Bu araştırma çalışması Avrupa Birliği'nden mali destek aldı (transMed; H2020-MSCA-765441), Alman araştırma konseyi (DFG; PA1751/8-1, 10-1) ve Çin burs konseyi.

Alman hayvanları koruma yasasının §4'üne uygun hayvan protokolleri Tübingen Üniversitesi hayvanları koruma komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı (Einrichtung für Tierschutz, Tierärztlichen Dienst und Labortierkunde; Kayıt No AK02/19M). Bu çalışmada, retinalar vahşi tip (WT) ve rd1 farelerden elde edildi, ikincisi kalıtsal retina dejenerasyonu için iyi karakterize edilmiş birmodeldir 15. Fareler standart beyaz döngüsel aydınlatma altında barındırıldı, yiyecek ve suya ücretsiz erişime sahipti ve cinsiyetten bağımsız olarak kullanıldı.
1. Kontrol listesi
<ol><li>Steril koşulları sağlamak ve kirlenmeleri önlemek için laminer hava akış davlumbazını % 70 etanol ile temizleyin ve dezenfekte edin. Retina kültürlerinin zehirlenmesini önlemek için etanol'ün tamamen buharlaşmasına izin verdiğinden emin olun.</li>
	<li>Kullanmadan önce otoklav aletleri (örneğin makas, hardal ve oftalmik mikroskop kazıma kaşığı).</li>
	<li>Aşağıdaki ortamı steril koşullar altında laminer akışlı bir davlumbaz altında önceden hazırlayın: Bazal R16 ortamı (BM) (4 hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir), %20 fetal baldır serumu (FCS) ile BM (aynı gün kullanım), 0,0 ile BM % 12 proteinaz K (44 mAnson U/mg) çözeltisi (aynı gün kullanımı) ve Romijn 16 tarafından açıklandığı gibi takviyeli (CM) kompleR16 ortamı (3 hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir) (bkz. Tablolar S1, S2 ve S3).</li>
	<li>Proteinaz K çözeltisini etkinleştirmek için 37 °C'de önceden ısıtın ve 2.5.</li>
</ol>2. Hazırlık
<ol><li>Doğum sonrası gün (P) 5'te rd1/WT hayvanlarını kafa kesme ile kurban edin. P11'den büyük hayvanlar için, yerel hayvan koruma yönetmeliklerine göre CO2 ve/veya servikal çıkık kullanın.</li>
	<li>Hayvanın yaşına bağlı olarak, enükleasyondan önce, gerekirse, göz kapaklarını uzun uçlar kullanarak açın ve aşağıdaki göze dokunmadan veya kaşımadan göz kapaklarını çok dikkatli bir şekilde ayırın.</li>
	<li>Kavisli asalar kullanarak stereoskop altında gözleri hızla enüklee edin.</li>
	<li>Gözleri BM'de oda sıcaklığında (RT) 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Gözleri önceden ısıtılmış BM'de 15 dakika boyunca 37 °C'de% 0.12 proteinaz K ile kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Steril koşulları sağlamak için laminer hava akış başlığı içinde aşağıdaki adımları uygulayın. Proteinaz K'yi inaktive etmek için gözleri% 20 FCS içeren BM'ye aktarın ve RT'de 5 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Rt'de taze BM içeren bir Petri kabında gözleri bir stereoskop altında, aseptik olarak parçalara ayırma. Bu süre ne kadar uzun olursa, retinayı parçalamak o kadar zorlaşır, gözler çok yumuşak hale gelir.<ol>
<li>Asalarla, gözü optik sinirden tutun. İnce makas kullanarak korneada küçük bir kesi yaparak kornea, koroid ve skleranın 2 çift ince tokmakla hafifçe soyulabileceği yerden 2 kenar oluşturun(Şekil 1 adım A–C). Alternatif olarak, korneaya ilk kesiyi yapmak için dar bir kanonül kullanın ve ardından makas bıçaklarından birini açıklığa yerleştirin.</li>
		<li>Lensi ince kanatlarla kavrayın. İlk atalara dik olarak ikinci bir çift tokmak yerleştirin, böylece ilk toslar ikincisinin 2 sapı arasındadır. Lensi göz kabından çıkarmak için çekin. Vitreus ve siliary vücut hala retinaya bağlıysa, dikkatlice çıkarın(Şekil 1 adım D). NOT: Adım 2.7.1 ve 2.7.2 pratik gerekir ve retinaya zarar vermemek için dikkatli olun.</li>
		<li>Retinayı kenarlarına dik olarak dört noktada kesin ve dört yapraklı yonca şekli oluşturun(Şekil 1 adım E-F).</li>
		<li>1 mL ucun geniş kesim tabanına sahip bir pipet kullanarak, retinayı asılı bir orta damlada tutun ve 6 kuyulu bir kültür plakasına yerleştirilmiş bir kültür yemeği filtresine aktarın. RPE tabakası zara bakmalıdır(Şekil 1 adım G).</li>
		<li>Bir pipet kullanarak, fazla ortamı kesici uçtan dikkatlice çıkarın.</li>
