ריכוזי BSA. הבאים ב- 1 מ"ל של ריאגנט ברדפורד: 0 μg/mL, 0.5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL, 6 μg/mL, 8 μg/mL, μg/מ"ל. להוסיף 2 μL של השבר כרומטין שפורסמו MNase כימיקלים נוספים.</li>
		<li>לכסות את החלק העליון של כל cuvette עם חתיכה קטנה של מצלמות-מיקרוסקופים, היפוך וואקום של 4 - 6 פעמים לערבב הפתרון טוב. דגירה של וואקום בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.</li>
		<li>באמצעות ספקטרופוטומטרים אור, גלוי למדוד את ספיגת-595 nm עבור עיקול רגיל ודגימות ניסיוני. הערה: השתמש את cuvette ללא BSA (0 μg/mL) כדי בלנק את ספקטרופוטומטרים לפני נטילת המדידה הראשונה.</li>
		<li>להתוות עקומה רגיל באמצעות הערכים ספיגת ריכוזים שונים של BSA בתוכנה המקושרת את ספקטרופוטומטרים או תוכנת הגיליון האלקטרוני. בהתבסס על העקומה סטנדרטי, הגורם דילול בשימוש (שבערך), להשתמש בערכים ספיגת לחישוב ריכוז חלבון עבור כל אחת הדגימות שבר כרומטין.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>עבור כל IP, להוסיף 50 µg של חלבון הכולל השבר כרומטין שפורסמו MNase למאגר פירוק שבב להגיע נפח סופי של 1 מ"ל. הערה: אם הגדרת IP אחד או יותר לכל lysate, להפוך את תערובת הבסיס של lysate, צ'יפ פירוק מאגר ו- aliquot 1 מ"ל עד צינורות בודדים עבור ה-IP.</li>
	<li>הסר 100 µL המיקס IP כדי התהליך כמו הדוגמה קלט. להקפיא את הדגימה קלט ב-20 ° C עד שלב 7.1. הערה: דוגמה כרומטין הנותרים יכולים גם להיות קפוא ב-20 ° C, המשמש IP הבאים במקרה הצורך.</li>
	<li>הוסף 20 µL של חלבון A/G beads מגנטי מראש קשורים נוגדנים כדי כל מדגם ה-IP.</li></ol>לסובב דגימת ה-rpm 8 עבור 3 h (סטנדרטי) או למשך הלילה (אם מועדפת) ב 4 º C.

