Name: culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane
Uploaded: 2018-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane at JoVE.com

Bu araştırma retina dejeneratif hastalığı Vakfı mücadele görme engelliler için körlüğü önlemek, New York, www.rpbusa.org ve büyük New York Merkezi araştırma tarafından desteklenmektedir www.blindness.org. Yazarlar Luanna Bartholomew, doktora, bu el yazması onun eleştiri için teşekkür etmek istiyorum.

Aşağıdaki protokol uyum içinde Helsinki Bildirgesi ve Yale Üniversitesi insan araştırma Etik Komitesi kuralları ilkelerinin için gerçekleştirilir.
1. kaynak insan donör gözler
<ol><li>İnsan donör küre Ulusal hastalık araştırma değişim (NDRI, Philadelphia, PA) edinin. Projeye bağlı olarak donör gözleri en az üç çift deneysel her grup için hazırlamak.</li>
	<li>Donör gözleri 10 h içinde ve gemi 48 h post mortemiçinde enucleate. Sonra steril Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) kültür orta buz üzerinde laboratuvarda gözlere taşıma. Daha önce bildirilen çalışmalar donör gözleri ve hasat Bruch'ın membran25,26,29faaliyetlerinin ve biyolojik özellikleri bu moda koru taşınan göstermiştir.</li>
</ol>2. hasat insan Bruch'ın membran Explants
<ol><li>100 mm kültür çanak ve bir kesi ile sklera 3 mm arka limbus için yapmak için kullanmak iyi bıçak makas karbon dioksit bağımsız DMEM medya ve çepeçevre her iki yönde uzanan bir 1.5 x 1.5 inç gazlı bez her göz batırılmış bir yer.</li>
	<li>Yapmak bir tam-kalınlık sirkumferansiyel kesi (camsı için delici) 1 mm arka ora serrataiçin. Kaldırmak ve anterior segment (kornea, lens ve Iris), Vitre ve retina atın.</li>
	<li>İyi Cerrahi makas sklera ve koroid arasında dört Radyal kesi yapmak ve o zaman soyma sklera optik sinir, çevre uzak koroid/Bruch'ın membran karmaşık yırtılma önlemek için karşılamaya çalışırken.</li>
	<li>Ardından, çevresel bir kesi ora serrata boyunca suprachoroidal uzayda yapmak ve RPE Bruch'ın membran-koroid karmaşık özafagusu sklera üzerinden soyma.</li>
	<li>Yerel RPE hücrelerinin explant ile 0,02 M amonyum hidroksit Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) 60 x 15 mm polistren Petri kabına DPBS (şekil 1) üç - kez yıkayarak takip oda sıcaklığında 20 dakika içinde banyo tarafından kaldırın.</li>
	<li>Bruch'ın membran karmaşık explant karbondioksit içermeyen medyada membran bakan her explant Bazal lamina tabakası ile 0.2 µm gözenekli bir unlaminated, hidrofobik 65 µm kalınlığında politetrafloroetilen membran üzerinde süzülüyor.</li>
	<li>Bruch'ın membran explant ile politetrafloroetilen membran fritted cam desteğinde bir cam microanalysis vakum filtre tutucu sistemi yerleştirin.</li>
	<li>Bruch'ın membran Bazal laminin yan dokunmamaya dikkat çekici Teflon ile kaplı ince Forseps ile choroidal tarafındaki kıvrılmış kenarlar düzleştirin.</li>
	<li>Özel (DPBS %4) 15 mL ısı ve sonra 37 ° C'ye serin Sonra explant düz kalmasını güvence altına almak için nazik emiş uygulanırken Bruch'ın membran-koroid karmaşık choroidal taraftan üzerine liquidized jeli 15 mL dökün. 2-3 dk özel kuvvetlendirmek ve uzak politetrafloroetilen membran soyma için 4 ° C'de doku tutun.</li>
	<li>Bruch'ın membran explant (çapı, katılaşmış özel jel içinde 1,5 inç) Bruch'ın membran düzeltmek için çanak altındaki sıcak sıvı özel ile kaplı bir 60 x 15 mm polistren hücre kültür yemek (ile Bruch'ın membran yukarı dönük olacak şekilde) yerleştirin Kuyunun dibinde yukarı dönük olacak şekilde explant Bazal laminin tabaka ile explant.</li>
	<li>Özel Bruch'ın membran explants kültür tabak içinde stabilize etmek için oda sıcaklığında 2-3 dakika içinde kuvvetlendirmek. Bruch'ın membran kültüründe explants kapak DPBS ile yemek ve yemek ileride kullanmak üzere 4 ° C'de depolayın. Şekil 2A izole Bruch'ın membran bir 60 x 15 mm kültür tabak içinde explants gösterir.</li>
	<li>İstenen kültür sistemi içinde 96-şey plaka ise, Bruch'ın membran explant (çapı, katılaşmış özel jel ile 1,5 inç) laminin tarafı ile düz bir Teflon sayfada yukarı yerleştirin.</li>