		<li>Kuyunun yanlarından, kuyu başına 1 mL CM ekleyin ve% 5 CO2ile 37 ° C'de steril bir inkübatörde kuluçkaya yatırın. Retinayı ortama batırmayın, çünkü bu oksijenlenmeyi azaltır ve doku dejenerasyonuna neden olur. Explant, sadece suyun yüzey gerilimi tarafından oluşturulan ince bir sıvı filmi ile kaplanmış sıvı ve hava arasındaki arayüzde kalmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eksplantasyon işleminden sonra iyileşmeyi kolaylaştırmak için retinayı ilk 48 saat boyunca bozulmadan bırakın.</li>
	<li>Ortamı her iki günde bir değiştirin (48 saat). Her kuyudan 700 μL orta atın ve kuyuya 900 μL taze CM ekleyin. Bu sayede buharlaşma ile kaybedilen ortam miktarı geri kazanılır ve retina eksplantı önceki 48 saat içinde üretilen nöroprotektif faktörlerin bir kısmını tutar.</li>
	<li>Olası kontaminasyonu (yani ortamın renginin değişmesini) kontrol etmek ve değerlendirmek için çıkarılan ortamı kültürlerle birlikte ayrı ve kapalı bir mikrosantrifüj tüpünde kuluçkaya yatırın. NOT: Retina eksplantları kültürde en az 2 hafta tutulabilir12.</li>
</ol>3. Kültlemeden sonra
NOT: Explants farklı deneysel uygulamalar (batı lekesi, histoloji, tüm binekler, genetik analiz, elektrofizyoloji) için kullanılabilir. Uygulamaya bağlı olarak, organotipik retina eksplantları dondurulabilir, yutabilir veya kriyoseksiyon için hazırlanabilir. Aşağıdaki adımlar histolojik hazırlığı açıklar.
<ol><li>%4 paraformaldehit (PFA) ile 45 dakikalık bir fiksasyon gerçekleştirin, ardından kademeli sakkaroz kriyoproteksiyon (10 dakika için%10 sakkaroz, 20 dakika için %20 ve oda sıcaklığında (RT) 2 saat veya 4 °C'de geceleme (AÇIK) için %30). Bu arabellekleri doğrudan kuyuya ekleyin.</li>
	<li>Retina eksplantlarının etrafındaki zarı kesin.</li>
	<li>Donmuş doku için hem zarı hem de retina dokusunu ortama gömün.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig01.jpg"> Şekil 1: Organotipik retina eksplant kültürlerinin hazırlanması için adım adım prosedür. (A) Fare gözleri, sklera ve koroidlerin retina ve RPE'den ayrılmasını sağlamak için enükle edilir ve proteinaz K çözeltisine aktarılır. Sklera/koroid tabakasında küçük bir kesik sunulmuştur. (B) Sklera/koroid tabakasını soymak için iki adet tokmak kullanılır. (C) Siyah koroid tabakası peeling sırasında görülebilir. Altı çizili koyu retina pigment epitel (RPE) göz küresine bağlı kalır. Sklera ve koloid optik sinir ile birlikte çıkarılır. (D) Lens ve vitreus, emişlerle çıkarılır.  Kalan siliary vücut çıkarılır. (E) Retina kase benzeri bir şekil korur. (F) Bir tabakta kültleme için retinayı düzleştirmek için, retinanın etrafında eşit mesafede 4 kesik bir makasla yapılır ve yonca benzeri bir şekil verilir. Retina kültürü, kesilmiş 1 mL pipet ucu kullanılarak 6 kuyulu bir plakada bir membran kültürü kesici ucuna aktarılır. Retina hala kase şeklinin bir kısmını koruyor. Bununla birlikte, retinayı çevreleyen fazla sıvının çıkarılmasından sonra, düzlemsal bir yapıya açılacaktır. (G) Kültür zarı kurulumunda retina kültürü, tam bir R16 ortamı çözeltisinin üzerine gözenekli bir polikarbonat (PC) membran üzerinde dinlenir. Canlılığı sağlamak için, kültür% 5 CO2ile 37 ° C'de nemlendirilmiş steril bir inkübatörde tutulmalıdır <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank"></a> ve ortam her 48 saat içinde değiştirilmelidir.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Sunulan protokol, tanımlanmış R16 ortamında, serum ve antibiyotik içermeyen, bozulmamış RPE ile fare retinasının organotipik eksplant kültürlerini açıklar. Bu protokol başlangıçta 1980'lerin sonundan başlayarak7,28 ve o zamandan beri sürekli olarakrafineedilmiştir 6,11,12. Önemli uygulamalar kalıtsal retina dejenerasyonu mekanizmalarına yönelik çalışmaları ve retinoprotektif ilaçların tanımlanmasınıiçerir 23,29,30.
Başarılı bir deney için bazı önemli hususların dikkate alınması gerekir. Kültürlerin kalitesini artırmaya yardımcı olacak bazı önemli sorun giderme noktaları aşağıda bulabilirsiniz. İlk olarak, retina kültürleri aşırı katlama ve / veya rozet oluşumu gösterebilir31. Bu, eksplantasyon işlemi sırasında retinaya bir yaban arısı ile dokunmaktan kaynaklanabilir. Ayrıca, siliary vücut, kültür sırasında retina katlamayı artırabileceğinden, eksplanttan tamamen çıkarılmalıdır. İkincisi, retinanın asılı bir damlada kuyu plakasına aktarılması sırasında, retina zarın yanlış tarafına bakılırsa, pipet ucundan sarkan damlada tutun ve retinayı çevirmek için ortamı ucun içine ve dışına (asılı damlayı ayırmadan) çok nazikçe itin. Son olarak, RPE skleraya bağlı kalırsa ve retinadan ayrılırsa, büyük olasılıkla skleranın yetersiz bir prediyajından kaynaklanır. Bu sorun özellikle yaşlı hayvanlardan veya kemirgen olmayan türlerden (örneğin domuzlar) gözlerle çalışırken önemli olabilir ve proteinaz K konsantrasyonu artırılarak çözülebilir.
