Name: long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium
Uploaded: 2020-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Bu araştırma çalışması Avrupa Birliği'nden mali destek aldı (transMed; H2020-MSCA-765441), Alman araştırma konseyi (DFG; PA1751/8-1, 10-1) ve Çin burs konseyi.

Alman hayvanları koruma yasasının §4'üne uygun hayvan protokolleri Tübingen Üniversitesi hayvanları koruma komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı (Einrichtung für Tierschutz, Tierärztlichen Dienst und Labortierkunde; Kayıt No AK02/19M). Bu çalışmada, retinalar vahşi tip (WT) ve rd1 farelerden elde edildi, ikincisi kalıtsal retina dejenerasyonu için iyi karakterize edilmiş birmodeldir 15. Fareler standart beyaz döngüsel aydınlatma altında barındırıldı, yiyecek ve suya ücretsiz erişime sahipti ve cinsiyetten bağımsız olarak kullanıldı.
1. Kontrol listesi
<ol><li>Steril koşulları sağlamak ve kirlenmeleri önlemek için laminer hava akış davlumbazını % 70 etanol ile temizleyin ve dezenfekte edin. Retina kültürlerinin zehirlenmesini önlemek için etanol'ün tamamen buharlaşmasına izin verdiğinden emin olun.</li>
	<li>Kullanmadan önce otoklav aletleri (örneğin makas, hardal ve oftalmik mikroskop kazıma kaşığı).</li>
	<li>Aşağıdaki ortamı steril koşullar altında laminer akışlı bir davlumbaz altında önceden hazırlayın: Bazal R16 ortamı (BM) (4 hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir), %20 fetal baldır serumu (FCS) ile BM (aynı gün kullanım), 0,0 ile BM % 12 proteinaz K (44 mAnson U/mg) çözeltisi (aynı gün kullanımı) ve Romijn 16 tarafından açıklandığı gibi takviyeli (CM) kompleR16 ortamı (3 hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir) (bkz. Tablolar S1, S2 ve S3).</li>
	<li>Proteinaz K çözeltisini etkinleştirmek için 37 °C'de önceden ısıtın ve 2.5.</li>
</ol>2. Hazırlık
<ol><li>Doğum sonrası gün (P) 5'te rd1/WT hayvanlarını kafa kesme ile kurban edin. P11'den büyük hayvanlar için, yerel hayvan koruma yönetmeliklerine göre CO2 ve/veya servikal çıkık kullanın.</li>
	<li>Hayvanın yaşına bağlı olarak, enükleasyondan önce, gerekirse, göz kapaklarını uzun uçlar kullanarak açın ve aşağıdaki göze dokunmadan veya kaşımadan göz kapaklarını çok dikkatli bir şekilde ayırın.</li>
	<li>Kavisli asalar kullanarak stereoskop altında gözleri hızla enüklee edin.</li>
	<li>Gözleri BM'de oda sıcaklığında (RT) 5 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Gözleri önceden ısıtılmış BM'de 15 dakika boyunca 37 °C'de% 0.12 proteinaz K ile kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Steril koşulları sağlamak için laminer hava akış başlığı içinde aşağıdaki adımları uygulayın. Proteinaz K'yi inaktive etmek için gözleri% 20 FCS içeren BM'ye aktarın ve RT'de 5 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Rt'de taze BM içeren bir Petri kabında gözleri bir stereoskop altında, aseptik olarak parçalara ayırma. Bu süre ne kadar uzun olursa, retinayı parçalamak o kadar zorlaşır, gözler çok yumuşak hale gelir.<ol>
<li>Asalarla, gözü optik sinirden tutun. İnce makas kullanarak korneada küçük bir kesi yaparak kornea, koroid ve skleranın 2 çift ince tokmakla hafifçe soyulabileceği yerden 2 kenar oluşturun(Şekil 1 adım A–C). Alternatif olarak, korneaya ilk kesiyi yapmak için dar bir kanonül kullanın ve ardından makas bıçaklarından birini açıklığa yerleştirin.</li>
		<li>Lensi ince kanatlarla kavrayın. İlk atalara dik olarak ikinci bir çift tokmak yerleştirin, böylece ilk toslar ikincisinin 2 sapı arasındadır. Lensi göz kabından çıkarmak için çekin. Vitreus ve siliary vücut hala retinaya bağlıysa, dikkatlice çıkarın(Şekil 1 adım D). NOT: Adım 2.7.1 ve 2.7.2 pratik gerekir ve retinaya zarar vermemek için dikkatli olun.</li>
		<li>Retinayı kenarlarına dik olarak dört noktada kesin ve dört yapraklı yonca şekli oluşturun(Şekil 1 adım E-F).</li>
		<li>1 mL ucun geniş kesim tabanına sahip bir pipet kullanarak, retinayı asılı bir orta damlada tutun ve 6 kuyulu bir kültür plakasına yerleştirilmiş bir kültür yemeği filtresine aktarın. RPE tabakası zara bakmalıdır(Şekil 1 adım G).</li>
		<li>Bir pipet kullanarak, fazla ortamı kesici uçtan dikkatlice çıkarın.</li>
		<li>Kuyunun yanlarından, kuyu başına 1 mL CM ekleyin ve% 5 CO2ile 37 ° C'de steril bir inkübatörde kuluçkaya yatırın. Retinayı ortama batırmayın, çünkü bu oksijenlenmeyi azaltır ve doku dejenerasyonuna neden olur. Explant, sadece suyun yüzey gerilimi tarafından oluşturulan ince bir sıvı filmi ile kaplanmış sıvı ve hava arasındaki arayüzde kalmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eksplantasyon işleminden sonra iyileşmeyi kolaylaştırmak için retinayı ilk 48 saat boyunca bozulmadan bırakın.</li>
	<li>Ortamı her iki günde bir değiştirin (48 saat). Her kuyudan 700 μL orta atın ve kuyuya 900 μL taze CM ekleyin. Bu sayede buharlaşma ile kaybedilen ortam miktarı geri kazanılır ve retina eksplantı önceki 48 saat içinde üretilen nöroprotektif faktörlerin bir kısmını tutar.</li>
	<li>Olası kontaminasyonu (yani ortamın renginin değişmesini) kontrol etmek ve değerlendirmek için çıkarılan ortamı kültürlerle birlikte ayrı ve kapalı bir mikrosantrifüj tüpünde kuluçkaya yatırın. NOT: Retina eksplantları kültürde en az 2 hafta tutulabilir12.</li>
</ol>3. Kültlemeden sonra
NOT: Explants farklı deneysel uygulamalar (batı lekesi, histoloji, tüm binekler, genetik analiz, elektrofizyoloji) için kullanılabilir. Uygulamaya bağlı olarak, organotipik retina eksplantları dondurulabilir, yutabilir veya kriyoseksiyon için hazırlanabilir. Aşağıdaki adımlar histolojik hazırlığı açıklar.
<ol><li>%4 paraformaldehit (PFA) ile 45 dakikalık bir fiksasyon gerçekleştirin, ardından kademeli sakkaroz kriyoproteksiyon (10 dakika için%10 sakkaroz, 20 dakika için %20 ve oda sıcaklığında (RT) 2 saat veya 4 °C'de geceleme (AÇIK) için %30). Bu arabellekleri doğrudan kuyuya ekleyin.</li>
	<li>Retina eksplantlarının etrafındaki zarı kesin.</li>
