Bu çalışmada çek Bilim Vakfı (GACR, grant 17-12816S) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri için bakım ve kullanım, laboratuvar Helsinki Bildirgesi ile uyumlu olan hayvanlar (311/1997, Tarım Bakanlığı, Çek Cumhuriyeti), düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. yalıtım hepatik mikrozomal ve sitozolik kesirler
<ol><li>Karaciğer hücre altı fraksiyonları (P450 enzimleri veya cytosols redüktaz veya çözünür peroxidases zengin zengin microsomes) sıçanlarından emir basit fark Santrifüjü (105.000 x g) hazırlayın. Not: Pelet ve süpernatant microsomes ve cytosols, anılan sıraya göre alınır.<ol>
<li>Karaciğer örnekleri (1-10 g) iki kez ile 50 mM Tris-HCl tampon, pH 7.4 150 mM KCl arabellek (tampon 1) içeren yıkama (ağırlık dokusunun, Yani 10 kat daha yüksek birimleri 10-100 mL) ve küçük parçalara dokular (, 2 x 2 mm boyut çevresinde).</li>
		<li>Bu arabellek huzurunda doku homojenize (> 3 birim/ağırlık mL/g) homogenizer 5 dk ve atma için 4 ° C'de içinde filtrasyon kullanarak doku sigara homojenize arta kalan parçaları kağıt filtre. Homogenate vasıl 600 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant başka bir Santrifüjü tüp için transfer.</li>
		<li>Pelet tampon 1 (1 g doku başına 1 mL) yeniden homojenize, tekrar adım 1.1.3. ve Pelet atın. 15.000 x g 4 ° C'de 20 dk için de havuza alınan supernatants santrifüj kapasitesi Süpernatant başka bir Santrifüjü tüp aktarın.</li>
		<li>Süpernatant 105.000 x g 4 ° C'de 60 dk için de santrifüj kapasitesi Süpernatant (sitozol) toplamak ve aliquots (1-10 mL)-80 ° C'de depolayın Sitozol Bradford26tarafından açıklanan yöntemi kullanarak protein miktarı için karakterize.</li>
		<li>Pelet 100 mM sodyum fosfat tampon pH 7.4 yeniden askıya alma (> 2 birim/ağırlık mL/g), 4 ° C'de 60 dk için 105.000 x g , santrifüj Süpernatant atmak. Pelet (microsomes) 50 mM Tris-HCl tampon, pH 7.4 150 mM KCl ve % 20 gliserol içeren yeniden homojenize (< 5 birim/ağırlık mL/g) homogenizer 4 ° C'de içinde Microsomes 0.5 - 1 mL aliquots-80 ° C'de depolayın Microsomes proteinlerin Bradford26tarafından açıklanan yöntemi kullanarak içerik için karakterize.</li>
		<li>Sitokrom P450 microsomes konsantrasyonu belirlemek. Not: Karbon monoksit (CO) ile azaltılmış P450 kompleksinin emilimini belirleme Omura ve Sato27tarafından açıklandığı gibi P450 enzimleri microsomes içinde konsantrasyonu ölçülür. Karbon monoksit toksik bir bileşik ve özenle ve bir başlık içinde ele alınması gerekiyor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. incubations DNA huzurunda enzimatik sistemleri ile Test Kimyasalları (kanserojen/ilaçlar)
<ol><li>Kuluçka cytochromes P450 içeren oksidatif enzimatik sistemleri varlığında test Kimyasalları (kanserojen/ilaçlar) DNA
	<ol>
<li>Kuluçka karışımlar içeren, son hacmi 4 ° C'de 0.75 mL, aşağıdaki bileşikler ve enzimatik sistemleri hazırlayın.<ol>
<li>Mix 100 mM fosfat tampon, pH 7.4, (0.375 mL) 10 mM NADPH veya NADPH üretme sistemi (10 mM MgCl2, 10 mM D-glukoz 6-fosfat, 10 mM NADP+, 1 U/mL D-glikoz 6 fosfat dehidrogenaz) ile (75 µL).</li>
			<li>Bu karışımı microsomes ekleme veya böcek hücreleri izole microsomes olan Supersomes, saf rekombinant P450 cDNA rekombinant P450 enzimleri, 50 pmol P450 enzimleri 50 µL mikrozomal veya supersomal içeren bir baculovirus yapısı ile transfected hazırlıklar - hepatik mikrozomal kesirler Laboratuvarı veya ticari bir kaynaktan gelen izole.</li>
			<li>1 mg buzağı timus DNA (0.3 mL stok çözeltisi - 3.3 mg/mL distile su içinde) ekleyin ve 5 için bir girdap shaker sallamayın s.</li>
			<li>Son olarak, 7.5 ekleyin µL 0,1 mM test ellipticine uyuşturucu çözünmüş DMSO ve 42,5 µL distile su 0.75 mL karışımı kuluçka hacmi ulaşmak için. Kullanım kimyasallar 3ile H etiketli veya 14C ya da etiketsiz kimyasallar, DNA tespiti için prosedür bağlı olarak adducts.</li>
			<li>Bir girdap üzerinde açılmış tüpler için 30-60 dk 37 ° C'de 5 s. Incubate için sallayıcı.</li>
			<li>Ayrıca iki denetim incubations benzer şekilde, (i) ama aktive sistemi (mikrozomal örnekleri) bulunmayan veya (ii) ile bu ama bileşik testi yapmadan hazırlayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>İncubations huzurunda indirgeyici enzimatik sistemleri test Kimyasalları (kanserojen/ilaçlar) DNA
	<ol>
<li>Kuluçka karışımlar içeren, son hacmi 4 ° C'de 0.75 mL, aşağıdaki bileşikler ve enzimatik sistemleri hazırlayın.<ol>
<li>4 ° C'de 100 mM Tris-HCl mix tampon, %0,2 içeren pH 7.4, ara 20, (0.375 mL), kofaktör NQO1 indirgeyici enzim (NADPH) 10 mM çözümü (75 µL), sitozolik kesir (laboratuar veya sitozolik kullanarak söz konusu olduğunda izole hepatik sitozolik kesirler - kesirler) 1 mg protein (50 µL) içeren ticari kaynağından elde bireysel insan bağışçılardan izole.</li>
			<li>1 mg buzağı timus DNA (0.2 mL stok çözeltisi - 3.3 mg/mL distile su) ekleyin ve 5 için bir shaker sallamayın s.</li>
			<li>Son olarak, 7.5 (distile su, metanol, etanol veya DMSO, bahçedeki çözünürlük bağlı olarak çözünmüş) µL 0,1 mM test kimyasal ve kuluçka karışımı için 0.75 mL hacmi ulaşmak için 42,5 µL distile su ekleyin. Kullanım kimyasallar 3ile H etiketli veya 14C ya da etiketsiz kimyasallar, DNA tespiti için prosedür bağlı olarak adducts (aşağıya bakın).</li>
			<li>1 dk. kapalı tüpler için 30-60 dk 37 ° C'de 5 s. Incubate için bir shaker üzerinde Shake argonla tepki karışımı temizle.</li>
			<li>Ayrıca iki denetim incubations benzer şekilde, (i) ama aktive sistemi (sitozolik kesirler) bulunmayan veya (ii) ile bu ama test kimyasallar olmadan hazırlayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Kuluçka karışımları ile test Kimyasalları fazlalığı kaldırmak için organik çözücüler çıkarımı
	<ol>
<li>Tüp Bebek kuluçka karışımı bir kap ile aynı miktarda Etil asetat (veya Dietil eter veya hekzan) bu maddeleri ekleyerek karıştırın. Tüp içeriğini bir emülsiyon formları kadar üzerinde bir sallayıcı.</li>
		<li>(3 dk), ortam sıcaklığında bir santrifüj 1.600 x g de spin. Organik ve sulu aşamaları düzgün ayrılmış değilseniz, bir kez daha fazla bir uzun dönem veya daha yüksek bir Santrifüjü hız spin.</li>
