NIH tarafından desteklenen çalışma AI102838 ve AI117739 (CRW) verir. Richard Rossoll teknik yardım için teşekkür ederiz. Akış sitometrik analiz DartLab, Dartmouthsupported (P30CA023108-37) tarafından ve (P30GM103415-15) paylaşılan kaynak gerçekleştirilmiştir.

İnsan denekler içeren çalışmalar Helsinki Bildirgesi içinde ifade edilen ilkelere göre yapılmıştır. Çalışmalar Dartmouth kolej Kurumsal değerlendirme Komitesi ve komite için koruma, insan denekler (CPHS) tarafından kabul edildi. Yazılı Onam hysterectomies Dartmouth Hitchcock Tıp Merkezi (Lübnan, NH) geçiren HIV-negatif kadın ameliyattan önce elde edildi. Eğitimli patologlar EM, CX ve ECX, patolojik lezyonlar içermez ve patoloji sitelerden uzak doku örnekleri seçilir. Kan örnekleri Dartmouth Hitchcock Tıp Merkezi işe gönüllü sağlıklı bağışçılardan elde edilmiştir. Kan Bağış anonim. Ameliyathane taze izole EM, CX ve ECX dokulardan patoloji yalıtım ve sınıflandırma önceki bizim laboratuvar ayrı, steril polipropilen borular içinde transfer etmek için transfer.
1. Enzimatik sindirim dokuların
Not: biyolojik Emanet dolabı iş ve steril malzemeler kullanabilirsiniz.
<ol><li>Değiştirilmiş bir Hank'in dengeli tuz çözüm (1 x HBSS fenol red, 100 U/mL penisilin-streptomisin, 0.35 g/L NaHCO3ve 20 mM HEPES ile kullanarak HBSS) hazırlayın.</li>
	<li>Enzimatik kokteyl hazırlamak (değiştirilmiş HBSS, 450 U/mL collagenase IV, %0.01 [wt/vol] deoksiribonükleaz ben ve 2 mg/mL D-glikoz). Çözüm bir steril 0,22 µm filtreden geçmek. İdeal olarak, sindirim enzim kullanımı gününde hazırlamak, ancak depolama için-20 ° C'de dondurulmuş olması. Tekrarlanan dondurma ve çözme döngüleri kaçının.</li>
	<li>Değiştirilmiş HBSS ve 100 x 15 mm2 Petri kabına yerde dokuyla durulayın. Doku mevcut miktarına göre Petri kabına boyutu ve kullanılan enzim kokteyl hacmi ayarlayın (bkz. Adım 1.4.2 aşağıda). Not: Dokulara bağlı olarak 1-10 g arasında değişen patoloji, elde edilen cerrahi örnek boyutu değişir.</li>
	<li>Fiziksel işlem tek kullanımlık neşter ve Forseps ile:<ol>
<li>Sindirim enzim kokteyl yaklaşık 3 mL kesme iken kurutma önlemek için doku ekleyin.</li>
		<li>Forseps doku stabilize etmek ve sindirim enzim kokteyl maruz doku yüzey alanını artırmak için bir neşter ile bin dereden su getirmek için kullanın. Doku küçük parçalara (< 2 mm bir tarafta) kes. Tüm doku parçaları (5 mL/g doku) karşılamak için yeterli sindirim enzim kokteyl ekleyin. Kapağı üzerinde Petri kabına yerleştirin.</li>
		<li>%5 CO2 yaklaşık 80 rpm 45 dk. rotator hız iyice sindirim enzim kokteyl dökülmesini veya baloncuklar üreten olmadan karışımları olduğunu sağlamak için bir rotator 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Doku hazırlık ile ters bir ışık mikroskobu ile 4 X ve 10 X hedefleri görselleştirin. Not: sindirim sonra küçük doku parçaları ve bir karma hücre süspansiyon görünür epitel bezleri de dahil olmak üzere mevcut olmalıdır ( şekil 1A' ya bakınız).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. fiziksel ayırma tek hücre
<ol><li>Steril bir ortamda, gergin 250 µm mesh sahibi ile 150 x 15 mm2 Petri kabına yerleştirin. Mesh yaklaşık 0.5 cm Petri kabına yüzeyi üzerinde olduğundan emin olun.</li>
	<li>Mesh ile değiştirilmiş HBSS 2 mL ıslak ve sindirilmiş doku mesh üzerine aktarın.</li>
	<li>10 mL şırınga dalgıç düz yüzeyini kullanarak, nazikçe ama sıkıca, sindirilmiş kıyılmış doku mesh ile eziyet. Dikkat: çok agresif taşlama, mesh zarar ve hücre ölüm artırmak. Bu adımı epitel hücreleri ve stromal hücreler (bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere) bağ dokusu ve mukus ayrı.</li>
	<li>Doku parçaları iyice dağınık sonra mesh ve tutucu yükseltmesine 2-3 cm yukarıda Petri kabına ve durulama 3 mL ile değiştirilen ek hücreleri kurtarmak için HBSS.</li>
	<li>Hücre süspansiyon toplamak. 20 µm mesh sahibi ile bir Petri kabına ve ıslak değiştirilmiş HBSS 2 mL ile yerleştirin. Hücre süspansiyon tutan mesh mesh dökün 2-3 cm yukarıda Petri kabına ve durulama ile değiştirilmiş HBSS 6 mL. Not: Bu adımı kafes geçmek tek hücrelerden üst korunur epitel sayfaları ayrı olacak. Akış yoluyla bağışıklık hücreleri ve stromal fibroblastlar içeren bir karma hücre askıya alınmasıdır.</li>
	<li>Karma hücre süspansiyon ve 10 dk. aspiratı sıvı 500 x g, santrifüj toplamak ve Pelet yoğunluk gradient Santrifüjü için değiştirilmiş HBSS 4 ml resuspend.</li>
	<li>Karma hücre süspansiyon üzerinde 3 mL polysucrose çözüm ve 30 dk için 500 x g de oda sıcaklığında santrifüj fren yok ile katman. Beyaz bant polysucrose çözüm tepesinden toplamak ve PBS ile yıkayın. Not: Bu kesir bağışıklık hücreleri zengindir ve bazı stromal fibroblastlar içeren zenginleştirilmiş karma hücre askıya alınmasıdır.</li>
</ol>3. ölü hücre kaldırma
Not: ölü hücreleri (> %20) büyük bir yüzdesi yoğunluk gradient Santrifüjü sonra zenginleştirilmiş karma hücre süspansiyon varsa, manyetik boncuklar ile ölü hücre kaldırma önerilir. Ölü hücreleri olumlu manyetik boncuk seçim süreci ile girişime neden olabilir beri kaldırılması gerekir.
<ol><li>Bir hemasitometre 10 X amacı ile hafif bir mikroskop kullanarak hücreleri saymak. Spin aşağı zenginleştirilmiş karma hücre süspansiyon (500 x g, 10 min, 4 ° C) tüm hücrelerde. Tamamen Aspire edin ve süpernatant atın. Ölü hücre kaldırma boncuk başına 1 x 107 toplam hücreleri (canlı ve ölü), üreticinin yönergelerine göre 100 µL ekleyin. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>30 µm filtre manyetik sütunun üstüne yerleştirin, hücre süspansiyon uygulamak ve manyetik sütunu boyunca düşmeye boncuk etiketli hücreleri sağlar.</li>
	<li>Ölü hücre kaldırma arabellek sütununda önerilen (3 mL) yıkayın. Canlı hücreleri içeren aracılığıyla akış-toplamak. Ölü hücre çıkarıldıktan sonra hücre Kurtarma aralığı şekil 1Badımında sunulur. Not: Bu hücreler phenotypical çalışmalar (Bölüm 5) Boyama Akış Sitometresi gerçekleştirmek için kullanılabilir veya DC yalıtım (Bölüm 4) ile devam edin.</li>