	<li>Donmuş doku için hem zarı hem de retina dokusunu ortama gömün.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig01.jpg"> Şekil 1: Organotipik retina eksplant kültürlerinin hazırlanması için adım adım prosedür. (A) Fare gözleri, sklera ve koroidlerin retina ve RPE'den ayrılmasını sağlamak için enükle edilir ve proteinaz K çözeltisine aktarılır. Sklera/koroid tabakasında küçük bir kesik sunulmuştur. (B) Sklera/koroid tabakasını soymak için iki adet tokmak kullanılır. (C) Siyah koroid tabakası peeling sırasında görülebilir. Altı çizili koyu retina pigment epitel (RPE) göz küresine bağlı kalır. Sklera ve koloid optik sinir ile birlikte çıkarılır. (D) Lens ve vitreus, emişlerle çıkarılır.  Kalan siliary vücut çıkarılır. (E) Retina kase benzeri bir şekil korur. (F) Bir tabakta kültleme için retinayı düzleştirmek için, retinanın etrafında eşit mesafede 4 kesik bir makasla yapılır ve yonca benzeri bir şekil verilir. Retina kültürü, kesilmiş 1 mL pipet ucu kullanılarak 6 kuyulu bir plakada bir membran kültürü kesici ucuna aktarılır. Retina hala kase şeklinin bir kısmını koruyor. Bununla birlikte, retinayı çevreleyen fazla sıvının çıkarılmasından sonra, düzlemsal bir yapıya açılacaktır. (G) Kültür zarı kurulumunda retina kültürü, tam bir R16 ortamı çözeltisinin üzerine gözenekli bir polikarbonat (PC) membran üzerinde dinlenir. Canlılığı sağlamak için, kültür% 5 CO2ile 37 ° C'de nemlendirilmiş steril bir inkübatörde tutulmalıdır <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank"></a> ve ortam her 48 saat içinde değiştirilmelidir.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Sunulan protokol, tanımlanmış R16 ortamında, serum ve antibiyotik içermeyen, bozulmamış RPE ile fare retinasının organotipik eksplant kültürlerini açıklar. Bu protokol başlangıçta 1980'lerin sonundan başlayarak7,28 ve o zamandan beri sürekli olarakrafineedilmiştir 6,11,12. Önemli uygulamalar kalıtsal retina dejenerasyonu mekanizmalarına yönelik çalışmaları ve retinoprotektif ilaçların tanımlanmasınıiçerir 23,29,30.
Başarılı bir deney için bazı önemli hususların dikkate alınması gerekir. Kültürlerin kalitesini artırmaya yardımcı olacak bazı önemli sorun giderme noktaları aşağıda bulabilirsiniz. İlk olarak, retina kültürleri aşırı katlama ve / veya rozet oluşumu gösterebilir31. Bu, eksplantasyon işlemi sırasında retinaya bir yaban arısı ile dokunmaktan kaynaklanabilir. Ayrıca, siliary vücut, kültür sırasında retina katlamayı artırabileceğinden, eksplanttan tamamen çıkarılmalıdır. İkincisi, retinanın asılı bir damlada kuyu plakasına aktarılması sırasında, retina zarın yanlış tarafına bakılırsa, pipet ucundan sarkan damlada tutun ve retinayı çevirmek için ortamı ucun içine ve dışına (asılı damlayı ayırmadan) çok nazikçe itin. Son olarak, RPE skleraya bağlı kalırsa ve retinadan ayrılırsa, büyük olasılıkla skleranın yetersiz bir prediyajından kaynaklanır. Bu sorun özellikle yaşlı hayvanlardan veya kemirgen olmayan türlerden (örneğin domuzlar) gözlerle çalışırken önemli olabilir ve proteinaz K konsantrasyonu artırılarak çözülebilir.
Organotipik retina eksplant kültürlerinin yürütülmesi, yeterli eğitim ve deneyim gerektiren karmaşık bir prosedürdür. Eğitim eksikliği retina eksplantlarının kalitesinde değişkenliğe yol açabilir. Bu nedenlerden dolayı, canlılık ve tekrarlanabilirliği izlemek ve doğrulamak önemlidir, örneğin TUNEL test ile hücre ölüm oranını karakterize etmek. Antibiyotik içermeyen bir ortamın kullanılması, retina eksplantlarını bakteri ve mantarların kirlenmesine karşı savunmasız hale getirir. Bu riski en aza indirmek için, gerçekten aseptik koşullar altında çalışmaya özellikle özen göstermenizi öneririz. İn vitro retina kültleşmesinin bir diğer sınırlaması, in vivo retina ile karşılaştırıldığında fizyofimik ortamdaki farklılıklardır (örneğin, koroidal ve retinal kan akışı, oksijen ve glikoz seviyeleri, göz içi basıncı, vitreus bileşimi). Sürekli bir perfüzyon sistemi, belki de özel bir biyoreaktör32'ye gömülü bu modeli in vivo durumuna yaklaştırır. Ayrıca, retina diseksiyonu sırasında optik sinirin akstotomisi ganglion hücre ölümüne yol açacaktır, bu da stres yanıtlarına neden olabilir8. Bu nedenle, eksplantın belirli bir manipülasyona veya tedaviye tabi tutulmadan önce en az 2 gün boyunca kültleme koşullarına uyum sağlaması tavsiye edilir.
Açıklanan yöntem genellikle 4 hafta boyunca iyi hayatta kalabilen olgunlaşmamış retina dokuları üzerinde gerçekleştirilir in vitro7,33. Bununla birlikte, prosedür yetişkin retinanın kült haline alınması da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalara göre uyarlanabilir. Yayınlanan farklı yaklaşımlar yetişkin retinasının RPE34,35olmadan izolasyonunu açıklasa da, diseksiyondan önce 37 ° C'de 1 saate kadar papain çözeltisi ile inkübasyon, RPE'nin yetişkin bir fareden türetildiğinde bile retinaya bağlı kalmasını sağlar36.
Serumsuz ortam ve kimyasal olarak tanımlanmış in vitro ortam, deneysel koşulların tamamen tanımlanmış ve tekrarlanabilir bir manipülasyonu sağlar. Bu nedenle, organotipik retina eksplant kültürleri oftalmoloji ve sinirbilim alanında değerli araçlardır ve retina hastalıkları37, retina gelişimi 38 ,39, retina kök hücre tedavisi40,genetik modifikasyonlar41ve farmakolojik tarama için kullanılmıştır. İlaç testlerinin özel bir örneği olarak, burada kalıtsal retina hastalığı için hayvan modellerinde fotoreceptör hücre ölümünü azalttığı bilinen bir cGMP analogu (CN003) test etmek için retina explant kültürlerini kullandık23 (Şekil 3B). Tekniğin bir başka olası uygulaması Şekil 3C'de açıklanmıştır Doku ortamının hassas kontrolünün diyabetik koşulları taklit etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir24. Doku mimarisinin tüm kültleme dönemi boyunca korunması nedeniyle organotipik retina eksplant kültürleri elektrofizyolojik çalışmalar için de uygundur. Retina eksplantları üzerindeki nöronal işlevsellik, yama kelepçesi kaydı42 ve çoklu elektrot dizisi (MEA) kaydı33,43kullanılarak incelenmiştir. İkincisi, nöronal popülasyonların elektriksel aktivitesinin aynı anda kaydedilmesine izin verir ve kültür koşullarında fotoreceptör ve ganglion hücre işlevselliğini karakterize etmek için yararlanılmıştır. Daha geniş bir perspektifte, organotipik eksplant kültür sistemleri, hipotermi44'ünterapötik etkinliğini test etmek için eksplant kültürlerinin kullanıldığı klinik öncesi araştırmalarda da uygulanabilir.
Organotipik eksplant kültleme tekniğinin gerçekleştirilmesi nispeten basittir ve ilgili in vivo deneylerle karşılaştırıldığında, daha az pahalı ve zaman alıcıdır ve canlı hayvan çalışmaları ile ilgili etik kaygılardan kaçınır. Deneysel koşullar üzerindeki hassas kontrol ve RPE ve doku karmaşıklığının korunması, yöntemi retina fizyolojisi ve patofizyolojisi hakkındaki bilgimizi geliştirmek ve çok sayıda deneysel uygulamaya olanak sağlamak için değerli bir araç haline getirmektedir.