		<li>Bir pipet ile toplama üst, organik faz kaldırın. Eğer küçük birimler (< 400 µL) olan kullanıldığında, uygun bir ucu ile donatılmış bir otomatik pipet kullanmaktadır. Bu organik faz kenara atıldı.</li>
		<li>Adımları 2.3.1 yineleyin., 2.3.2. ve 2.3.3. Azot gazı akışı tarafından kalan organik çözücüler kaldırmak (en az 5-10 dk kaldırma ihtiyaç vardır).</li>
	</ol></li>
	<li>DNA izolasyonu incubations
	<ol>
<li>
Fenol/kloroform ile çözümleri ve onun yağış etanol ile DNA'ın çıkarılması
		<ol>
<li>Proteinler DNA kuluçka karışımları ile fenol, fenol/kloroform (1:1), DNA'ın çözümlerinden proteinler ayıklayarak yalıtmak ve aşağıda gösterilen yordam tarafından kloroform için ortadan kaldırmak.</li>
			<li>Kuluçka karışımı fenol veya fenol/kloroform (1: bir Şahin 1) veya Eppendorf tüp bir kap ile aynı miktarda ile birleştirir. Karışımı bir emülsiyon formları kadar ilave edin.</li>
			<li>(3 dk), ortam sıcaklığında bir santrifüj 1.600 x g de spin. Organik ve sulu aşamaları düzgün ayrılmış değil, bir kez daha daha uzun bir süre ya da daha yüksek bir Santrifüjü hız spin.</li>
			<li>Bir pipet ile üst su faz için yeni bir polipropilen boru aktarın. Eğer küçük birimler (< 400 µL) olan kullanıldığında, uygun bir ucu ile donatılmış bir otomatik damlalıklı kullanmaktadır. Protein arabirimi ile birlikte organik faz kaldırın.</li>
			<li>Üst su faz fenol ve kloroform (1:1) karışımı aynı miktarı ile birleştirin. Adımlar 2.4.1.2 yeniden. -2.4.1.4.</li>
			<li>Üst su faz kloroform ve 2.4.1.2 arasındaki adımları yineleyin aynı miktarı ile birleştirin. -2.4.1.4. 2 cilt soğuk (-20 ° C) etanol ile yağış tarafından DNA'yı kurtarmak. DNA çözüm hacmi belirlemek.</li>
			<li>5 M Sodyum Klorür final ilavesi ile monovalent katyon konsantrasyonu uyum 0.1 M. konsantrasyonları Stir şiddetle. Soğuk (-20 ° C) etanol 2 cilt ile birleştirmek ve düzgün karıştırın. -20° c ila serin
</li>
			<li>DNA çöktürülmüş kadar-20 ° C'de depolayın. Ne zaman DNA incubations sırasında parçalanmış (örneğin., oksijen radikallerin oluşumunu enzimatik harekete geçirmek reaksiyon sırasında tarafından) veya küçük DNA boyutunu yalıtım yordamına sırasında (< 1 kb) veya DNA ne zaman küçük miktarlarda mevcut (< 0.1 mg / mL), soğutma zaman var olmak artmak zorunda ve sıcaklığı-70 ° C'ye düşmüştür</li>
			<li>1.600 x g bir santrifüj 0 ° C'de, (10 dakika) spin. Bir kez daha fazla DNA düşük konsantrasyonlarda ya da küçük parçalar şeklinde varsa, daha uzun süre (30 dk) spin. Süpernatant atmak.</li>
			<li>Hangi zarlarını DNA'mevcut olabilecek herhangi bir solutes (veya kimyasal test kalıntı izleri) kaldırmak için DNA'sı % 70 etanol ve Dietil eter ile yıkayın. Yıkama çöktürülmüş DNA soğuk (-20 ° C) ile % 70 etanol. 1.600 x g bir santrifüj 0 ° C'de, (10 dakika) spin. Süpernatant atmak.</li>
			<li>2.4.1.10 adımı yineleyin. Yıkama çöktürülmüş DNA soğuk (-20 ° C) ile % 70 etanol. 1.600 x g bir santrifüj 0 ° C'de, (10 dakika) spin. Süpernatant atmak.</li>
			<li>2.4.1.10 adımı yineleyin. Tüp emici kağıt üzerine kalan süpernatant kaldırmak için bir dikey durumuna geçirin. DNA Pelet 1 mL Dietil eter izole DNA kimyasal testi potansiyel artıkları atmak için ekleyerek yıkayın. 1.600 x g bir santrifüj 0 ° C'de, (10 dakika) spin. Süpernatant atmak.</li>
			<li>DNA Pelet uygun birimindeki dağıtılması (0,5 - bir DNA konsantrasyon elde etmek için genellikle 100-400 µL içinde 1 µg/µL) distile su (veya 0.15 mM sodyum sitrat ve 1.5 mM Sodyum Klorür). DNA çözüm 4 ° C'de gecede durabilir veya 37 ° c DNA eriterek artırmak 10-30 dakika ısıtılır.</li>
			<li>Önce Muhafazası, buz gibi ve bir düşüş sonucu konsantrasyonları adduct DNA çözümleri çözme tekrarlanan çünkü küçük aliquots (10-20 µL), DNA ayırın. -80 ° C'de veya soğuk depolar. Not: DNA spektrofotometrik tayini: örnek saf ise bir hazırlık DNA miktarını ölçmek için yaygın olarak kullanılan basit ve doğru yöntemi (Yani, kirletici protein, fenol veya başka önemli miktarda olmadan nükleik asitler), UV DNA radyoterapi miktarın spektrofotometrik ölçüm (bkz: daha önce açıklanan yordamları) bazlar tarafından emilir28.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>DNA tespiti için yordamlar oluşumu adduct
	<ol><li>32 P postlabeling tahlil Not: DNA hidroliz analizi (2.5.1.) adducts için yanı sıra normal (değiştirilmemiş) deoxynucleotides (2.5.7.) bu aşamada hazırlanan hidrolizat kullanır.<ol>
<li>Micrococcal nükleaz (MN) ~ 450 adet (U) bir konsantrasyon, suda çözülür / mL. Karşı distile su diyaliz ve 300 U/mL için ayarlayın. Dalak fosfodiesteraz (SPD) çözüm diyaliz ve 4 U/mL için ayarlayın.</li>
			<li>MN ve SPD son konsantrasyonları 150 mU/µL MN ve 2.5 mU/µL SPD (MN/SPD çözüm) karıştırın. 12.5 µg içeren DNA çözüm alın ve bir Buharlaştırıcı kuruluk için buharlaşır. 6.5 µL distile suda çözülür.</li>
			<li>5.0 µL MN/SPD çözüm ekleyin (MN son konsantrasyonu 60 mU/µL, SPD son konsantrasyonu 1 mU/µL) ve 1.0 µL sindirim tampon (sodyum süksinat son konsantrasyonu 20 mM, CaCl2 final konsantrasyon 8 mM). Son birimin karışımı 12.5 µL. olduğunu Mix ve 37 ° C'de reaksiyonlar 3 h için izin</li>
			<li>2.5 µL (başka bir tüp için transfer) daha fazla seyreltme ve değiştirilmemiş deoxynucleotides (2.5.7.) analizi için Kaldır</li>
		</ol></li>
		<li>Nükleaz P1 zenginleştirme yordamı
		<ol>
<li>Hidrolizat için kalan 10.0 µL eklemek 0.65 µL sodyum asetat tampon (son konsantrasyonu, 40 mM), 0.65 µL ZnCl2 çözüm (son konsantrasyonu 0,1 mM), 1,25 µL NP1 çözüm (son konsantrasyonu, 0.385 µg/µL) ve 0,45 µL distile su. Son karışım 13 µL birimdir.</li>
			<li>37 ° C'de 30 dk için tepki karışım izin verin ve Tris çözüm 3 µL eklenmesi ile reaksiyon sonunda.</li>
		</ol></li>
		<li>n-Butanol zenginleştirme yordamı
		<ol>
<li>DNA hidrolizat için kalan 10.0 µL 215 µL 11,6 mM amonyum formiat çözüm, pH 3.5 ve 25 µL 10 mM TBA klorür çözüm ekleyin. 250 µL nile özü-dinç karıştırma tarafından butanol (su ile doymuş). Ayrı katmanlara ve üst nalmak 1.600 x g de (3 dk) spin-butanol katmanı. Bir kez daha 250 µL nile özü-butanol (su ile doymuş), spin, üst nal-butanol katman ve eski özü ile birleştirmek.</li>