</ol>4. DC arıtma olumlu manyetik boncuk seçime göre
<ol><li>Ölü hücre kaldırma (Adım 3.2), spin hücreleri aşağı, süpernatant kaldırmak ve 1 x 107 hücreleri (PBS, % 0.5 ısı inaktive insan AB serumu (HS), 2 mM EDTA) başına 80 µL manyetik seçimi arabellek hücre Pelet resuspend.</li>
	<li>DC nüfus pozitif seçim için üreticinin yönergelerini (20 µL manyetik boncuklar başına 1 x 107 hücreleri) göre CD1a veya CD14 manyetik boncuklar ekleyin. 4° c de 15 dakika kuluçkaya
</li>
	<li>Manyetik seçimi arabellek hücrelerle yıkama, spin aşağı ve arabellek tamamen kaldırın. En az 500 µL manyetik seçimi arabelleği hücrelerde resuspend.</li>
	<li>Mıknatıs için sütun ekleyin ve 30 µm filtre üst kısmında kalan herhangi bir hücre kümeleri korumak için sütun ekleyin. Filtre ve sütun olarak tavsiye manyetik seçimi arabelleği ile yıkayın.</li>
	<li>Hücre süspansiyon sütun için geçerlidir. 3 kez manyetik seçimi arabellek ile yıkayın.</li>
	<li>Sütun bir 15 mL tüp transfer manyetik seçimi arabellek 5 mL ekleyin ve pistonu sütun Seçili hücrelerden serbest bırakmak için geçerlidir.</li>
	<li>Saflık artırmak için yeni bir sütun kullanarak kurtarılan hücrelerle adımları 4.4-4,6 yineleyin. Manyetik boncuk seçimden sonra hücre Kurtarma aralığı şekil 1 ciçinde sunulur.</li>
</ol>5. hücre saflık değerlendirilmesi: Akış Sitometresi ve mikroskopi
<ol><li>Antikor: Akış Sitometresi için boyama<ol>
<li>1 x 100 µL 106 hücrelerde resuspend % 20 içeren PBS, ısı-Fc reseptörü engellemek ve buz üzerinde 10 min için kuluçkaya HS inaktive olur.</li>
		<li>İstenen fluorescently antikorlar ve ölü hücreleri tanımlanması için reaktif etiketli ekleyin (örneğin, Bölüm 6.5 bakın). Floresans eksi bir (FMO) denetimleri kapıları kurmak ve tek leke denetimleri için tazminat hazırlamak için tazminat boncuk kullanmak için ayarlayın. Antikorların kullanılan örnek Tablo 1' de verilmiştir. Işıktan korunan 4 ° C'de 20 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>Manyetik seçimi arabelleğinin 2 mL hücrelerle yıkayın. Not: EDTA varlığı akış sitometrik çözümlemesi için topaklanma hücre oluşumunu önlemek önemlidir. Spin aşağı ve süpernatant atın.</li>
		<li>Hücreleri % 2 paraformaldehyde çözüm tüp başına 100 µL ekleyerek düzeltmek.</li>
		<li>Örneklerinde bir Akış Sitometresi10,11tarafından analiz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sütun (örneğin, cytospin) spin ve Morfoloji analiz etmek için boyama Giemsa kullanın:<ol>
<li>Manyetik seçimi arabelleği 200 µL hücrelerde resuspend.</li>
		<li>Bir spin sütun ve 5 min için spin yük. Tamamen kurumasını slayt izin.</li>
		<li>Slayt Slayt deiyonize su ile %100 metanol 2 dk. durulama için daldırma tarafından tamir ve kuru hava sağlar.</li>
		<li>Bir standart Wrights-Giemsa boyama gerçekleştirmek. Eozin hücrelerle kapak ve 10 dakikadır kuluçkaya, deiyonize su ile yıkayın ve kurumaya bırakın. Wrights Geimsa leke hücrelerle kapak, 1 dk. için kuluçkaya, deiyonize suyla durulayın ve kuru hava.</li>
		<li>Hazırlıklar bir ters mikroskopla (şekil 2A, 40 X hedef) inceleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. allojeneik stimülasyon tahlil DC hücre işlevi değerlendirmek için
<ol><li>Dondurulmuş periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) çözme<ol>
<li>Hücre kültür medya % 10 ile sıcak HS ile 37 ° c</li>
		<li>PBMCs kadar donmuş hücre medya az miktarda cryotube içinde kalır 37 ° C su banyosu cryotube koyarak çözülme. Steril bir ortamda 10 mL % 10 ile Önceden ısıtılmış hücre kültür ortamının cryotube içeriğini aktarmak HS 15mL tüp içinde.</li>
		<li>Santrifüj kapasitesi ~ 500 x g 7 dakika süreyle medyayı çıkarın, pelet dağıtmak, PBMCs 10 ml %10 HS ve santrifüj ile hücre kültür ortamının resuspend hücreleri.</li>
		<li>Yıkama adım üçüncü kez tekrarlayın. Hücreleri saymak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Saf T-hücre seçimi:<ol>
<li>Bir negatif seçim manyetik antikor hücre seçimi kiti üreticinin protokole göre saf T-hücreleri belirlemek için kullanın.</li>
		<li>Yalıtım sonra CD45RA ve CCR7 antikorları kullanarak saflık denetleyin. Not: > %99 saf T-hücreleri tipik Saflık derecesi var.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Saf T-Hücre proliferasyonu boya boyama:<ol>
<li>Hücre çoğalması boya, boya ışığa maruz kalma korumak, 2 x çözümünün 600 µL hazırlayın.</li>
		<li>Saf T-hücreleri 2 yıkama x PBS ile. 500 µL PBS hücrelerde resuspend.</li>
		<li>Yavaşça vortexing Biyogüvenlik kabini, hücrelerde nükleer silahların yayılmasına karşı boya 500 µL saf T-hücreleri ekleyin.</li>
		<li>37° c de 10 dakika için hücreleri kuluçkaya
</li>
		<li>5 mL % 10 ile hücre kültür medya ekleyerek hücre etiketleme durdurmak hücrelere HS. Işıktan korunan 5 min için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>Senaryo Özeti santrifüj kapasitesi ~ 500 x g 7 dk, medya Aspire edin ve 4 ° C % 10 ile hücre kültür ortamının hücrelerde resuspend HS. İki kez daha 3 yıkar toplam için yineleyin. Bir aliquot önce son Santrifüjü saymak için hücre al. Not: Normal olarak, % 5 ve ilk PBMC hücre sayısı % 15 arasında son saf T-hücre sayı aralığı olacaktır.</li>
		<li>Hücre kültür medya % 10 ile hücrelerle resuspend istenen hücre konsantrasyonu, HS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DC allojeneik saf T hücreli ortak kültür:<ol>
<li>01: 15'de izole DCs ve saf T-hücreleri bir 96-şey, yuvarlak alt plaka, plaka T-hücreleri DC'lere oranı. DCs aralıkları arasında 3000 ve 5000 hücre/iyi için en uygun numarası sağlamak.</li>
		<li>Plaka santrifüj kapasitesi ~ 500 x g hücreleri iyi merkezinde yer alan olduğundan emin olmak 3 dakika. Hücre hücre iletişim yapılmasına uygun sinyal için önemlidir.</li>