6. לשטוף את כתובות ה-Ip ואת Elute מתחמי היסטון-DNA
<ol>
	<li>למקם את הצינורות עמדה מגנטי ותנו חרוזים לאסוף בצד של הצינור. הסר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה. לשטוף את החרוזים במרוכז עם 1 מ"ל של כל אחד המאגרים להלן.
	<ol>
		<li>לבצע כל כביסה על-ידי מסתובב ב rpm 8 עבור 5 דקות ב 4 ° C, הצבת חרוזים עמדה מגנטי, הסרת תגובת שיקוע והוספת מאגר הבא: 2 x - מאגר פירוק שבב, 2x - מאגר שטיפת מלח גבוהה (50 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 500 מ מ NaCl, 1 מ"מ EDTA 1% NP-40, המאוחסנים ב 4 ° C), 1 x - LiCl/סבון שטיפת מאגר (10 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 250 מ מ LiCl, 1 מ"מ EDTA, 1% NP-40, deoxycholate 1% נתרן, המאוחסנים ב 4 ° C), 1 x - TE (10 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 1 מ"מ EDTA, המאוחסנים ב 4 ° C), ו- x 1 - טה.</li>
		<li>עם שטיפת טה האחרון, העברת חרוזי צינור באמצעות 0.5 מ של טה להעברת רוב החרוזים, ואז עוד 0.5 מ"ל של טה שטוף הצינורית ולהעביר החרוזים הנותרים.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>להוסיף 250 µL צ'יפס טרי • תנאי מאגר (1% מרחביות, 1 מ NaHCO3). מערבולת הפתרון בקצרה. לסובב את הדגימות-סל ד 8 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>למקם את צינור עמדה מגנטי ולאסוף את החרוזים. בזהירות להעביר את תגובת שיקוע צינור ולהימנע החרוזים. הערה: eluate מכיל חלבונים immunoprecipitated אנ-איי.</li>
	<li>להוסיף עוד 250 µL שבב • תנאי מאגר חרוזים. לסובב את הדגימות-סל ד 8 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר בזהירות את תגובת שיקוע הצינור המכיל את • תנאי הראשון. במידת הצורך, הסר אמצעי אחסון קטן יותר (240 µL) עבור כל כתובות ה-Ip שלא להפריע למטופלים את החרוזים.</li>
</ol>
7. הפוך חלבון-DNA Crosslinks
<ol>
	<li>להפשיר את דגימות קלט ולהוסיף 400 µL שבב • תנאי מאגר כל קלט.</li>
	<li>הקלט והן דגימות ה-IP, להוסיף 20 µL של NaCl 5 מ', µL 5 של 20 מ"ג/מ"ל גליקוגן ו 12.5 µL של 20 מ"ג/מ"ל Proteinase ק. לערבב היטב על ידי היפוך או מצליף צינורות. דגירה בדגימות באמבט מים 65 ° C בין לילה.</li>
</ol>
8. לטהר ולרכז את הדנ א
<ol>
	<li>להוסיף 10 µL של 10 מ"ג/מ"ל RNase A קלט ודוגמאות IP. דגירה בדגימות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
	<li>להוסיף µL 600 של פנול: chlorofrom:isoamyl אלכוהול (25:24:1 PCI) לתמיסה מימית ומערבבים אותם היטב. לסובב אותם ב- g x 15,500 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
	<ol>
		<li>להסיר את שכבת מימית כדי צינור חדש. להוסיף µL 600 של PCI ומערבבים אותם היטב. לסובב את הצינור ב- g x 15,500 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר את השכבה המימית צינור חדש. התראה: לעבוד בשכונה fume, ללבוש ציוד מגן אישי המתאים כאשר עובדים עם PCI. השלך פסולת נוזלי ומוצק שהומלץ על ידי המוסדיים הנחיות.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הוסף 0.1 x נפח של 3 מ' סודיום אצטט 1 מ"ל אתנול 100% קר, כדי לזרז את ה-DNA. היפוך הצינור 4 - 6 פעמים לערבב הפתרון טוב. דגירה ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
	<ol>
		<li>לסובב את הצינור ב g x 15,500 כעשרים דקות ב 4 º C. הסר בזהירות את תגובת שיקוע עם פיפטה.</li>
		<li>לשטוף את צניפה ב 1 מ"ל אתנול 70% קר. לסובב אותו ב 15,500 g x 10 דקות ב 4 º C. הסר בזהירות את תגובת שיקוע עם פיפטה.</li>
		<li>מילה נהדרת כדורי בשכונה במשך כ 20 דקות (עד יבש לחלוטין). Resuspend דגימות ה-IP ב- 50 µL של נוקלאז ללא מים, resuspend דגימות קלט ב 100 µL של נוקלאז ללא מים. לאחסן דגימות ה-DNA ב-20 ° C עד ביצוע qPCR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. כמותיים PCR (qPCR) כדי לזהות מועשר אזורים גנומית
<ol>
	<li>להפוך את תערובת הבסיס qPCR עבור כל ערכה של צבעי יסוד. תגובה אחת מכילה 5 µL של תערובת x qPCR 2, µL 0.25 של 20 מיקרומטר פריימר לפנים ו 0.25 µL של 20 מיקרומטר פריימר הפוכה. הערה: פריימר מתאים לעיצוב ובדיקה עבור ניסויים qPCR הם תיארו במקום14,15,16.</li>