			<li>400 µL su ekleyin ( nile doymuş-butanol) bu ayıklamak ve kuvvetle karıştırın. Ayrı katmanlara ve alt sulu katman silmek için spin. 400 µL su kullanarak bu çamaşır yordamı yineleyin ( nile doymuş-butanol). 250 mm Tris-HCl bir çözüm, pH 9,5, 3 µL eklemek için n-butanol katmanı. Nbuharlaşır-butanol bir Evaporatör, ortam sıcaklığında kuruluk için.</li>
			<li>Kalıntı 100 µL nçözülür-butanol, kuruluk için yeniden buharlaşır ve kalıntı 16.0 µL suda çözülür.</li>
		</ol></li>
		<li>Etiketlerine göre adducts
		<ol>
<li>(Arabellek etiketleme) bicine tampon çözeltinin 1 µL ve 4,5 µL 100 µCi [γ -32P] ATP, 45 pmol soğuk ATP ve 10.0 içeren bir karışımı ekleyin U, T4-PNK (T4-phosphonucleotide kinaz) 16.0 µL çözüm için NP1 veya butanol zenginleştirme mix üzerinden. Reaktifleri son konsantrasyonları aşağıda olacak: 20 mM bicine, 10 mM MgCl2, 10 mM dithiotreitol, 0,5 mM spermidine ve 0.5 U/µL T4-PNK, 3 µM ATP. Toplam karışımı 20 µL birimdir.</li>
			<li>Oda sıcaklığında 30 dakika tepki karışım izin verin. Tüm örnek uygulamak (i.e. 20 µL) PEI-selüloz TLC plaka üzerine (2.5.6.).</li>
		</ol></li>
		<li>NP1 veya n etkinliğinin değerlendirilmesi-butanol yordamlar artırılması
		<ol>
<li>Dibinde tüp 50 µL su ile yıkayın. Orada kurmak için 30 s ve spin bir santrifüj 1.600 x g (1 dk) için şiddetle hiç bulaşma kapağı üzerinde karışımıdır. 5 µL PEI-selüloz TLC tabağa (20 x 20 cm) nokta. Bir çözüm 280 mM (NH4)2ile çok kullanarak Kromatograf4 ve 50 mM NaH2PO4, pH 6.8.</li>
		</ol></li>
		<li>Adducted deoxynucleotides ayrılması TLC
		<ol>
<li>Önceden TLC plakaları distile su ile yıkayın. Özellikle ev yapımı tabak için önerilir. Not: Bu yıkama Kaplamalar, arka plan, özellikle Çözücü açık yükseltebilir bir renk sarı renk kaldırmak için yapılmalıdır.</li>
			<li>Tüm örnek PEI-selüloz TLC plaka üzerine spot ve Kromatografi başlatmak (2.5.4.); Temizlik adducts D1 ve D2 yön (Şekil 2) plaka geliştirme tarafından gerçekleştirilir.</li>
			<li>Bir D1 yönde (Şekil 2) plaka geliştirmek. Kullanım 1.7 M sodyum fosfat tampon, DNA adducts emin olmak için pH 6.8, TLC plaka başında kalan. Mahsum, plaka bu tampon kullanarak D2 yönde geliştirmek. Yordamlar için olası arabellekleri hakkında bilgi için bkz: çözümler çeşitli çözümlenmesi için açıklanan adducts20,28. Not: Plaka D2 yönde geliştirilmesi atlanabilir.</li>
			<li>Kromatografi için yaklaşık 5 dakika içinde iki ardışık banyo sonra plaka deiyonize suyla yıkayın. Bundan sonra tabakları kuru.</li>
			<li>Plakayı 3.5 M lityum formiat tampon, pH 3.5 kullanarak D3 ve D4 yönde geliştirmek, D3 yön için 8.5 M üre ve 0,5 M Tris-HCl tampon, pH 8.0, D4 yön (Şekil 2) için 0, 8 M LiCl ve 8.5 M üre içeren. Çözücüler adduct noktalar TLC plaka üzerinde geliştirmek için ayarlanması gerekir. D3 ve D4 gelişmekte olan yordamlar için olası arabellekleri hakkında bilgi için bkz: çözünürlük birkaç tür23,24,25,28adducts için açıklanan çözümler.</li>
			<li>D4 yön ve su yıkama kalkınma sonra D4, herhangi bir sorunları önlemek için 1.7 M sodyum fosfat, pH (genellikle D5 yönde gelişme olarak atanmış), 6.0 bir kağıt fitil (12 x 11,5 cm) üst (D4) boyunca levha geliştirmek. Not: D5 yön aynı zamanda atlanabilir. Bu durumda, solvent TLC zirvesine ulaşmıştır TLC tankı açın ve kaçmak için 60 dakikaya kadar izin vermek gereklidir. Bu yöntem bir fitil (sık sık D4 herhangi bir sorun silmek için birçok laboratuvarlarda kullanılan yöntemi) ekleyerek daha bile iyidir.</li>
		</ol></li>
		<li>Normal (değiştirilmemiş) deoxynucleotides miktar hidroliz sonra
		<ol>
<li>Hidrolizat bir aliquot seyreltik (--dan 2.5.1. DNA hidroliz açıklayan) distile su ile (i.e., 2.5 µL sindirim karışımı 2.5.1. 250 µL için ayarlanabilir ve bu çözümün 10 µL ayarlanabilir 150 µL).</li>
			<li>5 µL (10 pmol normal deoxynucleotides) bu özünü aliquot al, 2.5 µL 10 mM Tris-HCl tampon, pH 9.0 ve etiket olarak ekleyin 2.5.4. (karışım son hacmi 10 µL is). Oda sıcaklığında 30 dakika tepki olanak sağlar.</li>
			<li>4 µL karışımı aliquot al ve 10 mM Tris-HCl, pH 9.0 ile 750 µL oranında seyreltin. Mix ve spin kapağı yok kirlenme kurmak için. 5 µL PEI-selüloz TLC tabak içinde geçerli. Yani 280 mM (NH4)2bir çözümde TLC plaka geliştirmek4 ve 50 mM NaH2PO4, pH 6,5. TLC sonra kurumasını sağlar.</li>
			<li>Yaklaşık 45 dakika, dört değiştirilmemiş deoxynucleotide bis-fosfat yerelleştirmek için ortam sıcaklığında gerçekleştirilen autoradiography kullanın. Spot için miktar sıvı mercek veya sayma Cerenkov kesti.</li>
		</ol></li>
		<li>Göreli hesaplanması adduct (RAL) etiketleme
		<ol>
<li>Adduct noktalar sayar ve etiketli değiştirilmemiş (normal) deoxynucleotides aliquot sayar değerlerini belirleyin. Not: İkinci eski, RAL değerleri adduct düzeylerinin değerlendirilmesi için değiştirilmemiş (normal) deoxynucleotides sayısı uygulamak için dönüştürme faktörü olan bir rakam daha malzeme daha az 180.000 sayıları belirlenmesi gerekir. DNA RAL adducts yukarıda gösterilen denklem (2) göre hesaplanır.</li>
		</ol></li>
		<li>Bağlama test kanserojen veya uyuşturucu radyoaktif etiketli ilaç kullanarak DNA tespiti
		<ol>
<li>3H veya 14C radyoaktivite sıvı mercek sayarak kimyasallarla değiştirilmiş DNA değerlendirmesi.</li>
			<li>10-50 µL DNA çözüm mercek şişe bir mercek çözümde 3 mL ekleyin. İyice karıştırın. Mercek sayaç radyoaktivite ölçmek.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Bu yazıda, yaygın olarak erişilebilir bir metodoloji bioactivated kovalent DNA'ın üretimi kaynaklanan metabolik ara ürün için olmak kimyasallar potens eğitim adducts gösterilmiştir. Bu çok önemli bir konudur, çevresel kimyasallar potens veya enzimatik onların harekete geçirmek için kovalent DNA üreten metabolitleri ilaçların değerlendirilmesi adducts çünkü kanser ve tedavisi, geliştirilmesinde önemli bir alandır. DNA'sı değişikliğe göre kanserojen tümör gelişiminin neden kabul şimdi ka...