		<li>37 ° C'de için 6 gün kuluçkaya. Nükleer silahların yayılmasına karşı mikroskobu (şekil 3A) ile gerçekleştiği sırada wells görünür hücreleri, küme izlemek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Akış Sitometresi nükleer silahların yayılmasına karşı değerlendirmek için boyama:<ol>
<li>6 gün sonra hücreleri Akış Sitometresi tarafından incelenebilir. Akış Sitometresi için ortak kültür leke.</li>
		<li>Sarı canlılığı boya PBS (maksimum emisyon 572 nm) 2 x çözeltisi hazırlamak. Not: PBS kullanmadan serum önemli, serum proteinler boya ile müdahale).</li>
		<li>Senaryo Özeti ile plaka santrifüj kapasitesi ~ 500 x g 5 min için.</li>
		<li>100 µL süpernatant ile kaldırın. Not: Bu noktada toplamak ve süpernatant çözünür faktörler ayrı analiz için saklayın.</li>
		<li>Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın: PBS 150 µL/kuyu eklemek, santrifüj kapasitesi ~ 500 x g 5 min için bir pipet ile süpernatant ile 150 µL kaldırın. Her kuyuya kalan süpernatant ile 50 µL olduğundan emin olun.</li>
		<li>2 x canlılığı boya 50 µL her şey için ekleyin. Oda sıcaklığında ışıktan korunan 10 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Kuluçka sırasında istenen antikor işaretleri ana karışımı hazırlayın. Örneğin: CD3 APC/Cy7, CD4 PE, CD8 FITC, vb
</li>
		<li>Her şey için antikor karışımı ekleyin. Oda sıcaklığında ışıktan korunan 10 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Hücreler 2 yıkama x PBS + %2 HS: PBS + %2 150 µL/iyi eklemek HS. Santrifüj kapasitesi ~ 500 x g 5 dk. 150 kaldırmak µL süpernatant bir pipet ile için.</li>
		<li>Hücreleri 100 µL/de %2 para-formaldehit ekleyerek düzeltmek. Gerekirse: Polipropilen Akış Sitometresi tüpler için hücreleri ve medya aktarma. Tüpler 4 ° C'de muhafaza ve akış sitometrik çözümlemesi kadar gelen ışık, korumalı.</li>
		<li>Akış Sitometresi tüplerde okunur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+sex+hormones+in+immune+protection+of+the+female+reproductive+tract.">The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract.</a> Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+monocyte-derived+cells:+Two+complementary+and+integrated+functional+systems.">Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems.</a> Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).</li><li>Tagliani, E., Erlebacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+function+at+the+maternal-fetal+interface.">Dendritic cell function at the maternal-fetal interface.</a> Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).</li><li>Kaldensjo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intraepithelial+and+stromal+Langerin+and+CCR5+positive+cells+in+the+human+endometrium:+potential+targets+for+HIV+infection.">Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection.</a> PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).</li><li>Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometrial+dendritic+cell+populations+during+the+normal+menstrual+cycle.">Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle.</a> Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).</li><li>Ballweber, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+langerhans+cells+nonproductively+transporting+HIV-1+mediate+infection+of+T+cells.">Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells.</a> J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).</li><li>Hladik, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+events+in+establishing+vaginal+entry+and+infection+by+human+immunodeficiency+virus+type-1.">Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1.</a> Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).</li><li>Duluc, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+human+vaginal+APC+subsets+in+directing+T-cell+responses.">Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses.</a> Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).</li><li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+flow+cytometry+data:+a+guide+for+the+perplexed.">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).</li><li>Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection,+isolation,+and+flow+cytometric+analysis+of+human+endocervical+samples.">Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Givan, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+leukocytes+in+the+human+female+reproductive+tract:+comparison+of+fallopian+tube,+uterus,+cervix,+and+vagina.">Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina.</a> Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).</li><li>Rodriguez-Garcia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+from+the+human+female+reproductive+tract+rapidly+capture+and+respond+to+HIV.">Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV.</a> Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).</li><li>Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotype+and+susceptibility+to+HIV+infection+of+CD4++Th17+cells+in+the+human+female+reproductive+tract.">Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract.</a> Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).</li><li>Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immune+cells+and+infection+by+HIV+in+human+ovarian+tissues.">Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues.</a> Am J Reprod Immunol. , (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Mukozal DCs şiddetle doku3girdiğinizde hangi onların fenotip ve işlev değişiklikleri doku çevre tarafından etkilenmiş bir nadir hücre nüfus vardır. Kan türetilmiş DCs çok kullanışlı bir model vardır, onlar tamamen dokularda bulunan DC nüfus çeşitliliği temsil etmemektedir. Bu nedenle, Mukozal DCs benzersiz özellikleri anlamak için birincil hücre dokuları yalıtım gereklidir. Yalıtım DC'lerin FRT farklı anatomik sitelerden DC işlevi vitro çalışma ve DC al...