Oftalmik araştırmalarda, birincil retina hücre kültürleri, retina türevli hücre hatları, retina organoidleri ve in vivo hayvan modelleri1, 2 ,3,4,5dahil olmak üzere retinayı incelemek için çeşitli modeller mevcuttur. Ancak, bu modellerin her biri dezavantajlardan muzdariptir. Örneğin, retina çok sayıda hücreden hücreye etkileşime sahip karmaşık bir ağ iken hücreler izole bir şekilde büyür. Bu nedenle, izole hücre kültürlerinin davranışının tüm dokuda gözlemlenene kıyasla yapay olması muhtemeldir. Bu sorun kısmen in vitro farklılaştırılmış retina organoidleri kullanılarak düzeltilebilir, bu da gelişimi ve temel biyolojiyi incelemek için kullanılabilir6. Ancak, bugün itibariyle, retinal organoid üretimi hala zaman alıcı, emek yoğundur ve tekrarlanabilirlik sorunlarından muzdariptir ve organoidlerin çevirisel retina araştırmaları için kullanılabilmesi için önemli ölçüde daha fazla geliştirme çalışması gerektirmektedir. Son olarak, canlı hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalar, tartışmasız oftalmik araştırmanın gereksinimlerine en yakın model olsa da, güçlü etik kaygılarla ilişkilidir. Hücre kültürü sistemlerinin verimliliği ile in vivo hayvan modellerinin gerçek hayattaki durumu arasında iyi bir uzlaşma organotipik retina eksplant kültürleridir. Bu tür kültürler, in vivo müdahale yapılmadığı için hayvan acılarını da azaltır.
Farklı türlerden retina eksplantlarını kültleme için çeşitli yöntemler tanımlanmıştır5,7,8. Protokolümüz, fare nöroretinasının retina pigment epiteliyle (RPE) izolasyonu için bir teknik tanımlamaktadır. Bu teknik sıçan retina kültürleri için de uygun olacaktır9. Nöroretina kültürü RPE ile birlikte başarı için büyük önem taşımaktadır. RPE retina için temel işlevleri yerine getirir: besinlerin, iyonların, suyun taşınması, ışığın emilimi ve fotooksidasyona karşı koruma, tüm trans retinaların görme döngüsü için çok önemli olan 11-cis-retinal içine yeniden izomerizasyonu, dökülen fotoreceptör zarlarının fagositozu ve retinanın yapısal bütünlüğü için temel faktörlerin salgılanması10. RPE'nin korunması, fotoreceptör dış ve iç segmentlerinin başarılı bir şekilde gelişmesine izin verir, retinayı daha uzun süre yaşayabilir tutar11. Aşağıda açıklanan prosedür retinanın histotipik ve fizyolojik özelliklerini en az iki hafta korur12. Ayrıca, organotipik retina eksplantlarının serumsuz, antibiyotik içermeyen ortamda kült haline edilmesi bilinmeyen maddelerin varlığını önler ve sonuçların basit bir şekilde yorumlanmasını sağlar12.
Organotipik retina eksplant kültürleri retina gelişimi ve dejenerasyon hakkındaki bilgimizi geliştirmek için gerekli olmuştur7,13,14. Burada farmakolojik tarama için de yararlı bir araç olduklarını ve diyabetik retinopati de dahil olmak üzere çeşitli retina hastalıklarını modellemek için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