Xenobiotics (çevresel kimyasallar veya ilaçlar) metabolizma iki aşama1' oluşur. Evre ı ve II amacı başlangıçta hidrofobik (suda çözünen) bileşikleri daha hidrofilik işlemek için (suda çözünen), böylece bunları kolayca yolu ile idrar, dışkı ya da ter excretable yapma. Aşama ı (functionalization) reaksiyonları içerir oksidasyon, Redüksiyon, ve prokollajen katalize enzimler tarafından sitokrom P450s gibi (P450s, CYPs), peroxidases (i.e., Siklooksijenaz, COX), aldo-keto redüktaz (AKRs) ve mikrozomal monooxygenases (FMOs) flavin içeren. Ayrıca çeşitli redüktaz Yani, mikrozomal NADPH: sitokrom P450 redüktaz (POR) ve sitozolik NAD (P) H:quinone oxidoreductase (NQO1), ksantin oksidaz (XO) ve aldehit oksidaz (AO)1 tarafından aracılı indirgeme reaksiyonu içerir faz . İkinci aşama (fiil), aşamasında bağlanmıştır Fonksiyonel grupların ben polarizasyonu daha da artırmak için küçük polar moleküller eşlenik için kullanılır. Faz II dahil sulfotransferases (SULTs), N, O- acetyltransferases (NAT), methyltransferases Katekol -O- Metiltransferaz (COMT), glutatyon Sgibi tepki katılmak için kabul enzim örnekleri- Transferazlar (GSTs) ve üridin nükleotittir glucuronosyltransferases (UGTs)1. Enzimler aşamasında sınıflandırılması ı ya da II olduğunu, ancak, değil katı ve bazı enzimler tartışmasız her iki kategoride gruplandırılabilir.
P450 enzimleri (AK 1.14.14.1) proteinler mevcut birçok kimyasallar, onların dönüşüm3,4katalizlerler Biyotransformasyon katılmak çeşitli organizmalarda içeren heme vardır. Oksijen ikinci atom formu su ile iki elektron [denklemi (1 gerektirir tepki azalır iken nerede dioxygen bir atom xenobiotics, molekül giriliyor bir tepki ile birçok yüzeylerde prokollajen P450 enzimleri katalizler )]3,4:
RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)
Memeli hücreleri (mikrozomal P450 sistemleri) endoplazmik retikulum membran lokalize P450 enzimleri daha fazla NADPH: sitokrom P450 redüktaz (POR) ve sitokrom b5 içeren multienzyme monooxygenase sistem üyesi olan , NADH: sitokrom b5 alfa redüktaz enzim substrat olarak adlandırdığı. Genel kabul gören bir teori çelişkisiz P450 için gerekli iki elektron verici NADPH/POR sistemidir. Yine de, sitokrom b5 elektron bir donör P450 için yani olarak ikinci azalma, tepki döngüsü sırasında P450 azaltarak elektron bir donör NADH: sitokrom b5 ile birlikte hareket nereye hareket redüktaz2,3,4.
Memeliler çeşitli P450 enzimleri kullanmak (Örneğin, aileler 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 ve 27 enzimler) gibi steroid, değerli endojen bileşiklerin sentezi için ve doğal ürünler2,3 katabolizma için kullanabilirsiniz . Diğer CYP memeli enzimler, gibi insan CYP1A2, 2C 9, 2C 19, 2D 6 ve 3A4, metabolize eksojen kimyasallar, ilaç olarak kullanılır. 5 , 6 ilaçların metabolizması katalizlerler en önemli 3A alt familya, özellikle CYP3A4 CYPs enzimlerdir. Xenobiotics pro-kanserojen ve pro-toxicants, gibi dönüşümleri insan CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 ve 3A42,5tarafından aracılık. Bu CYPs çoğu karaciğer (hariç, CYP1A1 ve 1B1) mevcut. Yine de, CYPs de birkaç extrahepatic organlarda ifade edilir. Böyle P450s büyük önemi, ağırlıklı olarak olabilir katıldığınız zaman onlar bioactivation kimyasallar (ilaçlar) metabolizmasında bu organları7reaktif ara ürün için. Bu durumda mutlaka olmamasına rağmen çeşitli P450s onların yüzeylerde vardır çeşitli bileşikler tarafından indüklenir.
Birçok P450 enzimleri kimyasal (ilaç) toksisite bir rol oynamaktadır. Onlar sadece onların detoksifikasyon metabolitleri xenobiotics dönüştürmek ama aynı zamanda onları Ayrıca genellikle onların toksisite neden farklı biyolojik özellikleri sergilemek endojen oluştururlar değiştirmek reaktif türler için harekete geçirmek. DNA, yağlar ve proteinler onların değişikliğe göre reaktif electrophiles ve aktif kimyasallardan üretilen radikaller için hedef olabilir. DNA söz konusu olduğunda, birkaç önemli gen yanıt ve mekanizmaları çözme zaten bilinen2,3,4,5.
Değişiklikler DNA hücre büyüme denetim azalmasına neden olabilir ve bu fenomen kanserojen süreçleri gelişimine lider baskın faktör olarak kabul edilir. Kimyasallar ile kovalent DNA nesil adducts kanserojen etki gücüne sahip kanserojen başlatma aşamasında en önemli adımlardan biri8,9,10,11işler gibi karar. Bu gösterilmiştir DNA oluşumu arasındaki ilişkileri adducts ve tumorigenesis oluşan, DNA miktarında azalma adducts ise chemoprevention8,9,10için, sorumludur 11 , 12 , 13 , 14. kanserojen/uyuşturucu-türetilmiş oluşumu DNA adducts DNA bireysel üsleri üzerinde bağlıdır ve bu üslerin DNA dizileri tarafından etkilenir. DNA onarım adducts kendi konumunda (kopya etmek veya sigara transkripsiyonu DNA dizisi) ve değiştirilmiş nükleotit dizileri8,11,12,15, türleri üzerinde bağlıdır 16.
Bu makalede, biz DNA değiştirilmiş metabolitleri aktif olması için onların potens araştırmak için (ilaçlar) kimyasal enzim katalize dönüştürme kullanan yordamlarda açıklanır (DNA üreten adducts). Kovalent DNA bağlama için genellikle test bileşik olmalıdır bağlı olarak bireysel uyuşturucu oksidatif veya indirgeyici reaksiyonlar tarafından aktive. Oksidatif veya indirgeyici harekete geçirmek test edilmiş kimyasal bir P450 bağımlı enzim sistemi mikrozomal hücre altı kesir mevcut tarafından aracılık ettiği ya da azaltma redüktaz ile tarafından microsomes (POR, NADH: sitokrom b5 hem de mevcut redüktaz, P450 enzimleri) ve hücresel sitozolik hücre altı fraksiyonları (NQO1, XO, AO, peroksidaz). Reaktif metabolitleri bundan sonra bağlamak DNA'yı oluşturan DNA adducts. İndirgeyici ve oksidatif reaksiyonlar Bu reaktif tür çeşitli ilaçlara etkinleştirmek önemli olduğundan, yükseltgeme-indirgeme enzimatik sistemi istihdam deneysel yordamlar açıklanmıştır. Ayrıca, adducts algılama ve bu DNA miktarının yeteneğine uygun yöntemleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Test kimyasal enzim sistemleri tarafından aktif olup olmadığını belirlemek için iki bağımsız yordam DNA'ya bağlı tavsiye edilir: 32P postlabeling tekniği ve radyoaktif etiketli kullanarak bileşik (e.g., 3H ya da 14 C). İlk pilot, 32P postlabeling tahlil eleme önerilir. DNA içeriği tam olarak değerlendirilir, çözümlerinde belirlenmesi her iki yöntem önce gelmesi gerekir.