Organotipik retina eksplant kültürlerinin yürütülmesi, yeterli eğitim ve deneyim gerektiren karmaşık bir prosedürdür. Eğitim eksikliği retina eksplantlarının kalitesinde değişkenliğe yol açabilir. Bu nedenlerden dolayı, canlılık ve tekrarlanabilirliği izlemek ve doğrulamak önemlidir, örneğin TUNEL test ile hücre ölüm oranını karakterize etmek. Antibiyotik içermeyen bir ortamın kullanılması, retina eksplantlarını bakteri ve mantarların kirlenmesine karşı savunmasız hale getirir. Bu riski en aza indirmek için, gerçekten aseptik koşullar altında çalışmaya özellikle özen göstermenizi öneririz. İn vitro retina kültleşmesinin bir diğer sınırlaması, in vivo retina ile karşılaştırıldığında fizyofimik ortamdaki farklılıklardır (örneğin, koroidal ve retinal kan akışı, oksijen ve glikoz seviyeleri, göz içi basıncı, vitreus bileşimi). Sürekli bir perfüzyon sistemi, belki de özel bir biyoreaktör32'ye gömülü bu modeli in vivo durumuna yaklaştırır. Ayrıca, retina diseksiyonu sırasında optik sinirin akstotomisi ganglion hücre ölümüne yol açacaktır, bu da stres yanıtlarına neden olabilir8. Bu nedenle, eksplantın belirli bir manipülasyona veya tedaviye tabi tutulmadan önce en az 2 gün boyunca kültleme koşullarına uyum sağlaması tavsiye edilir.
Açıklanan yöntem genellikle 4 hafta boyunca iyi hayatta kalabilen olgunlaşmamış retina dokuları üzerinde gerçekleştirilir in vitro7,33. Bununla birlikte, prosedür yetişkin retinanın kült haline alınması da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalara göre uyarlanabilir. Yayınlanan farklı yaklaşımlar yetişkin retinasının RPE34,35olmadan izolasyonunu açıklasa da, diseksiyondan önce 37 ° C'de 1 saate kadar papain çözeltisi ile inkübasyon, RPE'nin yetişkin bir fareden türetildiğinde bile retinaya bağlı kalmasını sağlar36.
Serumsuz ortam ve kimyasal olarak tanımlanmış in vitro ortam, deneysel koşulların tamamen tanımlanmış ve tekrarlanabilir bir manipülasyonu sağlar. Bu nedenle, organotipik retina eksplant kültürleri oftalmoloji ve sinirbilim alanında değerli araçlardır ve retina hastalıkları37, retina gelişimi 38 ,39, retina kök hücre tedavisi40,genetik modifikasyonlar41ve farmakolojik tarama için kullanılmıştır. İlaç testlerinin özel bir örneği olarak, burada kalıtsal retina hastalığı için hayvan modellerinde fotoreceptör hücre ölümünü azalttığı bilinen bir cGMP analogu (CN003) test etmek için retina explant kültürlerini kullandık23 (Şekil 3B). Tekniğin bir başka olası uygulaması Şekil 3C'de açıklanmıştır Doku ortamının hassas kontrolünün diyabetik koşulları taklit etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir24. Doku mimarisinin tüm kültleme dönemi boyunca korunması nedeniyle organotipik retina eksplant kültürleri elektrofizyolojik çalışmalar için de uygundur. Retina eksplantları üzerindeki nöronal işlevsellik, yama kelepçesi kaydı42 ve çoklu elektrot dizisi (MEA) kaydı33,43kullanılarak incelenmiştir. İkincisi, nöronal popülasyonların elektriksel aktivitesinin aynı anda kaydedilmesine izin verir ve kültür koşullarında fotoreceptör ve ganglion hücre işlevselliğini karakterize etmek için yararlanılmıştır. Daha geniş bir perspektifte, organotipik eksplant kültür sistemleri, hipotermi44'ünterapötik etkinliğini test etmek için eksplant kültürlerinin kullanıldığı klinik öncesi araştırmalarda da uygulanabilir.
Organotipik eksplant kültleme tekniğinin gerçekleştirilmesi nispeten basittir ve ilgili in vivo deneylerle karşılaştırıldığında, daha az pahalı ve zaman alıcıdır ve canlı hayvan çalışmaları ile ilgili etik kaygılardan kaçınır. Deneysel koşullar üzerindeki hassas kontrol ve RPE ve doku karmaşıklığının korunması, yöntemi retina fizyolojisi ve patofizyolojisi hakkındaki bilgimizi geliştirmek ve çok sayıda deneysel uygulamaya olanak sağlamak için değerli bir araç haline getirmektedir.