FRT implantasyon ve gebelik1izin verirken patojenlere karşı korumanın çift işlevi vardır. Bunu yapmak için FRT, görünen benzersiz histolojik, immünolojik ve fonksiyonel özellikleri1her anatomik bölge ile bölümlere.
DCs Mukozal yüzeyler mevcut mikroplar akciğer, gut ve genital sistem ile ulaşın ve olası patojenler2için immün gözetim sağlayın olun. DCs saf T-hücreleri Başbakan ve adaptif bağışıklık yanıtı3tetiklemek için benzersiz yeteneği var. DCs FRT içinde de sperm ve başarılı gebelik4izin vermek için gelişmekte olan fetus bulunanlar gibi yabancı antijenleri tolere uzmanlaşmıştır. Bu nedenle, DC fenotip ve işlev konumuna bağlı olarak farklı olacaktır. Öyle ki onların numarası, fenotip ve işlevleri3bulundukları doku çevre tarafından değiştirilir DCs şiddetle doku çevre tarafından etkilenmiştir bilinir. Bu nedenle, bulaşıcı hastalıklar, gebelik ve FRT Kanserinde FRT DCs oynadığı rol, ikamet DCs türetilmiş DC modelleri FRT dokularda bulunan düzenleyici karmaşıklığı gidermek yetersiz kan beri incelenecektir anlamalısın.
İnsan dokusu karakterizasyonu ikamet DCs zorlu hücre içinde Mukozal doku mevcut düşük sayı ve insan doku örnekleri alınırken zorluk nedeniyle. DCs kullanarak doku içinde hücre konumu hakkında bilgilendirir ama fonksiyonel çalışmalar önler ve analiz edilebilir hücre işaretleyicileri tanımlama sayısı sınırlı immünhistokimya5,6, FRT incelenmiştir hemen. Ayrıca, tek hücre izolasyon protokolleri akış sitometrik analizi için gelişmiş7,8,9olmuştur. Bu protokollerin bazıları, geçiş hücreleri izole etmek için DCs göçmen kapasitesi avantajlarından yararlanın. Bu yöntemler genellikle gece incubations ve aktif DCs yelpazesi gerektirir ancak DCs çalışmada kararlı duruma için izin vermez.
Burada, histerektomi örnekler kullanarak, biz optimize DCs FRT, endometrium (EM), farklı anatomik sitelerden yalıtmak için bir protokol endocerviks (CX) ve ectocervix (ECX), phenotypical ve fonksiyonel analiz sağlar. Proteolitik Enzimatik sindirim protokolünü kullanarak, biz hemen sonra doku sindirim olmadan hücre aktivasyonu hücre izolasyon ve akım sitometrik karakterizasyonu için devam edebilirsiniz. Çok renkli Akış Sitometresi kullanarak ve fonksiyonel çalışmalar hücre düşük numaraları için adapte, biz tanımlamak ve DCs FRT. farklı sitelerdeki nadir kümelerine karakterize