Radyoaktif olmayan kimyasallar (kanserojen/ilaç) 3´-phosphodeoxynucleosides, 5´-radyoaktif fosfor (32P) ile ek fosforilasyon tarafından değiştirilmiş DNA'ın enzimatik hidroliz 32P postlabeling tekniği kullanır OH pozisyon ve kimyasal-deoxynucleotide ayrılması adducts normal (değiştirilmemiş) deoxynucleotides Kromatografi17 tarafından (şekil 1). Kimyasal bileşik tarafından değiştirilmiş DNA tarafından endonükleaz, micrococcal nükleaz ve dalak fosfodiesteraz bilinen eksonükleaz aktivitesi, hidrolize. Hem normal (değiştirilmemiş) içeren ve 3´-monophosphates [γ -32P] ATP pH 9,5 formu 5´- için taşıyıcı (radyoaktif olmayan) ATP ve T4-polinükleotit kinaz huzurunda ile tepki deoxyribonucleoside değiştiren hidrolize DNA karışımı 32P etiketli 3´, 5´-bisphosphates ( şekil 1' deki "Standart" bir prosedür). Kullanılan alkali pH deoxyribonucleoside 3´-monophosphates konumu 3´, dephosphorylate T4-polinükleotit kinaz enzim aktivitesinin en aza indirerek yeteneğine sahiptir. Ayrılık ve çözünürlük 32P olarak etiketlenmiş üzerinden adducts kimyasallar tarafından değiştirilmiyor etiketli deoxynucleotides gerçekleştirilir tarafından çok yönlü anyon-Satım ince tabaka Kromatografi (TLC) polyethyleneimine (PEI) Selüloz (Resim 2 ). (Yönde, D1 ve D2) birinci ve ikinci elüsyon adım etiketli normal (değiştirilmemiş) deoxynucleotides yanı sıra [32P] fosfat başlar, elektrolit kısa bir parçası üzerine su çözümleri kullanarak TLC-PEI-selüloz plaka eluted Kromatografik kağıt hidrofobik özellikleri (kanserojen/uyuşturucu-adducts) sergilenmesi ilişkili kimyasallar içeren deoxynucleotides Ayrıca çözülmesi için PEI-selüloz plaka başlangıcında korunur, ancak TLC plaka üstüne uygulanan birkaç farklı solvent sistemleri ile D3 ve D4 yönde (Şekil 2). Yerelleştirme adducts gelişmiş ekran autoradiography; kullanılarak yapılır ayrılmış adducts röntgen filmleri karanlık tanınabilir noktalar olarak algılanır. Noktalar alanlarında plaka eksize ve radyoaktivite ölçmek için sıvı mercek veya sayma Cerenkov tarafından kullanılır. Harita ve DNA ölçmek için adapte edilmiş yöntemi Imaging bir depolama fosfor tespit chromatograms adducts tarafından 32P postlabeling tahlil şimdi de kullanılır. 18 anlık görüntüleyici makine sık sık böyle algılaması için kullanılmaktadır ve miktar DNA'ın adducts. Bu yöntem daha autoradiography19ekran tekniği gelişmiş 32P algılamak için daha--dan 10 - kat daha yüksek hassasiyet sağlar.
DNA miktarda adducts göreli değerleri denklem (2) aşağıdaki gibi kullanarak hesaplanan (RAL), etiketleme adduct gibi belirlenir:
BGBM. Buna deoxynucleotides Sigara RAL =---(2) 32P-ATP belirli aktivite (BGBM. / pmol) x pmol deoxynucleotides
RALs adducted deoxynucleotides sayısı oranları oranı toplam [adducted ve normal (değiştirilmemiş) deoxynucleotides] saymak oranları değerleri deoxynucleotides20,21. Ancak, bu hesaplama eşittir üzerinde temel verimliliği etiketleme adducts ve normal deoxynucleotides22. Çeşitli DNA adducts için klasik ("Standart") 32P postlabeling tekniği uygun bir uygulamadır (hantal ve/veya hantal adducts), ancak, hassasiyeti tatmin edici değil algılamak için düşük miktarlarda bulunan DNA adducts. Bu yordamı kullanarak, bir adduct 10 değiştirilmemiş7 deoxynucleotides DNA (0.3 fmol adduct/µg DNA) içinde tespit miktarıdır.
Bu klasik 32P postlabeling yordam değişiklikleri çeşitli teknik duyarlılığını yükseltmek için kullanılan. En çok 10-100 kat daha yüksek hassasiyet belirlenmesi, adducts 32P etiketleme elde etti [γ -32P] ATP (yoğunlaşması yordam) sınırlayıcı Düzeyler'i kullanarak. 23 , 24 32P postlabeling yöntemi duyarlılık artışı sindirilir DNA içeren bir kuluçka kullanır sağlayan başka bir yordam nükleaz P1 (dan Penicillium citrinum)21 (şekil 1) ile adducts. Deoxynucleotides ile ilişkili kimyasallar (adducted nukleotid) aslında değil yüzeylerde Bu enzim ise bu enzim değiştirilmemiş deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, dephosphorylate tercih ediyor. Bu nedenle, dephosphorylated deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (örneğin, deoxyribonucleosides) T4-polinükleotit kinaz tarafından [32P] fosfat γ -32P tarafından fosforile değil] ATP. Ancak, bazı kimyasallar nerede nükleotit (adducted deoxynucleotides) bağlı, arylamine adducts gibi deoxyguanosine, can bedephosphorylated Bu enzim tarafından C8, yerine. Buna ek olarak, çoğu diğer adducts (örneğin, adducts N2 deoxyguanosine yerine) nükleaz P1 tarafından dephosphorylated değil. Bu değişiklik 32P postlabeling bu yöntem çok daha hassas, duyarlı üçten fazla büyüklük artan getirir. Ayrıca, 32P postlabeling bu sürümü için bir yöntem sağlar nerede daha yüksek miktarda DNA (5-10 µg) ve taşıyıcı-Alerjik bir fazlalığı [γ - 32P] ATP kullanılan.
Zenginleştirmek için başka bir yöntem adducts, Gupta25tarafından açıklanan, fizikokimyasal kullanır özelliklerinin hantal deoxynucleotide adducts, hangi-ebilmek var olmak hulâsa n-butanol faz transfer Ajan tetrabutylammonium varlığında değiştirilmemiş deoxynucleotides kötü bu organik çözücü tarafından ayıklanır ise [32P] fosfat, etiketleme önce klorür (TBA) (şekil 1). Ancak, daha az hidrofobik adducts, oluşan deoxynucleotides örneği ile aromatik olmayan hantal moieties ya da küçük alkil artıkları, değişiklik için değil etkili çıkarılan nile-butanol. Bu nedenle, onlar ne zaman 32P postlabeling yöntemi bu değişikliğe göre analiz edilir aslında belirlenemeyen vardır.
Hem daha önce bahsedilen sürümleri 32P postlabeling artış duyarlılık ve miktar DNA'ın adducts son derece (üç büyüklük kadar), 109,10 başına normal sigara bir tespit edememek nükleotit (0.3 - 3 Ekrem/µg DNA). Bu iki yöntem kimyasallar kovalent DNA'yı bağlamak onların verimlilik için test etmek için tavsiye edilir ve bu nedenle, bu iş ayrıntılarda açıklanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Roth</td><td>0032.8</td><td></td></tr><tr><td>Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol</td><td>Roth</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Penta</td><td>70390-11000</td><td></td></tr><tr><td>Calf thymus DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4522</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>NADP&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5755</td><td></td></tr><tr><td>NADPH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7505</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose 6-phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647001</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose 6-phosphate dehydrogenase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6378</td><td></td></tr><tr><td>Supersomes</td><td>Corning Gentest</td><td>456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202</td><td></td></tr><tr><td>Human liver microsomes</td><td>Corning Gentest</td><td>452172</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77662</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxypyrimidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H56800</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437549</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179272</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal nuclease from &lt;em&gt;Staphylococcus aureus&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II</td><td>Calbiochem</td><td>524711</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease P1 from &lt;em&gt;Penicillium citrinum&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8630</td><td></td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>163791</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Tetrabutylammonium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86870</td><td></td></tr><tr><td>n-Butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437603</td><td></td></tr><tr><td>T4-polynucleotide kinase</td><td>USB Corp</td><td>70031Y</td><td></td></tr><tr><td>[&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]ATP</td><td>Hartman Analytic GmbH</td><td>FP-201</td><td></td></tr><tr><td>PEI-impregnated cellulose TLC plates</td><td>Macherey-Nagel</td><td>801053</td><td></td></tr><tr><td>Packard Instant Imager A202400</td><td>Packard</td><td>G120337</td><td></td></tr><tr><td>Ellipticine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>285730</td><td></td></tr><tr><td>3-Nitrobenzanthrone</td><td>prepared (synthesized) as shown in ref. 40</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