Oftalmik araştırmalarda, birincil retina hücre kültürleri, retina türevli hücre hatları, retina organoidleri ve in vivo hayvan modelleri1, 2 ,3,4,5dahil olmak üzere retinayı incelemek için çeşitli modeller mevcuttur. Ancak, bu modellerin her biri dezavantajlardan muzdariptir. Örneğin, retina çok sayıda hücreden hücreye etkileşime sahip karmaşık bir ağ iken hücreler izole bir şekilde büyür. Bu nedenle, izole hücre kültürlerinin davranışının tüm dokuda gözlemlenene kıyasla yapay olması muhtemeldir. Bu sorun kısmen in vitro farklılaştırılmış retina organoidleri kullanılarak düzeltilebilir, bu da gelişimi ve temel biyolojiyi incelemek için kullanılabilir6. Ancak, bugün itibariyle, retinal organoid üretimi hala zaman alıcı, emek yoğundur ve tekrarlanabilirlik sorunlarından muzdariptir ve organoidlerin çevirisel retina araştırmaları için kullanılabilmesi için önemli ölçüde daha fazla geliştirme çalışması gerektirmektedir. Son olarak, canlı hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalar, tartışmasız oftalmik araştırmanın gereksinimlerine en yakın model olsa da, güçlü etik kaygılarla ilişkilidir. Hücre kültürü sistemlerinin verimliliği ile in vivo hayvan modellerinin gerçek hayattaki durumu arasında iyi bir uzlaşma organotipik retina eksplant kültürleridir. Bu tür kültürler, in vivo müdahale yapılmadığı için hayvan acılarını da azaltır.
Farklı türlerden retina eksplantlarını kültleme için çeşitli yöntemler tanımlanmıştır5,7,8. Protokolümüz, fare nöroretinasının retina pigment epiteliyle (RPE) izolasyonu için bir teknik tanımlamaktadır. Bu teknik sıçan retina kültürleri için de uygun olacaktır9. Nöroretina kültürü RPE ile birlikte başarı için büyük önem taşımaktadır. RPE retina için temel işlevleri yerine getirir: besinlerin, iyonların, suyun taşınması, ışığın emilimi ve fotooksidasyona karşı koruma, tüm trans retinaların görme döngüsü için çok önemli olan 11-cis-retinal içine yeniden izomerizasyonu, dökülen fotoreceptör zarlarının fagositozu ve retinanın yapısal bütünlüğü için temel faktörlerin salgılanması10. RPE'nin korunması, fotoreceptör dış ve iç segmentlerinin başarılı bir şekilde gelişmesine izin verir, retinayı daha uzun süre yaşayabilir tutar11. Aşağıda açıklanan prosedür retinanın histotipik ve fizyolojik özelliklerini en az iki hafta korur12. Ayrıca, organotipik retina eksplantlarının serumsuz, antibiyotik içermeyen ortamda kült haline edilmesi bilinmeyen maddelerin varlığını önler ve sonuçların basit bir şekilde yorumlanmasını sağlar12.
Organotipik retina eksplant kültürleri retina gelişimi ve dejenerasyon hakkındaki bilgimizi geliştirmek için gerekli olmuştur7,13,14. Burada farmakolojik tarama için de yararlı bir araç olduklarını ve diyabetik retinopati de dahil olmak üzere çeşitli retina hastalıklarını modellemek için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+/-)-&#945;-LipoicAcid (=Thiotic acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDP-Choline-Na</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 &#215; 5H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur BT100, 1L, 0.2&#181;m</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3942.101</td>
			<td>for Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps&#160;</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-CysteineHCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linolenic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2 x 4H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaSeO3 x 5H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic microscope scaping spoon</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>10360-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>21935025</td>
			<td>44 mAnson U/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>07491252A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15004-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter 0.22&#181;m</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>for supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopherylacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell permeable supports</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium

Oftalmik araştırmalarda, nöroretina in vitro modellere güçlü bir ihtiyaç vardır. Burada, sağlam retina pigment epitel (RPE) ile fare nöroretina organotipik kültürü için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Araştırma sorusuna bağlı olarak, retinalar vahşi tip hayvanlardan veya hastalık modellerinden izole edilebilir, örneğin diyabetik retinopati veya kalıtsal retina dejenerasyonu çalışmak için. Doğum sonrası erken gün 2-9 hayvanın gözleri aseptik koşullar altında enükle edilir. Koroidin RPE'den ayrılabilmesi için proteinaz K'de kısmen sindirilirler. Stereoskop altında, korneada küçük bir kesi yapılır ve koroid ve skleranın RPE ve nöroretina'dan nazikçe soyulabileceği iki kenar oluşturur. Lens daha sonra çıkarılır ve göz kapağı yonca yaprağına benzeyen dört kamalı bir şekil vermek için dört noktada kesilir. Doku sonunda bir hücre kültürüne asılı bir damla içinde aktarılır polikarbonat kült membran tutan. Kültürler daha sonra serum veya antibiyotik olmadan, tamamen tanımlanmış koşullar altında, her iki günde bir orta değişiklikle R16 ortamında sürdürülür.
Açıklanan prosedür retinanın izolasyonunu ve en az 2 haftalık kültleme süreleri için normal fizyolojik ve histotipik bağlamının korunmasını sağlar. Bu özellikler organotipik retina eksplant kültürlerini, retina gelişimi, hastalık mekanizmaları ve elektrofizyoloji çalışmaları için yüksek tahmin değerine sahip mükemmel bir model haline getirirken, farmakolojik taramayı da mümkün kılar.