	<li>להפוך תערובות מאסטר הדנ א כל מדגם ה-DNA. תגובה אחת מכיל 0.5 µL של ה-DNA µL 4.0 של נוקלאז ללא מים.</li>
	<li>להוסיף µL 5.5 של המיקס מאסטר פריימר מתאים ו- 4.5 µL של המיקס הבסיס המתאים DNA מכל קידוח על צלחת qPCR 384-. טוב. הערה: להתחיל עם הוספת 5.5 µL של המיקס תחל בכל טוב. לסובב את הצלחת ב g x 200 עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר לפני הוספת 4.5 µL של המיקס הדנ א.</li>
	<li>דבקים החותם צלחת, ספין-200 g x עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לבצע qPCR באמצעות מערכת qPCR בזמן אמת עם התנאים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 40 מחזורי 95 ° C עבור 10 s, 55 ° C ל 30 s; עקומת ההיתוך 65 ° C עד 95 ° C עם גידול של 0.5 ° C, 5 s.</li>
	<li>עבור כל זוג פריימר, לחשב את הקלט אחוז של המדגם IP ביחס המדגם קלט 5% בשימוש qPCR. השתמש אמצעי triplicates ה-PCR טכנית לבצע את החישובים. הערה: אם ניכר וריאציה הוא ציין את triplicates ה-PCR, מומלץ לחזור על qPCR עם תשומת לב מיקס מאסטר קומפוזיציה, pipetting שגיאות של זיהום צולב בין בארות בצלחת 384-. טוב.<ol>
		<li>התאם את הערכים סי על המידע ל- 100% על-ידי הפחתת מספר מחזורים המייצג את הגורם לדילול מתוך הערכים סי raw. הערה: חמישה אחוזים קלט מייצג גורם לדילול של 20-fold, אשר שווה ל 4.32 מחזורים (כניסה2 20 = 4.32).</li>
		<li>לחשב את אחוז קלט כ- 2 ^ (סיקלט - סיIP) מוכפלים ב- 100.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. לקבוע תנאים תקציר MNase (מומלץ מראש הראשון מלא שבב ניסוי)
<ol>
	<li>בצע את שלבים 2.1 דרך 4.4 של הפרוטוקול הקודם. קנה המידה של פרוטוקול לייצר מספיק lysate עבור מספר דוגמאות MNase עיכול בגדר המכילות כרומטין. שלב 4.4, resuspend כדורי ב- mL 1.25 MNase עיכול המאגר. Aliquot הדגימות 5 מנורות אז כי כל אחד מכיל 250 µL של בגדר כרומטין resuspended במאגר עיכול MNase.</li>
	<li>להוסיף 0, 1.5, 2.5 או 5 µL של MNase על כל שפופרת. מערבבים בעדינות על-ידי היפוך 4 - 6 פעמים מיד דגירה הצינורות בתוך אמבט מים 37 º C למשך 20 דקות.</li>
	<li>להפסיק תגובות על-ידי הנחת צינורות על הקרח מיד והוספת µL 5 של EDTA 0.5 M עבור ריכוז סופי של 10 מ מ.</li></ol>מערבבים בעדינות את הפתרון על-ידי היפוך.
	<li>Centrifuge הצינורות ב g x 15,500 למשך 15 דקות ב 4 ° C, להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5 מ.</li>
	<li>להוסיף מרחביות 1% ריכוז סופי (25 µL של 10% הפתרון מניות) ו- NaHCO3 כדי ריכוז סופי 0.1 M (25 µL של פתרון מניות 1 מ') הדגימות בתוך הצינורות 1.5 mL.</li>
	<li>הוסף 20 µL של NaCl 5 מ', µL 5 של גליקוגן ו 12.5 µL של 20 מ"ג/מ"ל proteinase K הדגימות בתוך הצינורות 1.5mL. תדגור אותם ב 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה</li>
	<li>להוסיף 10 µL של RNaseA 10 מ"ג/מ"ל. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
	<li>להוסיף 300 µL של PCI לתמיסה מימית ומערבבים אותם היטב. ספין-g x 15,500 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
	<ol>
		<li>להסיר שכבה מימית כדי צינור חדש. להוסיף 300 µL של PCI ומערבבים היטב. ספין-g x 15,500 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר שכבה מימית צינור חדש.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הוסף 0.1 x נפח של 3 מ' סודיום אצטט (בדרך כלל µL ~ 30) 1 מ"ל אתנול 100% קר, כדי לזרז את ה-DNA. היפוך הצינור 4 - 6 פעמים כדי לערבב היטב. דגירה בן לילה את הצינור ב- 80 ° C 1 h או-20 ° C.
	<ol>
		<li>לסובב את הצינור ב g x 15,500 כעשרים דקות ב 4 º C. הסר בזהירות את תגובת שיקוע עם פיפטה.</li>
		<li>לשטוף את כדורי ב 1 מ"ל אתנול 70% קר. ספין ב 15,500 g x 10 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>תן שכדורי מילה נהדרת. את הוד כ 20 דקות (או עד יבש לחלוטין). Resuspend כדורי ב 30 µL של נוקלאז ללא מים.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>להוסיף את ה-DNA בטעינת צבע, להפעיל 20 µL agarose 2% ג'ל להמחיש מתעכל הדנ א.</li>