formation of covalent dna adducts by enzymatically activated carcinogens and drugs in vitro and their determination by 32p-postlabeling

Kovalent DNA adducts kimyasallar tarafından kurulan veya uyuşturucu kanserojen etki gücü ile kanserojen işlemleri başlatma aşamasında en önemli faktörlerden biri değerlendirilecektir. Tumorigenesis nedeni olarak kabul edilir, bu kovalent bağlama şimdi kimyasal karsinojenezis merkezi bir dogma olarak değerlendirilir. Burada, sitokrom P450 tarafından katalize reaksiyonlar istihdam yöntemleri açıklanmıştır ve ek Biyotransformasyon enzimler kimyasal madde veya ilaç metabolitleri bu DNA şekillendirme için onların harekete geçirmek için potens araştırmak için adducts. Hücresel kesirler Biyotransformasyon enzimler (mikrozomal ve sitozolik örnekleri ile cytochromes P450 ya da diğer Biyotransformasyon enzimler, Yani, peroxidases, NADPH: sitokrom P450 sahip yalıtım açıklayan yordamlar sunulmaktadır oxidoreductase, NAD (P) H:quinone oxidoreductase veya ksantin oksidaz). Ayrıca, yöntem açıklanmıştır kullanılabilir analiz kimyasallar metabolik aktivasyonu için bu enzimler DNA izolasyonu için hem de. Ayrıca, algılama ve kimya/ilaç-elde edilen DNA miktarının yeteneğine uygun yöntemleri adducts, Yani, 32P postlabeling tekniğinin farklı değişiklikler ve radyoaktif etiketli istihdam kimyasal analiz, vardır ayrıntılı olarak gösterilmiştir.