Protokolü takip ettikten sonra, parçalanmış ve kültürlü retina eksplantları, Şekil 2'degösterildiği gibi, RPE'den ganglion hücre tabakasına (GCL) kadar farklı katmanlarla normal doku mimarilerini korur. Dış nükleer tabaka (ONL) ve iç nükleer tabaka (INL) boyutu çoğunlukla 2-3 hafta boyunca sabit kaldı, yavaş ilerleyen hücre kaybı ve kültleme süresi 4 hafta ve ötesine uzarsa bu katmanların kademeli olarak inceltilmesi giderek daha belirgin hale geldi. GCL'de, aksine, optik sinirin akstatomisi nedeniyle, genellikle kültlemenin ilk 4 günü içinde belirgin bir inceltme görülür. Daha sonra, GCL'de kalan hücre popülasyonu (çoğunlukla yerinden edilmiş amakrin hücreleri) 3-4 hafta daha yaşayabilir olmaya devamedecektir 17,18,19.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig02.jpg"> Şekil 2: Retina eksplant kültüründe bulunan hücre tipleri. P11'deki retina explant kültürü rd1 mutant (A) ve WT hayvanlarından(B) türetilmiştir ve DAPI (sol, mavi), çubuk fotoreceptörler (orta, kırmızı) ve Müller hücreleri (sağ, yeşil) ile nükleer lekeleme gösterir. Nükleer boyama retinanın retina pigment epitel (RPE), dış nükleer tabaka (ONL), iç nükleer tabaka (INL) ve ganglion hücre tabakası (GCL) gibi tüm ana hücresel katmanlarını vurgular. Nükleer katmanlardaki çubuklar ve Müller hücreler gibi spesifik hücre tipleri, sırasıyla alfa arrestin26 ve glutamin sintetaz27 antikorları ile immün olarak etiketlenir. (C) Tüm rd1 fare retinasının tam uzunlukta bölümünü   gösterir, DAPI boyama retinanın tutarlılığını, entegrasyonunu ve gelişimini vurgular. Bu retinalar 6 gün boyunca kültürlendi. Prosedür açıklaması: Rd1 veya WT hayvanlarından elde edilen Retina ve RPE, P5'te izole edildi ve protokolde açıklandığı gibi, her 48 saat orta değişiklikle P11'e kadar kültürlendi. Kültürler P11'de %4 PFA ile sabitlendi ve kriyoseksiyon yapıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig02large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın</a>
Serumsuz ortam ve sürekli in vitro ortam, deneysel koşullar üzerinde tam kontrole sahip olmayı sağlar. Burada, bu protokolün belirli uygulamaları için iki örnek sunuyoruz. İlk örnek, retina eksplantlarını ilaç testi veya tarama amacıyla kullanma olasılığını göstermektedir. Organotipik retina eksplant kültürleri vahşi tip (WT) ve rd1 fare modellerinden hazırlanmıştır. İkincisi retina dejenerasyonu için iyi karakterize edilmiş bir modeldir15. Rd1 fare retinasında, ONL dejenerasyonu, çubuk fotoreceptörlerde anormal derecede yüksek cGMP seviyeleri tarafından tetiklenir6,20. Aşırı cGMP, döngüsel nükleotid kapılı iyon kanallarının (CNGC' ler) ve cGMP'ye bağımlı protein kinazının (PKG) aktivitesinin artmasına neden olarak hücre ölümüne yol21. rd1 fare retinalarının cGMP'ye yapısal bir analog ile tedavisi (döngüsel nükleotid #3; Hem PKG hem de CNGC'yi hedefleyen CN003 test edildi. P5'te eksplantasyondan sonra Şekil 3A'da açıklanan tedavi paradigması takip edildi. Explant kültürleri P11'de % 4 PFA ile sabitlendi ve kriyoseksiyon için hazırlandı (Şekil 3A). Tedavi edilen, tedavi edilmeyen (NT) ve WT örneklerinden histolojik bölümlerin hücre ölümünü değerlendirmek için terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick ucu etiketlemesi (TUNEL)22 yapıldı. TUNEL etiketli hücrelerin analizi, rd1 işlenmemiş örneklerin ONL'sinde yüksek oranda ölmekte olan hücreler gösterirken, CN003 50 μM23 konsantrasyonda uygulandığında rd1 fare fotoseptörlerini korudu (Şekil 3B).
Diyabetin sık görülen bir komplikasyonu diyabetik retinopatidir, hayvan modellerinde sadakatle üremesi zor olan kör edici bir hastalıktır5. İkinci örnek, tip-2 diabetes mellitus (T2DM)24'eöykünen koşullar altında retina hücre canlılığını karakterize etmek için organotipik retina eksplant kültürlerinin kullanımını vurgulamaktadır. Burada glikoliz inhibitörü 2-deoksi-glikoz (2-DG)25'in 20 mM'liğini kullandık ve P10'dan P11'e kadar 24 saat boyunca kültür ortamına uyguladık. WT retina eksplantlarının bu tür in vitro simüle diyabetik durumlara maruz tutulmasının retinanın kapsamlı nöronal hücre ölümüne yol açtığını gösteriyoruz(Şekil 3C). Bu paradigma daha sonra, örneğin dejeneratif mekanizmaları incelemek veya diyabet bağlamında retinoprotektif tedavileri test etmek için kullanılabilir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig03.jpg"> Şekil 3: Organotipik retina eksplant kültürlerinin uygulamaları için iki örnek. (A) Prosedür açıklaması: Rd1 veya WT hayvanlarından elde edilen retina ve RPE, doğum sonrası gün (P) 5'te izole edildi ve yukarıda açıklandığı gibi, her 48 saat orta değişiklikle kültürlendi. P7 ve P9'da, harcanan ortam atıldı ve plakaya 50 μM konsantrasyonda aktif bileşik içeren taze CM eklendi. Kültürler P11'de %4 PFA ile sabitlendi ve kriyoseksiyon yapıldı. (B) Rd1 retina üzerinde bileşik test. Bölümler WT, tedavi (003) ve tedavi edilmeyen (NT) organotipik retina eksplant kültürlerinden elde edildi. TUNEL tahlili (kırmızı) hücre ölümü için bir işaretleyici olarak kullanılmıştır. DAPI (mavi) ile nükleer boyama. Çubuk grafikte gösterilen niceleme, WT, rd1 NT ve rd1 003 koşulunda ölen hücrelerin yüzdelerini gösterir. Bileşik 003 ile tedavi önemli ölçüde azaltılmış rd1 fotoreceptör hücre ölümü. (C) 2-deoksi-glikoz (2-DG) tedavisi kullanılarak WT retinada tip-2 diabetes mellitus (T2DM) simülasyon. TUNEL tahlili NT ve T2DM örneklerinde yapıldı. Niceleme, hücre ölümünde oldukça önemli bir artış olduğunu gösteriyor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig03large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın</a>
Tablo S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S1%20-%20Basal%20Medium.doc" target="_blank">Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız</a>  
Tablo S2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S2%20-%20Supplements.doc" target="_blank">Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız</a>  
Tablo S3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S3%20-%20Complete%20Medium.doc" target="_blank">Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız</a>