<table><tbody><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>(+/-)-&amp;alpha;-LipoicAcid (=Thiotic acid)</td><td>Sigma</td><td>T1395</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>CDP-Choline-Na</td><td>Sigma</td><td>30290</td><td></td></tr><tr><td>Corticosterone</td><td>Sigma</td><td>C2505</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;times; 5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>C8027</td><td></td></tr><tr><td>DL-Tocopherol</td><td>Sigma</td><td>T1539</td><td></td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Sigma</td><td>E0135</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur BT100, 1L, 0.2&amp;micro;m</td><td>SARSTEDT</td><td>83.3942.101</td><td>for Basal Medium</td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>F.S.T</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>L-CysteineHCl</td><td>Sigma</td><td>C7477</td><td></td></tr><tr><td>Linoleic Acid</td><td>Sigma</td><td>L1012</td><td></td></tr><tr><td>Linolenic Acid</td><td>Sigma</td><td>L2376</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;x 4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M5005</td><td></td></tr><tr><td>Na-pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P3662</td><td></td></tr><tr><td>NaSeO&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;x 5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic microscope scaping spoon</td><td>F.S.T.</td><td>10360-13</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>21935025</td><td>44 mAnson U/mg</td></tr><tr><td>R16</td><td>Gibco</td><td>07491252A</td><td></td></tr><tr><td>Retinol</td><td>Sigma</td><td>R7632</td><td></td></tr><tr><td>Retinyl acetate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R7882</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>F.S.T</td><td>15004-08</td><td></td></tr><tr><td>Sterile filter 0.22&amp;micro;m</td><td>MILLEX GP</td><td>SLGP033RS</td><td>for supplements</td></tr><tr><td>T3&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Tocopherylacetate</td><td>Sigma</td><td>T1157</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1283</td><td></td></tr><tr><td>Transwell permeable supports</td><td>Corning</td><td>3412</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin B1</td><td>Sigma</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin B12</td><td>Sigma</td><td>V6629</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin C</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr></tbody></table>