Kimyasal maddeler (kanserojen/ilaçlar) potens onların kovalent sonuçlanan ara ürün için metabolize araştırmak için harekete geçirmek enzim katalize (Yani, P450, peroksidaz, redüktaz) kullanımı için burada açıklanan protokolleri kullanarak DNA için bağlama (DNA nesil adducts), antikanser Ajan ellipticine farmakolojik eylem (için bir daha gözden geçirme gördüğünüz gibi29,30,<sup class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling at JoVE.com

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Kovalent DNA oluşumu enzimatik aktif kanserojen ve uyuşturucu Vitro ve kararlılıklarını 32P-postlabeling tarafından Adducts

Çevresel kimyasallar ve ilaçlar enzimatik bioactivated kovalent DNA oluşturma ara ürün için adducts, olmak, potens değerlendirilmesi, kanser ve tedavisi geliştirilmesinde önemli bir alandır. Yöntemleri teknikleri onların algılama ve miktar yanı sıra DNA adducts forma bileşik harekete geçirmek için açıklanmıştır.

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

formation-covalent-dna-adducts-enzymatically-activated-carcinogens

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

13.8K Görüntüleme.  Charles University. Çevresel kimyasallar ve ilaçlar enzimatik bioactivated kovalent DNA oluşturma ara ürün için adducts, olmak, potens değerlendirilmesi, kanser ve tedavisi geliştirilmesinde önemli bir alandır. Yöntemleri teknikleri onların algılama ve miktar yanı sıra DNA adducts forma bileşik harekete geçirmek için açıklanmıştır.

Video: Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological processes. This subject embraces diverse scientific areas, spanning from physical, biological and bioorganic chemistry to biology and medicine, with applications to the amelioration of quality of life, health and aging. Multidisciplinary skills are required for the full investigation of the many facets of radical processes in the biological environment and chemical knowledge plays a crucial role in unveiling basic processes and mechanisms. We developed a chemical biology approach able to connect free radical chemical reactivity with biological processes, providing information on the mechanistic pathways and products. The core of this approach is the design of biomimetic models to study biomolecule behavior (lipids, nucleic acids and proteins) in aqueous systems, obtaining insights of the reaction pathways as well as building up molecular libraries of the free radical reaction products. This context can be successfully used for biomarker discovery and examples are provided with two classes of compounds: mono-trans isomers of cholesteryl esters, which are synthesized and used as references for detection in human plasma, and purine 5',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides, prepared and used as reference in the protocol for detection of such lesions in DNA samples, after ionizing radiations or obtained from different health conditions.

Radical-based biomimetic chemistry has been applied to building-up libraries necessary for biomarker development.

Kimyasal Biyoloji Serbest Radikaller: Kimyasal Davranış den Biyomarker Kalkınma

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

Kimya

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Genetik

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted mechanism of metabolic activation involves formation of &#945;-hydroxynitrosamines that spontaneously decompose to DNA alkylating agents. Accumulation of DNA damage and the resulting mutations can ultimately lead to cancer. New evidence indicates that &#945;-hydroxynitrosamines can be further oxidized to nitrosamides processively by cytochrome P450s. Because nitrosamides are generally more stable than &#945;-hydroxynitrosamines and can also alkylate DNA, nitrosamides may play a role in carcinogenesis. In this report, we describe a general protocol for evaluating nitrosamide production from in vitro cytochrome P450-catalyzed metabolism of nitrosamines. This protocol utilizes a general approach to the synthesis of the relevant nitrosamides and an in vitro cytochrome P450 metabolism assay using liquid chromatography-nanospray ionization-high resolution tandem mass spectrometry for detection. This method detected N&#8242;-nitrosonorcotinine as a minor metabolite of N&#8242;-nitrosonornicotine in the example study. The method has high sensitivity and selectively due to accurate mass detection. Application of this method to a wide variety of nitrosamine-cytochrome P450 systems will help determine the generality of this transformation. Because cytochrome P450s are polymorphic and vary in activity, a better understanding of nitrosamide formation could aid in individual cancer risk assessment.

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

&#945;-hydroxylation of carcinogenic nitrosamines by cytochrome P450s is the accepted metabolic pathway that produces DNA-damaging intermediates, which cause mutations. However, new data indicates further oxidation to nitrosamides can occur. We describe a general method for detecting nitrosamides produced from in vitro cytochrome P450-catalyzed metabolism of nitrosamines.

Nitrosamide oluşumu nitrozaminler sitokrom P450s tarafından in Vitro metabolizma saptamak için bir genel yöntem

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

Kanser Araştırmaları

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer therapies, such as radio- and chemotherapy, introduce enormous amount of additional DNA damage, leading to cell cycle arrest and apoptosis to limit cancer progression. Quantitative assessment of DNA damage during experimental cancer therapy is a key step to justify the effectiveness of a genotoxic agent. In this study, we focus on a single cell electrophoresis assay, also known as the comet assay, which can quantify single and double-strand DNA breaks in vitro. The comet assay is a DNA damage quantification method that is efficient and easy to perform, and has low time/budget demands and high reproducibility. Here, we highlight the utility of the comet assay for a preclinical study by evaluating the genotoxic effect of olaparib/temozolomide combination therapy to U251 glioma cells.

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

The comet assay is an efficient method to detect DNA damage including single and double-stranded DNA breaks. We describe alkaline and neutral comet assays to measure DNA damage in cancer cells to evaluate the therapeutic effect of chemotherapy.