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:203px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30015.03</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td>Sigma Aldritch</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22 um Stericup 500 mL&#160; filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mm x 15mm polystyrene petri dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150mm x 15mm polystyrene petri dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150mm x 25mm polystyrene dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td>Treated cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Isotemp Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FICO3500TABB</td>
			<td>5.0% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">American Rotator V</td>
			<td>American DADE</td>
			<td>R4140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 um nylon mesh</td>
			<td>Sefar</td>
			<td>03-250/50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 um nylon mesh</td>
			<td>Sefar</td>
			<td>03-20/14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beckman GS-6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>358702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human AB Serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>HP1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma Aldritch</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Solution (PBS)</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>CL-253</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dead Cell Removal Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pre-separation filter (30um)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quadro MACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACS multi-stand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>USB</td>
			<td>15694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD1a Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-051-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD14 Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eFluor 670 cell proliferation dye</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>9/8/2866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zombie yellow viability dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3 APC/Cy7, anti-human</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>25-0038-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD4 PE, anti-human</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>12-0048-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD8a FITC, anti-human</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>35-0086-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>B43618</td>
			<td>10 color, VBR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSquant Analyzer 10</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-343</td>
			<td>8 color, VBR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of dendritic cells from the human female reproductive tract for phenotypical and functional studies