	<li>Beş ya da altı, kesilmiş bir trephine kullanarak 6 mm-daire düğme Bruch'ın membran karmaşık gelen explant ve her % 4 özel üzerinde sigara tedavi polistiren de bir 96-şey plaka, 37 ° C'de yerleştirin. Özel Bruch'ın membran explants (düğme) her kuyunun düzeltmek için oda sıcaklığında 2-3 dakika içinde kuvvetlendirmek. Not: Şekil 2B trephined Bruch'ın membran düğmeleri bir 96-şey plaka gösterir. Genellikle, 9-11 düğmeleri veya explants her gözünden hasat edilebilir.</li>
</ol>3. insan Bruch'ın membran üzerinde retina Pigment epitel (RPE) hücre kültürü çalışmalarının Explants
<ol><li>Donör gözleri aldıktan sonra DPBS ile Gözdışı doku temiz. Çevresel bir kesi Iris sklera aşağıda 5 mm nokta (pars plana) subretinal boşluğa dokunmatik olun. Anterior segment, Vitre mizah ve retina atmak.</li>
	<li>Bruch'ın membran ve soğuk DPBS ile RPE levha içerir kadeh yıkayın. 5 mL % 0.25 tripsin artık her göz örnek için 10 dk daha için de RPE hücrelerle ayırmak. 50 mL tüp içinde 37 ° C'de ısındı % 15 fetal sığır serum (FBS) ile DMEM tam orta tripsin tepki 25 mL ile gidermek.</li>
	<li>200 × g 24 ° C'de 10 dakika için hücreleri santrifüj kapasitesi ve Pelet 5 mL DMEM tam orta resuspend (% 15 ile FBS).</li>
	<li>Hücreleri saymak ve antibiyotik içeren her çeşitli yaşlı Bruch'ın membran explants (düğme) 200 µL serum-Alerjik minimum temel medya (MEM) bir 96-şey plaka Bazal lamina üzerine 15.000 RPE hücrelerin tohum (100 IU/mL penisilin G, 100 mg / mL streptomisin, 5 mg/mL gentamisin ve 2,5 mg/mL Amfoterisin B). Bu yoğunluk kaplama 20 µm hücre çapını varsayarak RPE hücrelerinin kaplama alanı yaklaşık % 15'i karşılamak izin verir.</li>
	<li>Hücreleri sayede hücre yoğunluğu sonra stepwise kadar % 100 izdiham bağlı olarak her parametre etkisi hücre davranış için arttırılabilir düğmesi üzerine plaka.</li>
	<li>Hücreleri 37 ° C'de % 95'i air/5% CO2 oksijen bir ortamda 24 h için explant takmak izin Yavaşça orta sıcak tam DMEM ile değiştirin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Murdaugh, L. S., Wang, Z., Del Priore, L. V., Dillon, J., Gaillard, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+accumulation+of+3-nitrotyrosine+and+nitro-A2E+in+human+Bruch's+membrane.">Age-related accumulation of 3-nitrotyrosine and nitro-A2E in human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 90 (5), 564-571 (2010).</li><li>Wiradjaja, F., DiTommaso, T., Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membranes+in+development+and+disease.">Basement membranes in development and disease.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (1), 8-31 (2010).</li><li>Nystrom, A., Bornert, O., Kuhl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+basement+membrane-linked+diseases.">Cell therapy for basement membrane-linked diseases.</a> Matrix Biol. , (2016).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Marshall, G. E., Konstas, A. G., Reid, G. G., Edwards, J. G., Lee, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+collagen+and+laminin+in+Bruch's+membrane+and+basal+linear+deposit+in+the+human+macula.">Type IV collagen and laminin in Bruch's membrane and basal linear deposit in the human macula.</a> Brit. J. Ophthalmol. 76 (10), 607-614 (1992).</li><li>Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+drusen+formation+in+the+normal+and+aging+eye+and+their+relation+to+age+related+maculopathy:+a+clinicopathological+study.">Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study.</a> Brit. J. Ophthalmol. 83 (3), 358-368 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (Suppl 1), S10-S32 (1999).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Mullins, R. F., Aptsiauri, N., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+composition+of+drusen+associated+with+glomerulonephritis:+implications+for+the+role+of+complement+activation+in+drusen+biogenesis.">Structure and composition of drusen associated with glomerulonephritis: implications for the role of complement activation in drusen biogenesis.</a> Eye. 15 (Pt 3), 390-395 (2001).</li><li>Caldwell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+alterations+precede+vascularization+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+dystrophic+rats.">Extracellular matrix alterations precede vascularization of the retinal pigment epithelium in dystrophic rats.