Vitro DNA hasarı kuyruklu yıldız tahlil kullanarak değerlendirmek

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular machines centers on devices capable of directional motion, i.e. molecular motors, and on their scaled-down mechanical parts (wheels, axels, pendants etc) 7-9. This imitates the macro-machines, even though the physical properties essential for these devices, such as inertia and momentum conservation, are not usable in the nanoworld environments 10. Alternative designs, which do not follow the mechanical macromachines schemes and use mechanisms developed in the evolution of biological molecules, can take advantage of the specific conditions of the nanoworld. Besides, adapting actual biological molecules for the purposes of nano-design reduces potential dangers the nanotechnology products may pose. Here we demonstrate the assembly and application of one such bio-enabled construct, a semi-artificial molecular device which combines a naturally-occurring molecular machine with artificial components. From the enzymology point of view, our construct is a designer fluorescent enzyme-substrate complex put together to perform a specific useful function. This assembly is by definition a molecular machine, as it contains one 12. Yet, its integration with the engineered part - fluorescent dual hairpin - re-directs it to a new task of labeling DNA damage12.
Our construct assembles out of a 32-mer DNA and an enzyme vaccinia topoisomerase I (VACC TOPO). The machine then uses its own material to fabricate two fluorescently labeled detector units (Figure 1). One of the units (green fluorescence) carries VACC TOPO covalently attached to its 3'end and another unit (red fluorescence) is a free hairpin with a terminal 3'OH. The units are short-lived and quickly reassemble back into the original construct, which subsequently recleaves. In the absence of DNA breaks these two units continuously separate and religate in a cyclic manner. In tissue sections with DNA damage, the topoisomerase-carrying detector unit selectively attaches to blunt-ended DNA breaks with 5'OH (DNase II-type breaks)11,12, fluorescently labeling them. The second, enzyme-free hairpin formed after oligonucleotide cleavage, will ligate to a 5'PO4 blunt-ended break (DNase I-type breaks)11,12, if T4 DNA ligase is present in the solution 13,14 . When T4 DNA ligase is added to a tissue section or a solution containing DNA with 5'PO4 blunt-ended breaks, the ligase reacts with 5'PO4 DNA ends, forming semi-stable enzyme-DNA complexes. The blunt ended hairpins will interact with these complexes releasing ligase and covalently linking hairpins to DNA, thus labeling 5'PO4 blunt-ended DNA breaks.
This development exemplifies a new practical approach to the design of molecular machines and provides a useful sensor for detection of apoptosis and DNA damage in fixed cells and tissues.

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

We demonstrate the assembly and application of a molecular-scale device powered by a topoisomerase protein. The construct is a bio-molecular sensor which labels two major types of DNA breaks in tissue sections by attaching two different fluorophores to their ends.

Yarı yapay Moleküler Makine ve Kullanımı DNA Hasar Tespiti için in vitro Meclisi

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Biyomühendislik

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in mammalian cell lines. Rather than globally assaying removal of xenobiotic-induced or spontaneous chromosomal DPC removal, this assay examines the repair of a homogeneous, chemically defined lesion specifically introduced at one site within a plasmid DNA substrate. Importantly, this approach avoids the use of radioactive materials and is not dependent on expensive or highly-specialized technology. Instead, it relies on standard recombinant DNA procedures and widely available real-time, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) instrumentation. Given the inherent flexibility of the strategy utilized, the size of the crosslinked protein, as well as the nature of the chemical linkage and the precise DNA sequence context of the attachment site can be varied to address the respective contributions of these parameters to the overall efficiency of DPC repair. Using this method, plasmids containing a site-specific DPC were transfected into cells and low molecular weight DNA recovered at various times post-transfection. Recovered DNA is then subjected to strand-specific primer extension (SSPE) using a primer complementary to the damaged strand of the plasmid. Since the DPC lesion blocks Taq DNA polymerase, the ratio of repaired to un-repaired DNA can be quantitatively assessed using qPCR. Cycle threshold (CT) values are used to calculate percent repair at various time points in the respective cell lines. This SSPE-qPCR method can also be used to quantitatively assess the repair kinetics of any DNA adduct that blocks Taq polymerase.

The goal of this protocol is to quantify the repair of defined DNA-protein crosslinks on plasmid DNA. Lesioned plasmids are transfected into recipient mammalian cell lines and low-molecular weight harvested at multiple time points post-transfection. DNA repair kinetics are quantified using strand-specific primer extension followed by qPCR.

Ölçü birimi üzerinde plazmid DNA-protein Glossar tamiri için basit, hızlı ve nicel tahlil memeli hücre içine Transfected

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Her Yerde Bulunan, SUMOile Edilmiş ve ADP-Ribosile Edilmiş DNA-Protein Çapraz Bağlarının Ölçülmesi

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

Yazar Spotlight: DNA Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Biyokimya

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are electrophilic, generate reactive electrophiles upon biotransformation, or induce oxidative stress. Among the oxidized nucleobases, the most studied one is 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) or 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), a biomarker of oxidatively induced base damage in DNA. Aldehydes and epoxyaldehydes resulting from the lipid peroxidation process are electrophilic molecules able to form mutagenic exocyclic DNA adducts, such as the etheno adducts 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-&#949;dGuo) and 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-&#949;dAdo), which have been suggested as potential biomarkers in the pathophysiology of inflammation. Selective and sensitive methods for their quantification in DNA are necessary for the development of preventive strategies to slow down cell mutation rates and chronic disease development (e.g., cancer, neurodegenerative diseases). Among the sensitive methods available for their detection (high performance liquid chromatography coupled to electrochemical or tandem mass spectrometry detectors, comet assay, immunoassays, 32P-postlabeling), the most selective are those based on high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). Selectivity is an essential advantage when analyzing complex biological samples and HPLC-ESI-MS/MS evolved as the gold standard for quantification of modified nucleosides in biological matrices, such as DNA, urine, plasma and saliva. The use of isotopically labeled internal standards adds the advantage of corrections for molecule losses during the DNA hydrolysis and analyte enrichment steps, as well as for differences of the analyte ionization between samples. It also aids in the identification of the correct chromatographic peak when more than one peak is present.
We present here validated sensitive, accurate and precise HPLC-ESI-MS/MS methods that were successfully applied for the quantification of 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo and 1,N2-dGuo in lung, liver and kidney DNA of A/J mice for the assessment of the effects of ambient PM2.5 exposure.

We describe here methods for sensitive and accurate quantification of the lesions 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) and 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. The methods were applied to the assessment of the effects of ambient fine particulate matter (PM2.5) in tissues (lung, liver and kidney) of exposed A/J mice.

Kovalent DNA oluşumu enzimatik aktif kanserojen ve uyuşturucu Vitro ve kararlılıklarını ³²P-postlabeling tarafından Adducts

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kimyasal Biyoloji Serbest Radikaller: Kimyasal Davranış den Biyomarker Kalkınma

Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi

Nitrosamide oluşumu nitrozaminler sitokrom P450s tarafından in Vitro metabolizma saptamak için bir genel yöntem

Vitro DNA hasarı kuyruklu yıldız tahlil kullanarak değerlendirmek

Yarı yapay Moleküler Makine ve Kullanımı DNA Hasar Tespiti için in vitro Meclisi

Ölçü birimi üzerinde plazmid DNA-protein Glossar tamiri için basit, hızlı ve nicel tahlil memeli hücre içine Transfected

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

Kütle spektrometresi ile üç DNA lezyonlarının ölçülmesi ve ortam Ince partikül madde maruz fareler dokularda düzeylerinin değerlendirilmesi