<ol>
	<li>Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choose+Your+Own+Adventure:+The+Role+of+Histone+Modifications+in+Yeast+Cell+Fate.">Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate.</a> J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).</li><li>Suganuma, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+combinatorial+functions+of+histone+modifications.">Signals and combinatorial functions of histone modifications.</a> Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).</li><li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking:+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures.">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li><li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde:+evidence+that+histone+H4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene.">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li><li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo:+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes.">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li><li>Lefran&#231;ois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+yeast+ChIP-Seq+using+multiplex+short-read+DNA+sequencing.">Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing.</a> BMC Genomics. 10, 37 (2009).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins+associated+with+specific+genomic+Loci.">Purification of proteins associated with specific genomic Loci.</a> Cell. 136 (1), 175-186 (2009).</li><li>Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChAP-MS:+a+method+for+identification+of+proteins+and+histone+posttranslational+modifications+at+a+single+genomic+locus.">ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus.</a> Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).</li><li>Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+systems+approaches+for+the+analysis+of+histone+modification+readout.">Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout.</a> Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).</li><li>Soldi, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ChroP+approach+combines+ChIP+and+mass+spectrometry+to+dissect+locus-specific+proteomic+landscapes+of+chromatin.">The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Kuo, M. H., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cross-linking+and+immunoprecipitation+for+studying+dynamic+Protein:DNA+associations+in+a+chromatin+environment.">In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment.</a> Methods. 19 (3), 425-433 (1999).</li><li>Meluh, P. B., Broach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+analysis+of+yeast+chromatin.">Immunological analysis of yeast chromatin.</a> Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).</li><li>Rozen, S., Skaletsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers.">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).</li><li>Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+approach+to+RT-qPCR-Publishing+data+that+conform+to+the+MIQE+guidelines.">A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines.</a> Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).</li><li>Rodr&#237;guez, A., Rodr&#237;guez, M., C&#243;rdoba, J. J., Andrade, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+primers+and+probes+for+quantitative+real-time+PCR+methods.">Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods.</a> Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).</li><li>Briggs, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+lysine+4+methylation+is+mediated+by+Set1+and+required+for+cell+growth+and+rDNA+silencing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).</li><li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation+of+histone+H3+Lys+4+in+coding+regions+of+active+genes.">Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes.</a> P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).</li><li>Pokholok, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+map+of+nucleosome+acetylation+and+methylation+in+yeast.">Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast.</a> Cell. 122 (4), 517-527 (2005).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Paf1+complex+is+required+for+histone+H3+methylation+by+COMPASS+and+Dot1p:+linking+transcriptional+elongation+to+histone+methylation.">The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation.</a> Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).</li><li>South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K4+methyltransferase+Set1+is+involved+in+maintenance+of+ergosterol+homeostasis+and+resistance+to+Brefeldin+A.">H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A.</a> P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).</li><li>Margaritis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+repressive+mechanisms+for+histone+3+lysine+4+methylation+through+promoting+3'-end+antisense+transcription.">Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3'-end antisense transcription.</a> PLoS Genet. 8 (9), e1002952 (2012).</li><li>Jezek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+methyltransferases+Set5+and+Set1+have+overlapping+functions+in+gene+silencing+and+telomere+maintenance.">The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance.</a> Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).</li><li>Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sir2p+and+Sas2p+opposingly+regulate+acetylation+of+yeast+histone+H4+lysine16+and+spreading+of+heterochromatin.">Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin.</a> Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).</li><li>Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+gradient+of+histone+acetylation+established+by+Sas2p+and+Sir2p+functions+as+a+shield+against+gene+silencing.">Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing.</a> Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).</li><li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity.">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