long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium

Oftalmik araştırmalarda, nöroretina in vitro modellere güçlü bir ihtiyaç vardır. Burada, sağlam retina pigment epitel (RPE) ile fare nöroretina organotipik kültürü için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Araştırma sorusuna bağlı olarak, retinalar vahşi tip hayvanlardan veya hastalık modellerinden izole edilebilir, örneğin diyabetik retinopati veya kalıtsal retina dejenerasyonu çalışmak için. Doğum sonrası erken gün 2-9 hayvanın gözleri aseptik koşullar altında enükle edilir. Koroidin RPE'den ayrılabilmesi için proteinaz K'de kısmen sindirilirler. Stereoskop altında, korneada küçük bir kesi yapılır ve koroid ve skleranın RPE ve nöroretina'dan nazikçe soyulabileceği iki kenar oluşturur. Lens daha sonra çıkarılır ve göz kapağı yonca yaprağına benzeyen dört kamalı bir şekil vermek için dört noktada kesilir. Doku sonunda bir hücre kültürüne asılı bir damla içinde aktarılır polikarbonat kült membran tutan. Kültürler daha sonra serum veya antibiyotik olmadan, tamamen tanımlanmış koşullar altında, her iki günde bir orta değişiklikle R16 ortamında sürdürülür.
Açıklanan prosedür retinanın izolasyonunu ve en az 2 haftalık kültleme süreleri için normal fizyolojik ve histotipik bağlamının korunmasını sağlar. Bu özellikler organotipik retina eksplant kültürlerini, retina gelişimi, hastalık mekanizmaları ve elektrofizyoloji çalışmaları için yüksek tahmin değerine sahip mükemmel bir model haline getirirken, farmakolojik taramayı da mümkün kılar.