Watch this Scientific Journal Video about Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

Protokol, fare nöroretinasınınorganotipik eksplantlarını açıklar Retina pigment epiteliyle (RPE) birlikte yetiştirilen, R16 tanımlı ortamda, serum ve antibiyotik içermez. Bu yöntemin in vivo deneylere kıyasla gerçekleştirilmesi nispeten basit, daha az pahalı ve zaman alıcıdır ve çok sayıda deneysel uygulamaya uyarlanabilir.

Sağlam Retina Pigment Epitel ile Organotipik Fare Retina Eksplantlarının Uzun Süreli, Serumsuz Ekimi

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

long-term-serum-free-cultivation-organotypic-mouse-retina-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Görüntüleme.  University of Tübingen. Protokol, fare nöroretinasınınorganotipik eksplantlarını açıklar Retina pigment epiteliyle (RPE) birlikte yetiştirilen, R16 tanımlı ortamda, serum ve antibiyotik içermez. Bu yöntemin in vivo deneylere kıyasla gerçekleştirilmesi nispeten basit, daha az pahalı ve zaman alıcıdır ve çok sayıda deneysel uygulamaya uyarlanabilir.

Video: Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Nörobilim

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human retina and is therefore a valuable species for studying mechanisms of human retinal injury and degenerative disease. Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina isolated from eyes obtained from an abattoir. After removing the anterior segment, a trephine blade was used to create multiple neural retina-Bruch's membrane-RPE-choroid-sclera explants from the posterior segment of adult porcine eyes. A piece of sterile filter paper was used to lift the neural retina off from each explant. The filter paper-retina complex was cultured (photoreceptor side up) atop an insert, which was held away from the bottom of the culture dish by a custom-made stand. The stand allows for good circulation of the culture medium to both sides of the retina. Overall, this procedure is simple, reproducible, and permits preservation of native retinal structure for at least seven days, making it a useful model for a variety of morphological, pharmacological, and biochemical studies on mammalian retina.

Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina for seven days. Briefly, a sterile filter paper was used to lift the neural retina off from the RPE and place photoreceptor side up on an insert raised by a custom-made stand.