İnsan dendritik hücreler (DC) içinde Mukozal doku ikamet karakterizasyonu örnekleri alınırken zorluk nedeniyle zordur ve DCs az sayıda doku mevcut. Fenotip ve DCs işlevinin değiştirilmiş doku çevre tarafından henüz, doku ikamet DC nüfus analiz etmek, kan DCs eksik olarak elde edilen bu yana DCs karmaşıklığı dokularda yansıtmak için gerekli olduğu. Burada phenotypical ve fonksiyonel analiz sağlayan histerektomi örnekler kullanarak insan kadın üreme yolu (FRT) DCs yalıtmak için bir iletişim kuralı mevcut. Tek bir hücre hücre süspansiyon, pozitif manyetik boncuk seçime göre takip karışık üretmek için doku sindirim protokol oluşur. Bizim doku sindirim Protokolü phenotypical ve fonksiyonel analizde DC'lerin gecede kuluçka veya hücre etkinleştirme olmadan kararlı duruma sağlayan yüzey işaretleyicileri, ayırmak değil. Bu iletişim kuralı yalıtım diğer bağışıklık hücre tiplerinin veya diğer dokularda DC'lerin izolasyon için adapte edilebilir.

Şekil 1A' gösterildiği gibi aşağıdaki doku sindirim, epitel sayfaları ve bezleri serbest bırakılması görülebilir; Enzimatik sindirim başarıyla tamamlandığını belirten pozitif bir denetimdir. DCs doku gram başına kurtarıldı ve toplam hücrelerin sayısını da şekil 1B ve şekil 1 c, sırasıyla gösterilir. Bağışıklık hücreleri stromal hücre yoğunluğu Santrifüjü<sup ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies at JoVE.com