Protokolü takip ettikten sonra, parçalanmış ve kültürlü retina eksplantları, Şekil 2'degösterildiği gibi, RPE'den ganglion hücre tabakasına (GCL) kadar farklı katmanlarla normal doku mimarilerini korur. Dış nükleer tabaka (ONL) ve iç nükleer tabaka (INL) boyutu çoğunlukla 2-3 hafta boyunca sabit kaldı, yavaş ilerleyen hücre kaybı ve kültleme süresi 4 hafta ve ötesine uzarsa bu katmanların kademeli olarak inceltilmesi giderek daha belirgin hale geldi. GCL'de, aksine, optik sinirin akstatomisi nedeniyle, genellikle kültlemenin ilk 4 günü içinde belirgin bir inceltme görülür. Daha sonra, GCL'de kalan hücre popülasyonu (çoğunlukla yerinden edilmiş amakrin hücreleri) 3-4 hafta daha yaşayabilir olmaya devamedecektir 17,18,19.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig02.jpg"> Şekil 2: Retina eksplant kültüründe bulunan hücre tipleri. P11'deki retina explant kültürü rd1 mutant (A) ve WT hayvanlarından(B) türetilmiştir ve DAPI (sol, mavi), çubuk fotoreceptörler (orta, kırmızı) ve Müller hücreleri (sağ, yeşil) ile nükleer lekeleme gösterir. Nükleer boyama retinanın retina pigment epitel (RPE), dış nükleer tabaka (ONL), iç nükleer tabaka (INL) ve ganglion hücre tabakası (GCL) gibi tüm ana hücresel katmanlarını vurgular. Nükleer katmanlardaki çubuklar ve Müller hücreler gibi spesifik hücre tipleri, sırasıyla alfa arrestin26 ve glutamin sintetaz27 antikorları ile immün olarak etiketlenir. (C) Tüm rd1 fare retinasının tam uzunlukta bölümünü   gösterir, DAPI boyama retinanın tutarlılığını, entegrasyonunu ve gelişimini vurgular. Bu retinalar 6 gün boyunca kültürlendi. Prosedür açıklaması: Rd1 veya WT hayvanlarından elde edilen Retina ve RPE, P5'te izole edildi ve protokolde açıklandığı gibi, her 48 saat orta değişiklikle P11'e kadar kültürlendi. Kültürler P11'de %4 PFA ile sabitlendi ve kriyoseksiyon yapıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig02large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın</a>
Serumsuz ortam ve sürekli in vitro ortam, deneysel koşullar üzerinde tam kontrole sahip olmayı sağlar. Burada, bu protokolün belirli uygulamaları için iki örnek sunuyoruz. İlk örnek, retina eksplantlarını ilaç testi veya tarama amacıyla kullanma olasılığını göstermektedir. Organotipik retina eksplant kültürleri vahşi tip (WT) ve rd1 fare modellerinden hazırlanmıştır. İkincisi retina dejenerasyonu için iyi karakterize edilmiş bir modeldir15. Rd1 fare retinasında, ONL dejenerasyonu, çubuk fotoreceptörlerde anormal derecede yüksek cGMP seviyeleri tarafından tetiklenir6,20. Aşırı cGMP, döngüsel nükleotid kapılı iyon kanallarının (CNGC' ler) ve cGMP'ye bağımlı protein kinazının (PKG) aktivitesinin artmasına neden olarak hücre ölümüne yol21. rd1 fare retinalarının cGMP'ye yapısal bir analog ile tedavisi (döngüsel nükleotid #3; Hem PKG hem de CNGC'yi hedefleyen CN003 test edildi. P5'te eksplantasyondan sonra Şekil 3A'da açıklanan tedavi paradigması takip edildi. Explant kültürleri P11'de % 4 PFA ile sabitlendi ve kriyoseksiyon için hazırlandı (Şekil 3A). Tedavi edilen, tedavi edilmeyen (NT) ve WT örneklerinden histolojik bölümlerin hücre ölümünü değerlendirmek için terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick ucu etiketlemesi (TUNEL)22 yapıldı. TUNEL etiketli hücrelerin analizi, rd1 işlenmemiş örneklerin ONL'sinde yüksek oranda ölmekte olan hücreler gösterirken, CN003 50 μM23 konsantrasyonda uygulandığında rd1 fare fotoseptörlerini korudu (Şekil 3B).
Diyabetin sık görülen bir komplikasyonu diyabetik retinopatidir, hayvan modellerinde sadakatle üremesi zor olan kör edici bir hastalıktır5. İkinci örnek, tip-2 diabetes mellitus (T2DM)24'eöykünen koşullar altında retina hücre canlılığını karakterize etmek için organotipik retina eksplant kültürlerinin kullanımını vurgulamaktadır. Burada glikoliz inhibitörü 2-deoksi-glikoz (2-DG)25'in 20 mM'liğini kullandık ve P10'dan P11'e kadar 24 saat boyunca kültür ortamına uyguladık. WT retina eksplantlarının bu tür in vitro simüle diyabetik durumlara maruz tutulmasının retinanın kapsamlı nöronal hücre ölümüne yol açtığını gösteriyoruz(Şekil 3C). Bu paradigma daha sonra, örneğin dejeneratif mekanizmaları incelemek veya diyabet bağlamında retinoprotektif tedavileri test etmek için kullanılabilir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig03.jpg"> Şekil 3: Organotipik retina eksplant kültürlerinin uygulamaları için iki örnek. (A) Prosedür açıklaması: Rd1 veya WT hayvanlarından elde edilen retina ve RPE, doğum sonrası gün (P) 5'te izole edildi ve yukarıda açıklandığı gibi, her 48 saat orta değişiklikle kültürlendi. P7 ve P9'da, harcanan ortam atıldı ve plakaya 50 μM konsantrasyonda aktif bileşik içeren taze CM eklendi. Kültürler P11'de %4 PFA ile sabitlendi ve kriyoseksiyon yapıldı. (B) Rd1 retina üzerinde bileşik test. Bölümler WT, tedavi (003) ve tedavi edilmeyen (NT) organotipik retina eksplant kültürlerinden elde edildi. TUNEL tahlili (kırmızı) hücre ölümü için bir işaretleyici olarak kullanılmıştır. DAPI (mavi) ile nükleer boyama. Çubuk grafikte gösterilen niceleme, WT, rd1 NT ve rd1 003 koşulunda ölen hücrelerin yüzdelerini gösterir. Bileşik 003 ile tedavi önemli ölçüde azaltılmış rd1 fotoreceptör hücre ölümü. (C) 2-deoksi-glikoz (2-DG) tedavisi kullanılarak WT retinada tip-2 diabetes mellitus (T2DM) simülasyon. TUNEL tahlili NT ve T2DM örneklerinde yapıldı. Niceleme, hücre ölümünde oldukça önemli bir artış olduğunu gösteriyor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig03large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın</a>
Tablo S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S1%20-%20Basal%20Medium.doc" target="_blank">Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız</a>  
Tablo S2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S2%20-%20Supplements.doc" target="_blank">Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız</a>  
Tablo S3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S3%20-%20Complete%20Medium.doc" target="_blank">Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız</a>

Watch this Scientific Journal Video about Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

Protokol, fare nöroretinasınınorganotipik eksplantlarını açıklar Retina pigment epiteliyle (RPE) birlikte yetiştirilen, R16 tanımlı ortamda, serum ve antibiyotik içermez. Bu yöntemin in vivo deneylere kıyasla gerçekleştirilmesi nispeten basit, daha az pahalı ve zaman alıcıdır ve çok sayıda deneysel uygulamaya uyarlanabilir.

Sağlam Retina Pigment Epitel ile Organotipik Fare Retina Eksplantlarının Uzun Süreli, Serumsuz Ekimi

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

long-term-serum-free-cultivation-organotypic-mouse-retina-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.5K Görüntüleme.  University of Tübingen. Protokol, fare nöroretinasınınorganotipik eksplantlarını açıklar Retina pigment epiteliyle (RPE) birlikte yetiştirilen, R16 tanımlı ortamda, serum ve antibiyotik içermez. Bu yöntemin in vivo deneylere kıyasla gerçekleştirilmesi nispeten basit, daha az pahalı ve zaman alıcıdır ve çok sayıda deneysel uygulamaya uyarlanabilir.