Tam kalınlıkta Yetişkin Domuz Retina Organotipik Kültür

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Fare Beyin Uzun vadeli Görüntüleme için Parlak ve Takviyeli inceltilmiş-kafatası Pencere

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Fare Koklear Eksplantlarından uzun vadeli Time Lapse Görüntüleme

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Fareler Retina Pigment Epitel Gen Tedavisi için Viral Vektörler Limbal Yaklaşım-Subretinal Enjeksiyon

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning in mice. By permanently wearing a device fixed on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages. Therefore, this protocol readily enables the study of the visual system and multisensory interactions over an extended timeframe that would not be accessible otherwise. In addition to lowering the experimental costs of long-term sensory learning in naturally behaving mice, this approach accommodates the combination of in vivo and in vitro experiments. In the reported example, video-oculography is performed to quantify the vestibulo-ocular reflex (VOR) and optokinetic reflex (OKR) before and after learning. Mice exposed to this long-term sensory conflict between visual and vestibular inputs presented a strong VOR gain decrease but exhibited few OKR changes. Detailed steps of device assembly, animal care, and reflex measurements are hereby reported.

The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning. By permanently wearing a fixed device on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages.

Fareler serbestçe davranıyor uzun vadeli duyusal çatışma

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...

Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate (cGMP)-dependent protein kinase (PKG) pathway in photoreceptor cells causes photoreceptor cell death, especially in models harboring phosphodiesterase 6b (PDE6b) mutations. Previous studies on RD have used mainly murine models such as rd1 or rd10 mice. Given the genetic and physiological differences between mice and humans, it is important to understand to which extent the retinas of primates and rodents are comparable. Macaques share a high level of genetic similarity with humans. Therefore, wild-type macaques (aged 1-3 years) were selected for the in vitro culture of retinal explants that included the retina-retinal pigment epithelium (RPE)-choroid complex. These explants were treated with different concentrations of the PDE6 inhibitor zaprinast to induce the cGMP-PKG signaling pathway and simulate RD pathogenesis. cGMP accumulation and cell death in primate retinal explants were subsequently verified using immunofluorescence and the TUNEL assay. The primate retinal model established in this study may serve for relevant and effective studies into the mechanisms of cGMP-PKG-dependent RD, as well as for the development of future treatment approaches.

Retinal explants obtained from wild-type macaques were cultured in vitro. Retinal degeneration and the cGMP-PKG signaling pathway was induced using the PDE6 inhibitor zaprinast. cGMP accumulation in the explants at different zaprinast concentrations was verified using immunofluorescence.

Makak Maymunundan Organotipik Retinal Eksplant Kültürleri

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

Murin bölünmüş retinada bipolar ve yatay nöronal hücrelerin incelenmesi

Split Retina as an Improved Flatmount Preparation for Studying Inner Nuclear Layer Neurons in Vertebrate Retina

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by photoreceptors. They perform fundamental operations such as light adaptation, contrast sensitivity, and spatial and color opponency. A complete understanding of the precise circuitry and biochemical mechanisms that govern their behavior will advance visual neuroscience research and ophthalmological medicine. However, current preparations for examining bipolar and horizontal cells (retinal whole mounts and vertical slices) are limited in their capacity to capture the anatomy and physiology of these cells. In this work, we present a method for removing photoreceptor cell bodies from live, flatmount mouse retinas, providing enhanced access to bipolar and horizontal cells for efficient patch clamping and rapid immunolabeling. Split retinas are prepared by sandwiching an isolated mouse retina between two pieces of nitrocellulose, then gently peeling them apart. The separation splits the retina just above the outer plexiform layer to yield two pieces of nitrocellulose, one containing the photoreceptor cell bodies and another containing the remaining inner retina. Unlike vertical retina slices, the split retina preparation does not sever the dendritic processes of inner retinal neurons, allowing for recordings from bipolar and horizontal cells that integrate the contributions of gap junction-coupled networks and wide-field amacrine cells. This work demonstrates the versatility of this preparation for the study of horizontal and bipolar cells in electrophysiology, immunohistochemistry, and in situ hybridization experiments.

Yazar Spotlight: Gelişmiş Erişim ve Hızlandırılmış Deneyler için Bölünmüş Retina Tekniğini Kullanma 

This work presents an alternative flatmount retina preparation in which the removal of photoreceptor cell bodies enables faster antibody diffusion and improved patch pipette access to inner retinal neurons for immunohistochemistry, in situ hybridization, and electrophysiology experiments.