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

İnsan dişi üreme yolu dendritik hücreler yalıtım Phenotypical ve fonksiyonel çalışmaları için

Biz burada yalıtmak ve phenotypical ve fonksiyonel özellikleri değerlendirilmesi için insan kadın üreme sistemi içinde farklı anatomik bölmeleri dendritik hücrelerden arındırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem diğer bağışıklık hücreleri veya diğer Mukozal doku dendritik hücrelerden yalıtmak için adapte edilebilir.

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

isolation-dendritic-cells-from-human-female-reproductive-tract-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.4K Görüntüleme.  Geisel School of Medicine at Dartmouth. Biz burada yalıtmak ve phenotypical ve fonksiyonel özellikleri değerlendirilmesi için insan kadın üreme sistemi içinde farklı anatomik bölmeleri dendritik hücrelerden arındırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem diğer bağışıklık hücreleri veya diğer Mukozal doku dendritik hücrelerden yalıtmak için adapte edilebilir.

Video: Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Fonksiyonel Kardiyak Bağışıklık Hücreleri İzolasyon

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Fare Barsak ayrı dendritik hücreler ve makrofajlar İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Fonksiyonel ve Moleküler Çalışmalar Birincil murin Tip II alveol epitel hücrelerinde akım sitometri İzolasyonu

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

Metabolik fenotipleri farklı olarak sahip Olgunlaşmamış, Olgun ve tolerojenik Dendritik Hücrelerinin Üretimi

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are used for host defense. For the quantitative determination of the functional status of the humoral immune response of an individual, both serum Abs and circulating ASCs are commonly measured as functional readouts. In humans, peripheral blood is the most convenient and readily accessible sample that can be used for the determination of the humoral immune response elicited by host B cells. Distinct B-cell subsets, including ASCs, can be isolated directly from peripheral blood via selection with lineage-specific Ab-conjugated microbeads or via cell sorting with flow cytometry. Moreover, purified na&#239;ve and memory B cells can be activated and differentiated into ASCs in culture. The functional activities of ASCs to contribute to Ab secretion can be quantified by ELISpot, which is an assay that converges enzyme-linked immunoabsorbance assay (ELISA) and western blotting technologies to enable the enumeration of individual ASCs at the single-cell level. In practice, the ELISpot assay has been increasingly used to evaluate vaccine efficacy because of the ease of handling of a large number of blood samples. The methods of isolating human B cells from peripheral blood, the differentiation of B cells into ASCs in vitro, and the employment of ELISpot for the quantification of total IgM- and IgG-ASCs will be described here.

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

İzolasyon, Farklılaşma ve Niceleme İnsan Kanı B Hücreleri Antikor salgılayan: ELISPOT Hümoral Bağışıklık bir Fonksiyonel Göstergesi&#39;nin olarak

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...