ההליך המתואר כאן מאפשר התאוששות יעיל של DNA המשויכים ששונה שינויים היסטוניים בתאים שמרים על-ידי immunoprecipitation. זה מלווה qPCR באמצעות תחל אשר להגביר את האזורים עניין לקבוע העשרה המקומיים או דלדול של שינויים ספציפיים היסטון. למרות מפותח כשיטה לפני כמעט 20 שנה, שבב עדיין וזמינותו המכונן על חקירת מצב...

השינוי post-translational דינמי (PTM) של שינויים היסטוניים הוא מנגנון רגולטורי מפתח עבור תהליכים תבניות DNA רבים, כולל תמלול, שכפול ה-DNA תיקון1,2. היכולת לקבוע את השפע ואת לוקליזציה מדויק של שינויים היסטוניים ששונה והמצוות בתהליכים אלה ולכן קריטי להבנת שלהם תקנה בתנאים שונים בתא. הפיתוח של כרומטין immunoprecipitation (chIP) כשיטה בעיקר נבעה מחקרים ביוכימיים של האינטראקציות של חלבונים עם ה-DNA, במיוחד במבחנה שיטות שימוש crosslinkers כימיים, בשילוב עם הצורך להעריך באופי הדינמי של חלבון-DNA אינטראקציות ויוו ועל אזורים ספציפיים של גנום3,4,5. קידום של ה-PCR כמותי (qPCR), טכנולוגיות רצף התרחב גם את היכולת לבצע ניסויים שבב עם השוואות כמותיים ועל -פני כל הגנום, שהופך אותו לכלי רב עוצמה לנתח אינטראקציות חלבון-דנ א- רמות מרובות.
כיום, השבב הוא שיטה נדרש עבור כל קבוצת המחקר מתעניין בתיווך כרומטין רגולציה של הגנום כפי ישנן שיטות דומות לא ישירות חוקר את הקשר הפיזי בין של היסטון ששונה מסוים גנומית לוקוס ב ויוו. למרות וריאציות של שיטה זו באמצעות רצף הדור הבא כדי למפות היסטון שינויים בכל רחבי הגנום6,7 זמינים, גישות אלה רשאי לפנות שאלות מדעיות שונות, קנה המידה שלהם, עלות והגבלת משאבים טכניים עלולה להיות לכמה קבוצות מחקר. בנוסף, יישוב שבב-qPCR יש צורך להשלים את אלה גישות על-ידי מתן שתי שיטות לייעל את פרוטוקול שבב לפני רצף וכדי לאמת תוצאות epigenomic datasets. ספקטרומטר מסה גישות מבוססות על זיהוי מגוון היסטון סימנים הקשורים עם אזורים גנומית יש גם הופיעו8,9,10,11, עם זאת, אלה גישות יש כמה מגבלות לגבי אשר אזורים בגנום פתור והן דורשות מומחיות טכנית ומכשור לא יהיה זמין כל קבוצות מחקר. לכן, שבב נשאר שיטה למעין לניתוח את השפע ואת ההפצה של היסטון שינויים בתנאים מגוונים עבור כל קבוצות מחקר אפיגנטיקה, כרומטין, ברגולציה של פונקציות גנומית.
כאן, אנו מתארים שיטה עבור השבב באמצעות שמרים ניצני דגם האפייה (cerevisiae ס) לחקור את ההפצה של היסטון PTMs-כרומטין. גישה זו נסמכת על מספר רכיבים מרכזיים של פרוטוקולים השבב פותח שמרים וחלים גם מודל מגוון מערכות12,13. אינטראקציות בין שינויים היסטוניים שונה ל- DNA בתא נשמרים על ידי crosslinking עם פורמלין. בעקבות הכנה lysate, שברי כרומטין solubilized לחלקים בגודל אחיד על ידי עיכול עם נוקלאז micrococcal. Immunoprecipitation של שינויים היסטוניים ששונה מתבצע באמצעות נוגדנים או מסחרי או שנוצרו על-ידי מעבדה, אנ-איי הוא מבודד וניתח העשרה על אזורים מסוימים גנומית באמצעות qPCR (איור 1). עבור שינויים רבים היסטון, כמות ה-DNA המתקבל פרוטוקול זה מספיקה לבדיקה יותר מ 25 לוקוסים גנומית שונים על ידי qPCR.
שיטה זו שבב היא רב תכליתי עבור ניטור ההתפלגות של שינוי היסטון יחיד על-פני מספר זנים מוטציה או תנאים סביבתיים, או לבדיקת שינויים מרובים היסטון בתאים wildtype במספר רב של לוקוסים גנומית. יתר על כן, רכיבים רבים של הפרוטוקול הם מתכוונן בקלות כדי למטב את זיהוי סימני מאוד - או נחות-בשפע גם היסטון. בסופו של דבר, מבצע שבב של שינויים היסטוניים ששונה ניצני שמרים מספק את ההזדמנות לשימוש בפקדים מפתח נוגדנים ירידה לפרטים שאינם זמינים בעיקר במערכות אחרות. כלומר, זני שמרים ניתן להפיק שנושאים מוטציות נקודה ב שאריות היסטון זה מיועדים להחלת השינוי, במקרים מסוימים, יש רק אנזים יחיד זה מזרז את השינוי על משקע היסטון מסוים (למשל-היסטון ליזין methyltransferases). לכן, שבב יכול להתבצע גם היסטון מוטציה או אנזים מחיקה זנים כדי assay במידה שאליו שאינם ספציפיים קשירה של הנוגדן עשוי להיות המתרחשים ותפיק תוצאות חיוביות שגויות. פקד זה חשובה במיוחד עבור פיתח נוגדנים, אפילו יכול לשמש כדי לאמת ירידה לפרטים נוגדנים עבור השינויים שנשמרת היסטון לפני השימוש במערכות אחרות. גישה זו משלימה שיטות אחרות כדי לבדוק נוגדנים ירידה לפרטים להבחין בין מדינות שונות שינוי (כגון מונו-, די - tri-מתילציה), לרבות חקירת מערכים של פפטידים ששונה וביצוע שהכלים המערבי של שינויים היסטוניים או נוקליאוזומים עם שינויים מוגדר. בסך הכל, לשבב ניצני שמרים היא שיטה חזקה עבור הערכת את הדינמיקה של היסטון PTMs ברחבי הגנום, לנתח את המנגנונים השולטים שלהם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="876">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:301px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:164px;">Y20025-1000.0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Peptone</td>
			<td style="width:301px;">Research Products International (RPI)</td>
			<td style="width:164px;">P20250-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Dextrose</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">BP350-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Glycine</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific</td>
			<td>AC12007-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Tris</td>
			<td style="width:301px;">Amresco</td>
			<td style="width:164px;">0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">NaCl</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:164px;">74385</td>
			<td>Equivalent to NP-40</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">MgCl</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">S25533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:244px;">CaCl2</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:164px;">20899-25G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">LiCl</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">AC413271000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:301px;">Amresco</td>
			<td style="width:164px;">M107-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Sodium Deoxycholate</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:164px;">30970-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:164px;">S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:244px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">S25533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Yeast protease inhibitor cocktail</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10190-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:301px;">VWR Life Science</td>
			<td>97064-824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Ethanol</td>
			<td style="width:301px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:164px;">E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:301px;">VWR</td>
			<td style="width:164px;">100720-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Micrococcal Nuclease</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Glycogen</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Proteinase K</td>
			<td>Research Products International (RPI)</td>
			<td>P50220-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">RNase A&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#160;Bradford Assay Reagent</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">23238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#160;BSA Standard 2 mg/mL</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td>23210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#945; H4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>04-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#945; H4K16ac</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ABE532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#945; H3</td>
			<td style="width:301px;">Abcam</td>
			<td style="width:164px;">ab1791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#945; H3K4me2</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#160;High Rox qPCR Mix</td>
			<td>Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix</td>
			<td>ACC-PR2000-L-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Protein A/G Magnetic Beads</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td>88803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">magnetic stand for 1.5mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI-21359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Acid-Washed Glass Beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:164px;">G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#160;Microtube Homogenizer</td>
			<td style="width:301px;">Benchmark</td>
			<td>D1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z763837-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Gel loading tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Cuvettes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">50-476-476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Parafilm</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:301px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">384-Well PCR Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB-1384W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">&#160;Gyratory Floor Shaker</td>
			<td style="width:301px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:164px;">Model G10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:301px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:164px;">ND-2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">&#160;Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:301px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:164px;">1855485</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation (chip) of histone modifications from saccharomyces cerevisiae

היסטון שינויים post-translational (PTMs), כגון acetylation, מתילציה זרחון, מוסדרים באופן דינאמי על ידי סדרה של אנזימים להוסיף או להסיר את הסימנים האלו בתגובה לאותות שהתקבלו על-ידי התא. PTMS אלה אנו רותמים את ויסות תהליכים כגון בקרת ביטוי גנים ותיקון דנ א. Immunoprecipitation כרומטין (chIP) כבר גישה אינסטרומנטלית ניקוד את השפע ואת לוקליזציה של PTMs היסטון רבים ברחבי הגנום בתגובה לפליטת מגוונים אל התא. . הנה, מתוארת שיטה רב-תכליתי לביצוע שבב של שינויים היסטוניים post-translationally ששונה מ שמרים ניצני האפייה (cerevisiae ס) . שיטה זו מתבססת על crosslinking של חלבונים ודנ א באמצעות טיפול פורמלדהיד שמרים תרבויות, דור של שמרים lysates מאת חרוז מכות, solubilization של כרומטין קטעים על ידי נוקלאז micrococcal, immunoprecipitation של היסטון-DNA מתחמי. DNA הקשורים עם הסימן היסטון עניין מטוהרים, שעבר ניתוח ה-PCR כמותי כדי להעריך את העשרת ב לוקוסים מרובות ברחבי הגנום. נציג ניסויים חיטוט הלוקליזציה של הסימנים היסטון H3K4me2, H4K16ac wildtype, שמרים מוטציה נידונות להפגין ניתוח נתונים ופרשנות. שיטה זו מתאימה למגוון רחב של היסטון PTMs ואת יכולה להתבצע עם זנים מוטציה או בנוכחות לחצים סביבתיים מגוונים, שהופך אותו כלי מצוין עבור חוקרים לשינויים כרומטין dynamics בתנאים שונים.

מרכיב מפתח אחד של פרוטוקול זה הוא אופטימיזציה של הריכוז של נוקלאז micrococcal (MNase) נעשה שימוש כדי לעכל את כרומטין לחלקים מסיסים, כפי שמתואר בשלב 10. . זה קריטי עבור קבלת נתונים ברזולוציה גבוהה ביחס להתפלגות שינויים היסטון-גנומית אזורים מעניינים רבים. טיטור MNase צריכה להתבצע כדי ל?...

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון שינויים של האפייה

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור כרומטין immunoprecipitation של שינויים היסטוניים ששונה מ שמרים ניצני האפייה. Immunoprecipitated DNA משמש לאחר מכן PCR כמותי לחקור את השפע ואת לוקליזציה של שינויים post-translational היסטון ברחבי הגנום.

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

chromatin-immunoprecipitation-chip-histone-modifications-from

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Unit 1

DNA and Chromosome Structure

SCIENTISTS IN ACTION

12.6K Views.  University of Maryland. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור כרומטין immunoprecipitation של שינויים היסטוניים ששונה מ שמרים ניצני האפייה. Immunoprecipitated DNA משמש לאחר מכן PCR כמותי לחקור את השפע ואת לוקליזציה של שינויים post-translational היסטון ברחבי הגנום.

Video: Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

ניתוח של C-KIT ליגנד האמרגן באמצעות Immunoprecipitation הכרומטין

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

הכרומטין Immunoprecipitation (שבב) ב עכבר T-cell שורות

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

כרומטין Immunoprecipitation של רקמת שומן חום מאתר

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

כרומטין Immunoprecipitation שימוש בנוקלאוסים מיקרוקוקל בתאי מיונקים

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription factors, histone modifications, and other DNA-associated proteins. ChIP-seq data can also be used to find differential binding of transcription factors in different environmental conditions or cell types. Initially, ChIP was performed through hybridization on a microarray (ChIP-chip); however, ChIP-seq has become the preferred method through technological advancements, decreasing financial barriers to sequencing, and massive amounts of high-quality data output. Techniques of performing ChIP-seq with bacterial biofilms, a major source of persistent and chronic infections, are described in this protocol. ChIP-seq is performed on Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm and planktonic cells, targeting the master biofilm regulator, CsgD, to determine differential binding in the two cell types. Here, we demonstrate the appropriate amount of biofilm to harvest, normalizing to a planktonic control sample, homogenizing biofilm for cross-linker access, and performing routine ChIP-seq steps to obtain high quality sequencing results.

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

Chromatin immunoprecipitation coupled with next-generation sequencing (ChIP-seq) is a method used to establish interactions between transcription factors and the genomic sequences they control. This protocol outlines techniques for performing ChIP-seq with bacterial biofilms, using Salmonella enterica serovar Typhimurium bacterial biofilm as an example.

גילוי מטרות רגולטוריות של CsgD באמצעות כרומטין Immunoprecipitation ורצף של תפוקה גבוהה (שבב-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-seq) is widely used to identify genome-wide binding locations of DNA-binding proteins. However, the ChIP-seq method is limited by its heterogeneity in length of sonicated DNA fragments and non-specific background DNA, resulting in low mapping resolution and uncertainty in DNA-binding sites. To overcome these limitations, the combination of ChIP with exonuclease digestion (ChIP-exo) utilizes 5&#8217; to 3&#8217; exonuclease digestion to trim the heterogeneously sized immunoprecipitated DNA to the protein-DNA crosslinking site. Exonuclease treatment also eliminates non-specific background DNA. The library-prepared and exonuclease-digested DNA can be sent for high-throughput sequencing. The ChIP-exo method allows for near base-pair mapping resolution with greater detection sensitivity and reduced background signal. An optimized ChIP-exo protocol for mammalian cells and next-generation sequencing is described below.

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Precise determination of protein-binding locations across the genome is important for understanding gene regulation. Here we describe a&#160;genomic mapping method that treats chromatin-immunoprecipitated DNA with exonuclease digestion (ChIP-exo) followed by high-throughput sequencing. This method detects protein-DNA interactions with near base-pair mapping resolution and high signal-to-noise ratio in mammalian neurons.

מיפוי ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עכבר נוירונים באמצעות כרומטין Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...