Video: Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human retina and is therefore a valuable species for studying mechanisms of human retinal injury and degenerative disease. Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina isolated from eyes obtained from an abattoir. After removing the anterior segment, a trephine blade was used to create multiple neural retina-Bruch's membrane-RPE-choroid-sclera explants from the posterior segment of adult porcine eyes. A piece of sterile filter paper was used to lift the neural retina off from each explant. The filter paper-retina complex was cultured (photoreceptor side up) atop an insert, which was held away from the bottom of the culture dish by a custom-made stand. The stand allows for good circulation of the culture medium to both sides of the retina. Overall, this procedure is simple, reproducible, and permits preservation of native retinal structure for at least seven days, making it a useful model for a variety of morphological, pharmacological, and biochemical studies on mammalian retina.

Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina for seven days. Briefly, a sterile filter paper was used to lift the neural retina off from the RPE and place photoreceptor side up on an insert raised by a custom-made stand.

Tam kalınlıkta Yetişkin Domuz Retina Organotipik Kültür

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

Nörobilim

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic age-related macular degeneration (AMD) which represents 90% of the cases. Therapies are needed to slow or retard the development of geographic atrophy (GA), and understanding Bruch&#39;s membrane pathology is part of this process. Alterations in human Bruch&#39;s membrane precede the progression of AMD by contributing to the damage of retinal pigment epithelial (RPE) cells. Given the lack of sufficient animal models to study AMD, ex vivo models of aged human Bruch&#39;s membrane serve as a useful tool to study the behavior of RPE cells from immortalized and primary cell lines as well as RPE lines derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs). Here, we present a detailed method that allows one to determine the effects of RPE cell behavior seeded on harvested human Bruch&#39;s membrane explants from human donors, including attachment, apoptosis and proliferation, ability to phagocytize photoreceptor outer segments, establishment of polarity, and gene expression. This assay provides an ex vivo model of aged Bruch&#39;s membrane to assess the functional characteristics of RPE cells when seeded on aged/compromised extracellular matrix.

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

The goal of this protocol is to demonstrate the culturing of retinal pigment epithelial (RPE) cells on aged and/or diseased human Bruch&#39;s membrane. This method is suitable to study RPE cell behavior on a compromised extracellular matrix.

Bir Ex Vivo modeli yaşlı insan Bruch'ın membran bir retina Pigment epitel hücrelerinin kültürü

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

Gelişim Biyolojisi

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

Tanımlanmış Xeno-alerjik ve besleyici-Alerjik kültür koşulları üretimi insan IPSC kaynaklı Retina hücre modelleri için

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, retina-specific or conditional knockout mouse models often display early lethality or suffer from severe malformations, preventing an analysis beyond embryonic or early postnatal stages.
Primary cell culture is an alternative to investigate the effects of exogenously applied recombinant factors, overexpression of genes or siRNA-mediated gene knockdown in a controlled environment. Dissociated cell culture has the advantage that the endogenous signals reaching the target cells are reduced, thereby facilitating the identification of exogenously triggered effects after pharmacological manipulation. However, important cell-cell interactions are initially destroyed by enzymatic digestion or mechanical dissociation, even if re-aggregated retinospheroid cultures1 are used.
By contrast, organotypic retinal wholemount cultures provide a system close to the physiological in vivo situation with neuronal interactions and connections still preserved2-5.
In this video article we provide a step by step demonstration of (1) the establishment of in vivo-like organotypic retinal wholemount cultures including dissection peculiarities of embryonic, postnatal and adult murine eyes and (2) a dissociation and cytospin procedure for analysis of neuronal apoptosis and retinal cell proliferation in organotypic wholemounts, e.g. after culture in the presence of exogenously applied recombinant factors.

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

This video article demonstrates the establishment of organotypic retinal wholemount cultures and a cytospin procedure for analysis of exogenously induced effects. Organotypic retinal wholemount cultures mimic the in vivo situation and significantly facilitate the accessibility of murine retinas for experimental manipulations while circumventing the disadvantages of classical murine animal models.

Organotipik murin Retina Wholemount Kültür in vivo

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

Biyoloji

Generation of Human Patient iPSC-derived Retinal Organoids to Model Retinitis Pigmentosa

Retinitis pigmentosa (RP) is a rare and inherited retinal degenerative disease with a prevalence of approximately 1/4,000 people worldwide. The majority of RP patients have progressive photoreceptor degeneration leading to peripheral vision loss, night blindness, and finally, total blindness. To date, thousands of mutations in more than 90 genes have been reported to be associated with RP. Currently, there are few animal models available for all the affected genes and different types of mutations, which largely hampers the deciphering of the mechanisms underlying the gene/mutation pathology and limits treatment and drug development. Patient induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived 3D retinal organoids (ROs) have provided a better system to model the human early-onset disease than cells and animals. In order to study RP, those patient-derived 3D retinal organoids were utilized to recapitulate the clinical phenotypes of RP. In the RP patient-derived ROs, Rhodopsin mislocalization was clearly displayed. Compared with other animal models, patient iPSC-derived retinal organoid models more closely recapitulated RP features and represent an ideal approach for investigating the disease pathogenesis and for drug development.