</a> Curr. Eye Res. 8 (9), 907-921 (1989).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv Ophthalmol. 44, S10-S32 (1999).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Ho, T. C., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+of+cultured+human+retinal+pigment+epithelium+to+extracellular+matrix+and+human+Bruch's+membrane.">Reattachment of cultured human retinal pigment epithelium to extracellular matrix and human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 38 (6), 1110-1118 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+to+a+substrate+prevents+apoptosis+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 235 (1), 41-47 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF+beta+secretion+modulates+the+density-dependent+growth+of+pig+retinal+pigment+epithelium+in+vitro.">TGF beta secretion modulates the density-dependent growth of pig retinal pigment epithelium in vitro.</a> Ophthalmic Res. 31 (3), 192-202 (1999).</li><li>Gullapalli, V. K., Sugino, I. K., Van Patten, Y., Shah, S., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+RPE+survival+on+aged+submacular+human+Bruch's+membrane.">Impaired RPE survival on aged submacular human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 80 (2), 235-248 (2005).</li><li>Wang, H., Yagi, F., Cheewatrakoolpong, N., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+study+of+retinal+pigment+epithelium+sheet+transplants+onto+Bruch's+membrane.">Short-term study of retinal pigment epithelium sheet transplants onto Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 78 (1), 53-65 (2004).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+of+different+layers+of+host+human+Bruch's+membrane+by+retinal+pigment+epithelial+cell+grafts.">Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (3), 767-774 (1999).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+of+aged+Bruch's+membrane+to+enhance+retinal+pigment+epithelium+repopulation.">Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 45 (9), 3337-3348 (2004).</li><li>Castellarin, A. A., Sugino, I. K., Vargas, J. A., Parolini, B., Lui, G. M., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transplantation+of+fetal+human+retinal+pigment+epithelial+cells+onto+human+cadaver+Bruch's+membrane.">In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 66 (1), 49-67 (1998).</li><li>Nguyen, H. V., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+iPSC-derived+RPE+for+modeling+of+retinal+diseases.">Patient-specific iPSC-derived RPE for modeling of retinal diseases.</a> J. Clin. Med. 4 (4), 567-578 (2015).</li><li>Fletcher, E. L., Jobling, A. I., Greferath, U., Mills, S. A., Waugh, M., Ho, T., De Longh, R. U., Phipps, J. A., Vessey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models.">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry Vision Sci. 91 (8), 878-886 (2014).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+human+retinal+pigment+epithelial+cells+seeded+onto+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (2), 467-476 (1999).</li><li>Cai, H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch+membrane+aging+alters+the+gene+expression+profile+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Bruch membrane aging alters the gene expression profile of human retinal pigment epithelium.</a> Curr. Eye Res. 31 (2), 181-189 (2006).</li><li>Moreira, E. F., Cai, H., Tezel, T. H., Fields, M. A., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+human+Bruch's+membrane+increases+rod+outer+segment+phagocytosis+by+human+retinal+pigment+epithelium.">Reengineering human Bruch's membrane increases rod outer segment phagocytosis by human retinal pigment epithelium.</a> Transl. Vis. Sci. Technol. 4 (5), 10 (2015).</li><li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch's+membrane+aging+decreases+phagocytosis+of+outer+segments+by+retinal+pigment+epithelium.">Bruch's membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium.</a> Mol. Vis. 13, 2310-2319 (2007).</li></ol>

Yazarlar hiçbiri bildirmek için herhangi bir ticari açıklamalar var.

Yaşlı insan Bruch'ın membran (hücre dışı matriks) AMD hastalık ilerleme katkıda bulunur ve böylece bu değiştirilmiş matris RPE hücre disfonksiyonu için nasıl katkıda bulunduğunu anlamak için gerek yoktur. Yaşa bağlı değişimler AMD eğitim için yeterli hayvan modellerin eksikliği göz önüne alındığında, hastalığın etkileri taklit ex vivo model sistemleri patofizyolojisi anlamak için değerli bir araç olarak hizmet verebilir. Bu el yazması açıklanan metodoloji tutarlı bir şekilde Bruch'ın membran explants ve kültür RPE hücrelerinin, birincil, ölümsüzleştirdi veya kök hücre kaynaklı RPE hücre hatları dahil olmak üzere insan yalıtmak için kullanılabilir.
Daha önce de belirtildiği gibi insan Bruch'ın membran explants NDRI kaynaklı. Bir iletişim kuralı kabul edilebilir donör gözler için ayarlanan ölçütleri belirten NDRI ile kuruldu. Örneğin, bağış yok bilinen retina göz hastalıkları olması gerekir, gözleri/küre içinde 10 h ölümünden sonra alınır ve küre 48 saat içinde laboratuvarda ölümünden sonra (yolu ile paket teslimâtı buzda) geliyor. Uygun yaş aralığı ve gözleri bir çalışma, örneğinistatistiksel analiz için gerekli sayısını belirtin., Küre bağış bağış yaşları 50-89 arasında beş dünya çift 20-49 yaşları arasındaki beş çift.
Genellikle on çifti küre kullanılabilir her ay ortalama göz küre kullanılabilirliği değişir. Göz paket temel, de-tanımlanan donör bilgi ile geldi: yaş, ırk, ölüm, ölüm nedeni, zamanı ve tıp tarihi (hastalık listesini ya da comorbidities) kısa.
En önemlisi, insan Bruch'ın membran explants hasat göz ve camsı RPE Bruch'ın membran-koroid kompleks izolasyon için sağlar, anterior segment kaldırılmasını gerektirir. Bruch'ın membran izole olduğunda, RPE hücrelerinin farklı konsantrasyonlarda acellular explants üzerine tohumlari ve aşağı akım deneyler için kültürlü. Hazırlık ve yordamsal işleme burada açıklandığı gibi kritik, laminal yüzeyi bakan-up sırasında değil müessir yüzeyin mekanik zarar görmesini önlemek için emin olmak için izole Bruch'ın membran yönünü dikkat hücre dışı matriks yüzey yapısı.
Bu da Bruch'ın membran explant sistemleri kullanırken, orada bireysel donör genomik arka plan gibi aşağı akım deneylerin sonuçlarını, yaş Bruch'ın membran veya Bruch'ın öldükten sonra zaman etkileyebilecek bazı değişkenler belirtilmelidir membran ve konumunu Bruch'ın membran, i.e., merkezi veya periferik Bruch'ın membran explants bir parçası. Herhangi bir diğer insan dokusu çalışma ile gibi gerekli istatistiksel gücü var ve donör göz yaşı uygunsa eşleştirmek için uygun donör göz örnek numarası işe gerekir. Göz bankaları gözlerinden kabul etmek için sıkı kriterleri kurulması önemli bir parametredir. Sadece gözleri bu az 10 h öldükten sonra enucleated ve hangi Bruch'ın membran hazırlık içinde 24-48 h ölümünden sonra hasat edilebilir kabul. Optik sinir site yönlendirmesi için bir işaretleyici olarak kullanılabilir ve aynı yerlerde kullanmak deneysel ve çalışma grupları denetlemek. Bu önlemler alarak, bir deneysel değişkenlik en aza indirebilirsiniz.
Özetle, RPE Bruch'ın membran-koroid karmaşık ve nasıl yaş ve hastalık etkilenen anlayışı patofizyolojisi katkısı AMD anlamak için önemlidir. Ex vivo teknikler istihdam modeli sistemleri insan dokusu kullanarak bu efektleri araştırmak için değerli bir araç vardır. Burada, biz insan donör explants yaşında Bruch'ın membran ilgili ex vivo modeli olarak istihdam bir metodoloji tanımlamak. Bu teknik bir nasıl matris içinde yapısal değişiklikleri araştırmak için bir araştırma aracı RPE overlaying etkileyebilir gibi yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran kullanmak izin verir ifade25 eki, yayılması ve gene de dahil olmak üzere hücre davranış , 27. başarılı benzer ex vivo modeli sistemlerinin geliştirilmesi AMD anlayışımız daha fazla ve yeni tedavi olanakları gelişimi kolaylaştırmak.

Yaşa bağlı nitrosative ve oksidatif stres de dahil olmak üzere birçok faktör tarafından neden olduğu insan Bruch'ın membran yapısal değişikliklere giderek artan retina pigment epitel (RPE) hücreleri ve katkıda işlevi birden çok zararlı etkileri Patoloji yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Hücre replasman tedavisi için gelişmiş atrofik AMD ya da coğrafi Atrofi dikkate alınarak, tedavi büyük olasılıkla RPE hücre Atrofi bir yatak üzerine hücrelerinin nakli gerektirir. Yaşa bağlı değişiklikler insan Bruch'ın membran içinde hasar için hücre dışı matriks6,9,10,11 verilen transplante RPE hücre Greftler başarısını olumsuz yönde etkilenebilir , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Bruch'ın membran Biyoloji ve nasıl matris içinde yapısal değişiklikler katkıda bulunmak için AMD ilerleme araştırılması insan hastalık patoloji anlamak için çok önemli. Böylece, ex vivo yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran hasat tarif protokolleri geliştirmek için yaşa bağlı göz alanındaki araştırmacılar için kritik bir ihtiyaç vardır.
Tarihsel olarak, bu modeli yaşa bağlı bozukluklar coğrafi atrofi ve hayvanlar23yaşında bir insan Bruch'ın membran gibi zor oldu. Bu zorluk birden fazla etkene kemirgenler ve modelleme hastalığı yanı sıra çoğu omurgalılar24yılında makula eksikliği için sık kullanılan diğer türler ile karşılaştırıldığında insanlar uzun ömürlü kaynaklanmaktadır. Burada açıklanan yöntemin avantajı hücreleri doğrudan yaşlı ve/veya hastalıklı bireylerin post mortem gözlerinden çıkarılan Bruch'ın membran üzerinde test edilebilir olduğunu. Bu makalede genel amacı yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran bir ex vivo modeli için detaylı bir metodoloji sağlamak için dahil olmak üzere insan Bruch'ın yalıtım membran insan bağış explants ve RPE tohum için hücreleri aşağı akım deneyler. Bu model hücre dışı matriks hasar RPE hücre işlevi ve patoloji20,25,26,27,28katkısını araştırmak için uygun bir model olarak hizmet verebilir.

<table><tbody><tr><td>Human donor globes</td><td>National Disease Research Interchange, NDRI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Carbon-dioxide independent media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>60-mm polystyrene petri dish</td><td>Corning Inc.</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline, PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic 65 &amp;micro;m-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 &amp;micro;m pores</td><td>Merck Millipore</td><td>JGWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-753-102</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576-5G</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;times; 10mm culture dish</td><td>VWR International</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Trephine</td><td>Accutome</td><td>AM0570 60</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Corning Inc.</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential media (MEM)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11095-080&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1336-21-6&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane

Vitaminler ve antioksidanlar Age-Related göz hastalığı çalışma tarafından önerilen bir yana, olguların % 90'ı temsil eden "kuru" veya atrofik yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) için hiçbir etkili tedavi vardır. Tedaviler yavaş veya coğrafi Atrofi (GA) gelişimi geri zekalı için gereklidir ve Bruch'ın membran patoloji anlama bu sürecin parçasıdır. İnsan Bruch'ın zarda değişiklik AMD ilerlemesini retina pigment epitel (RPE) damage hücre katkıda bulunarak koyun. AMD eğitim için yeterli hayvan modellerin eksikliği göz önüne alındığında, yaşlı insan Bruch'ın membran ex vivo modelleri gibi davranış RPE hücrelerinin çalışma için yararlı bir araç ölümsüzleştirdi ve birincil hücre hatları gibi RPE satırları İndüklenmiş pluripotent kök elde edilen hizmet hücreler (iPSCs). Burada, bir hasat insan Bruch'ın membran explants eki, Apoptozis ve yaygın, photoreceptor dış işbirliği yeteneği de dahil olmak üzere insan bağışçılardan numaralı seribaşı RPE hücre davranış etkilerini belirlemek izin verir ayrıntılı bir yöntem mevcut kesimi, polarizasyon ve gen ekspresyonu kurulması. Bu tahlil ex vivo modeli ne zaman yaşlı/tehlikeye hücre dışı matriks seribaşı RPE hücrelerinin fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için yaşlı Bruch'ın membran sağlar.

Bu iletişim kuralı düzgün gerçekleştirildiğinde, kimse RPE hücre işlevi yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran etkilerini polarite ve dış kan retina bariyerini kurulması, büyüme faktörleri ve sitokinler polarize salgılanmasını tarafından belirleyebilirsiniz, ve fagositoz photoreceptor çubuk dış segmentleri.
Biz-si olmak oluşturmak bir hastalık fenotip yaşlı insan Bruch'ın membran üzerinde göstermek veri. Örneğin, üzerinde RPE hücrelerinin kültür insan Bruch'ın membran explants azalır RPE hücre yatıştırıldı (şekil 3) yaşlı. Yaşlı insan Bruch'ın membran üzerinde kültürlü RPE hücrelerinin çubuk dış segmentleri (ROS), işbirliği için kapasitesini bu hücreler bir kritik RPE işlev (şekil 4) azaltır. Ayrıca, apoptotik hücre tespit ve terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick son etiketleme (tünel) leke önceki iş26açıklandığı gibi kullanarak bu düğme explants karşılaştırıldığında. RPE hücre gen ifade profil bir yaşında ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran etkilerini Mikroarray teknolojisi kullanılarak belirlenebilir. RPE hücre gen ekspresyonu insan Bruch'ın membran explants için genç bireyler (şekil 5)27karşılaştırıldığında büyük kişilerden kültürlü zaman değiştirilmez göstermiştir. İstatistiksel analiz için explants en az 3-5 insan bağışçılardan grubu başına kullanılır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2.jpg"> Şekil 1. Donör gözlerinden insan Bruch'ın membran izolasyon şematik gösterim. İnsan Bruch'ın membranlar sklera, anterior segment, retina, Vitre kaldırarak hasat ve yerel retina pigment epitel (RPE) hücreleri. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig2.jpg"> Şekil 2. İnsan Bruch'ın membran (BM) bir kültür tabak içinde izole. (A) insan Bruch'ın membran explants (çapı, katılaşmış özel jel ile her 1,5 inç) şematik bir 60 × çanak altındaki sıcak sıvı özel dolu 15 mm polistren hücre kültür çanak (BM yukarı doğru) yerleştirilir. (B) bu birkaç 6 mm dairesel düğme (explants), trephined bir insan Bruch'ın membran explant her ow sonra yerleştirdiği bir sigara tedavi polistiren de bir 96-şey plaka, 37 ° C'de % 4 özel tarih. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig3.jpg"> Şekil 3. Retina pigment epitel (RPE) hücre genç ve yaşlı insan Bruch'ın membran (BM) oranına yatıştırıldı. Bruch'ın membran explants--dan genç insan üzerine numaralı seribaşı birincil RPE hücrelerinin (< 50 yaşında, n = 3) veya büyük (> 70 yaşındaki, n = 5) donör gözler üç hafta için. Hücre eki hızı MTT hücre canlılığı tahlil tarafından ölçüldü. Büyük insan Bruch'ın membranlar %24 RPE hücre eki oranı azaldı (8,54 + / genç BM 100 S.E. büyük BM 76.65 1,44 +/-vs S.E.). p < 0,05, S.E. standart hata =.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig4.jpg"> Şekil 4. Retina pigment epitel (RPE) hücre fagositoz insan Bruch'ın membran (BM) yaşa göre etkilenir. Bruch'ın membran explants büyük insan kültürlü birincil RPE hücrelerinin çubuk dış segmentleri (ROS) işbirliği için azaltılmış bir yetenek vardı (9,3 +/-genç BM 873 S.E., n = 5 eski BM 608 25,4 +/-vs S.E., n = 5). p < 0,01, S.E. standart hata =.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig5.jpg"> Şekil 5. Sayısı retina pigment epitel (RPE) hücre genler üzerinde genç kültürlü her örnek olarak ifade veya büyük insan Bruch'ın membran explants. Birincil RPE hücrelerinin üzerine numaralı seribaşı olarak ifade genlerin sayısının daha fazla dağılım oldu genç insan Bruch'ın membran karşı büyük (6201 ± 388 6439 ± 80, vs sırasıyla); Beş explants her yaş grubu için test edildi. Cai, tüm yazarların tam izni ile sunulan H ve ark. 27. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane at JoVE.com

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Bu iletişim kuralı, yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran retina pigment epitel (RPE) hücre kültürü çalışmalarının göstermek için hedeftir. Bu yöntem RPE hücre davranış güvenliği aşılan bir hücre dışı matriks üzerinde çalışmaya uygundur.

Bir Ex Vivo modeli yaşlı insan Bruch'ın membran bir retina Pigment epitel hücrelerinin kültürü

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

culturing-retinal-pigment-epithelial-cells-on-an-ex-vivo-model-aged

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

10.1K Görüntüleme.  Yale School of Medicine. Bu iletişim kuralı, yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran retina pigment epitel (RPE) hücre kültürü çalışmalarının göstermek için hedeftir. Bu yöntem RPE hücre davranış güvenliği aşılan bir hücre dışı matriks üzerinde çalışmaya uygundur.

Video: Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Nörobilim

Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of the center&#160;of the retina, called the macula, resulting in the loss of central vision. Early AMD is characterised by the presence of small, yellowish lesions called soft drusen that can progress onto late AMD such as geographic atrophy (dry AMD) or neovascularisation (wet AMD). Although the clinical changes are well described, and the understanding of genetic influences on conferring AMD risk are getting ever more detailed, one area lacking major progress is an understanding of the biochemical consequences of genetic risk. This is partly due to difficulties in understanding the biochemistry of Bruch&#8217;s membrane, a very thin extracellular matrix that acts as a biological filter of material from the blood supply and a scaffold on which the retinal pigment epithelial (RPE) cell monolayer resides. Drusen form within Bruch&#8217;s membrane and their presence disrupts nutrient flow to the RPE cells. Only by investigating the protein composition of Bruch&#8217;s membrane, and indeed how other proteins interact with it, can researchers hope to unravel the biochemical mechanisms underpinning drusen formation, development of AMD and subsequent vision loss. This paper details methodologies for enriching either whole Bruch&#8217;s membrane, or just from the macula region, so that it can be used for downstream biochemical analysis, and provide examples of how this is already changing the understanding of Bruch&#8217;s membrane biochemistry.

Identifying proteins specifically associated with Bruch&#8217;s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

İnsan Donör Gözler gelen Bruch Membran zenginleştirilmesi

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

Sağlam Retina Pigment Epitel ile Organotipik Fare Retina Eksplantlarının Uzun Süreli, Serumsuz Ekimi

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

Yeni bir İnsan Organotipik Retina Kültürü Tekniğinin Karakterizasyonu

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Tıp

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Dejeneratif Retina Hastalıkları için İnsan Dışı Primat Modelinde Retina Pigment Epitel Transplantasyonu

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Kültürlenmiş Primer Murin RPE'nin Karakterizasyonu ve Morfolojik Dinamiği

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

Yazar Spotlight: Retinopati Araştırmaları için Yetişkin Farelerden Primer Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli İzolasyonu

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

Fare retina Pigment epiteli birincil hücre kültürleri

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Biyoloji

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a multifactorial disease influenced by environmental and genetic factors, which lead to functional impairment of the retina due to retinal pigment epithelial (RPE) cell degeneration followed by photoreceptor degradation. An ideal treatment would include the transplantation of healthy RPE cells secreting neuroprotective factors to prevent RPE cell death and photoreceptor degeneration. Due to the functional and genetic similarities and the possibility of a less invasive biopsy, the transplantation of iris pigment epithelial (IPE) cells was proposed as a substitute for the degenerated RPE. Secretion of neuroprotective factors by a low number of subretinally-transplanted cells can be achieved by Sleeping Beauty (SB100X) transposon-mediated transfection with genes coding for the pigment epithelium-derived factor (PEDF) and/or the granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). We established the isolation, culture, and SB100X-mediated transfection of RPE and IPE cells from various species including rodents, pigs, and cattle. Globes are explanted and the cornea and lens are removed to access the iris and the retina. Using a custom-made spatula, IPE cells are removed from the isolated iris. To harvest RPE cells, a trypsin incubation may be required, depending on the species. Then, using RPE-customized spatula, cells are suspended in medium. After seeding, cells are monitored twice per week and, after reaching confluence, transfected by electroporation. Gene integration, expression, protein secretion, and function were confirmed by qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence, and functional assays. Depending on the species, 30,000-5 million (RPE) and 10,000-1.5 million (IPE) cells can be isolated per eye. Genetically modified cells show significant PEDF/GM-CSF overexpression with the capacity to reduce oxidative stress and offers a flexible system for ex vivo&#160;analyses and in vivo studies transferable to humans to develop ocular gene therapy approaches.

Here, a protocol to isolate and transfect primary iris and retinal pigment epithelial cells from various mammals (mice, rat, rabbit, pig, and bovine) is presented. The method is ideally suited to study ocular gene therapy approaches in various set-ups for ex vivo&#160;analyses and&#160;in vivo studies transferable to humans.

Viral Olmayan Gen Tedavisi için Memeli Primer Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu, Kültürü ve Genetik Mühendisliği

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Bir Ex Vivo modeli yaşlı insan Bruch'ın membran bir retina Pigment epitel hücrelerinin kültürü

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller

İnsan Donör Gözler gelen Bruch Membran zenginleştirilmesi

Sağlam Retina Pigment Epitel ile Organotipik Fare Retina Eksplantlarının Uzun Süreli, Serumsuz Ekimi

Yeni bir İnsan Organotipik Retina Kültürü Tekniğinin Karakterizasyonu

Dejeneratif Retina Hastalıkları için İnsan Dışı Primat Modelinde Retina Pigment Epitel Transplantasyonu

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Fare retina Pigment epiteli birincil hücre kültürleri

Viral Olmayan Gen Tedavisi için Memeli Primer Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu, Kültürü ve Genetik Mühendisliği