<meta charset="utf8"></head><body>Retinitis Pigmentosa'yı Modellemek için İnsan Hasta iPSC'den Türetilmiş Retinal Organoidlerin Üretilmesi

In this protocol, retinitis pigmentosa patient induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived 3D retinal organoids were generated. Those organoids successfully recapitulated some clinical phenotypes of the retinitis pigmentosa disease.

Retinitis Pigmentosa'yı Modellemek için İnsan Hasta iPSC'den Türetilmiş Retinal Organoidlerin Üretilmesi

Retinitis pigmentosa (RP) is a rare and inherited retinal degenerative disease with a prevalence of approximately 1/4,000 people worldwide. The majority ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

Yeni bir İnsan Organotipik Retina Kültürü Tekniğinin Karakterizasyonu

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Tıp

Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate (cGMP)-dependent protein kinase (PKG) pathway in photoreceptor cells causes photoreceptor cell death, especially in models harboring phosphodiesterase 6b (PDE6b) mutations. Previous studies on RD have used mainly murine models such as rd1 or rd10 mice. Given the genetic and physiological differences between mice and humans, it is important to understand to which extent the retinas of primates and rodents are comparable. Macaques share a high level of genetic similarity with humans. Therefore, wild-type macaques (aged 1-3 years) were selected for the in vitro culture of retinal explants that included the retina-retinal pigment epithelium (RPE)-choroid complex. These explants were treated with different concentrations of the PDE6 inhibitor zaprinast to induce the cGMP-PKG signaling pathway and simulate RD pathogenesis. cGMP accumulation and cell death in primate retinal explants were subsequently verified using immunofluorescence and the TUNEL assay. The primate retinal model established in this study may serve for relevant and effective studies into the mechanisms of cGMP-PKG-dependent RD, as well as for the development of future treatment approaches.

Retinal explants obtained from wild-type macaques were cultured in vitro. Retinal degeneration and the cGMP-PKG signaling pathway was induced using the PDE6 inhibitor zaprinast. cGMP accumulation in the explants at different zaprinast concentrations was verified using immunofluorescence.

Makak Maymunundan Organotipik Retinal Eksplant Kültürleri

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular cells. Isolating, culturing, and sustaining retinal neurons in vitro have technical and biological limitations. Culturing retinal explants may overcome these limitations and offer a unique ex vivo model to study the cross-talk between various retinal cells with well-controlled biochemical parameters and independent of the vascular system. Moreover, retinal explants are an effective screening tool for studying novel pharmacological interventions in various retinal vascular and neurodegenerative diseases such as diabetic retinopathy. Here, we describe a detailed protocol for retinal explants' isolation and culture for an extended period. The manuscript also presents some of the technical problems during this procedure that may affect the desired outcomes and reproducibility of the retinal explant culture. The immunostaining of the retinal vessels, glial cells, and neurons demonstrated intact retinal capillaries and neuroglial cells after 2 weeks from the beginning of the retinal explant culture. This establishes retinal explants as a reliable tool for studying changes in the retinal vasculature and neuroglial cells under conditions that mimic retinal diseases such as diabetic retinopathy.

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

This protocol presents and describes steps for the isolation, dissection, culturing, and staining of retinal explants obtained from an adult mouse. This method is beneficial as an ex vivo model for studying different retinal neurovascular diseases such as diabetic retinopathy.

Retinal Nörovasküler Hastalıkları İncelemek için Ex Vivo Modeli Olarak Yetişkin Fare Retinasının Retinal Eksplantı

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular ...

Kültürlenmiş Primer Murin RPE'nin Karakterizasyonu ve Morfolojik Dinamiği

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

Yazar Spotlight: Retinopati Araştırmaları için Yetişkin Farelerden Primer Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli İzolasyonu

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Sağlam Retina Pigment Epitel ile Organotipik Fare Retina Eksplantlarının Uzun Süreli, Serumsuz Ekimi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Tam kalınlıkta Yetişkin Domuz Retina Organotipik Kültür

Bir Ex Vivo modeli yaşlı insan Bruch'ın membran bir retina Pigment epitel hücrelerinin kültürü

Tanımlanmış Xeno-alerjik ve besleyici-Alerjik kültür koşulları üretimi insan IPSC kaynaklı Retina hücre modelleri için

Organotipik murin Retina Wholemount Kültür in vivo

Retinitis Pigmentosa'yı Modellemek için İnsan Hasta iPSC'den Türetilmiş Retinal Organoidlerin Üretilmesi

Retinitis Pigmentosa'yı Modellemek için İnsan Hasta iPSC'den Türetilmiş Retinal Organoidlerin Üretilmesi

Yeni bir İnsan Organotipik Retina Kültürü Tekniğinin Karakterizasyonu

Makak Maymunundan Organotipik Retinal Eksplant Kültürleri

Retinal Nörovasküler Hastalıkları İncelemek için Ex Vivo Modeli Olarak Yetişkin Fare Retinasının Retinal Eksplantı

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem