Name: evaluating in vitro dna damage using comet assay
Uploaded: 2017-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay at JoVE.com

Bu araştırma NIH, ncı ve CCR Intramural araştırma programı tarafından desteklenmiştir. Tüm yazarlar NIH, ncı ve CCR Intramural araştırma bursu aldı.

1. hazırlamak reaktifler <ol><li>1 x PBS <ol><li>seyreltik 100 mL 10 x PBS 900 mL dH 2 O ile ve pH 7.4 pH metre kullanarak için ayarlayın. Mağaza oda sıcaklığında.</li>
	</ol></li> <li>Lizis çözüm (LS) <ol><li>2.5 M NaCl, 100 mM disodyum EDTA, 10 mM Tris Bankası ve 900 mL dH 2 O 200 mM NaOH hazırlamak; genellikle tamamen erimesi karışım izin verin için yaklaşık 20 dakika sürer. PH pH metre kullanarak 10 için ayarlayın. % 1 sodyum loril sarcosinate ve % 1 eklemek Triton X-100 ve son ses seviyesini 1000 ml. 4 ° c için kullanmadan önce en az 30 dk serin.</li>
	</ol></li> <li>Alkali Elektroforez çözüm (AES), pH &#62; 13 <ol><li>200 mM NaOH ve 1 mM disodyum EDTA 800 mL dH 2 O. ayarlama pH hazırlamak ve pH olduğundan emin olun &#62; 13. 1000 ml nihai ses düzeyini ayarlayın. Kullanmadan önce taze olun ve serin 4 ° c kullanmadan önce en az 30 dk için.</li>
	</ol></li> <li>Tarafsız Elektroforez sollution (NES) <ol><li>hazırlamak 1000 mL tarafsız Elektroforez arabellek 100 mM Tris Bankası ve 300 mM sodyum asetat 1000 mL dH 2 O. ayarlama 9.0 için pH buzul Asetik asit ile karıştırma tarafından. 4 ° c için kullanmadan önce en az 30 dk serin.</li>
	</ol></li> <li>DNA yağış çözüm (DPS) <ol><li>10 mL 7,5 M amonyum asetat stok hazırlanması. 50 mL için DNA yağış çözeltisi, 6.7 mL 7,5 M amonyum asetat 43.3 mL % 95 etanol ile karıştırın. Mağaza oda sıcaklığında.</li>
	</ol></li> <li>Staining çözüm <ol><li>ekleyin 1 µL 10.000 yeşil flüoresan nükleik asit leke (örneğin, SYBR yeşil) 30 mL Tris-EDTA arabellek (10 mM Tris-HCl, 1 mM disodyum EDTA, pH 7,4) ve store x 4 ° C. koru dan ışık.</li>
	</ol></li> <li>Özel %1 düşük erime <ol><li>% 1 düşük erime noktası özel (100 mL dH 2 O 1 g) bir mikrodalga eritebilir. Özel özel tamamen erimiş olduğundan emin olmak için her 15-20 s girdap. 37 ° C su banyosu için en az 20 dk kullanmadan önce özel yerleştirin.</li>
	</ol></li> <li>Önceden sıcak pipet ipuçları <ol><li>P200 pipet ipuçları dar uçları 3 mm ve 37 ° c sıcak özel pipetting önce kekemelik.</li>
	</ol></li></ol> 2. Kuyruklu yıldız slaytlar hazırlayın <ol><li><ol><li>Melt % 1'özel (100 mL dH 2 O 1 g) 2-3 dk ya da özel tamamen erimiş olana bir mikrodalga kaplama kaydırın. Cam mikroskop slaytlar özel içine daldırma ve hav bırakmayan mendil kullanarak slayt bir tarafı yok.</li>
		<li>Slaytlar kuruması veya daha hızlı kurutma için 50 ° c ısı için düz bir yüzey üzerinde yatıyordu; şeffaf özel film kurutma sonra oluşmuş olmalıdır. Kaplamalı slaytlar 37 ° C kullanmadan önce yerleştirin.</li>
	</ol></li> <li>Tek hücre süspansiyonlar hazırlanması <ol><li>kültür ve tedavi gliyom hücre <ol><li>10 ile desteklenmiş DMEM-Ham F-12 orta U251 MG hücrelerde kültür % FBS, 100 U/mL penisilin ve 10 µg/mL streptomisin, 37 ve # 176; C % 5 CO 2.</li>
			<li>1 mL tripsin 3 dakikadır kullanarak hücreleri sindirmek ve tripsin FBS ile DMEM-Ham F-12 orta kullanarak etkisiz hale getirin. Toplamak 300 x g 4 dk de 15 mL tüp, spin, orta Aspire edin ve 2 x 10 5 hücre/mL 1 x PBS hücreleri askıya alma. 
			Not: Hücre örnek hemen tahlil başlamadan önce hazırlanmalı ve tüm örneklerini ortamda ışık DNA hasarları önlemek için bir koyu veya soluk işleneceğini.</li>
			<li>1:10 (v/v) oranında (37 ° C'de) %1 erimiş düşük erime noktası özel hücre süspansiyon birleştirin, karışımı yavaşça yukarı ve aşağı pipetting ve hemen bir slayda 30 µL pipet. Tarafını kullanıyorsunuz pipet ucu ince bir tabaka oluşumu sağlamak için özel/hücre karışımı spread.</li>
			<li>10 dk. 30 dk jelleşme zaman artan yüksek nem içeren ortamlardan örneklerin yapışma geliştirir düz 4 ° C'de karanlık slayt yer.</li>
			<li>4 ° c LS içinde belgili tanımlık karanlık bir gecede 1 h için slayt bırakın.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 3. Tek hücre Elektroforez <ol><li>devam et alkalin (Adım 3.2) veya nötr (Adım 3.3) kuyruklu yıldız tahlil</li> <li>alkali kuyruklu yıldız tahlil için <ol><li>yavaşça slaytlar LS kaynağından çıkarın, aşırı arabellek drenaj ve yavaşça AES içinde 4'te 1 h için bırakın ° C DNA gevşemek izin vermek için. Slaytları karanlıkta bırakın.</li>
		<li>Ekle önceden soğutulmuş AES, Elektroforez slayt tepsisine (Bu Elektroforez birim boyutuna bağlıdır) slaytlar yukarıda 0.5 cm fazla, slaytlar içinde ve bir kap ile kapak yerleştirin. 1 V/cm (uzunluk elektrot arasındaki) güç Besleme gerilimi ayarlamak ve çalıştırmak için 30 dk 4'te ° C.</li>
		<li>Drenaj aşırı Elektroforez çözüm slayttan. DH 2 O oda sıcaklığında her 5 min için iki kez slaytları yavaşça bırakın.</li>
		<li>% 70 etanol oda sıcaklığında 5 min için slaytları yavaşça bırakın. Adım 4'e devam.</li>
	</ol></li> <li>Tarafsız kuyruklu yıldız tahlil için <ol><li>yavaşça slaytları LS kaynağından çıkarın, aşırı arabellek drenaj ve yavaşça NES içinde 4'te 30 dk için bırakın ° C. Keep slayt karanlıkta.</li>
		<li>Ekle önceden soğutulmuş tarafsız Elektroforez arabellek Elektroforez slayt tepsisinde (Bu Elektroforez birim boyutuna bağlıdır) slaytlar yukarıda 0.5 cm fazla, slaytlar içinde ve bir kap ile kapak yerleştirin. 1 V/cm (uzunluk elektrot arasındaki) güç Besleme gerilimi ayarlamak ve çalıştırmak için 45 dk 4'te ° C.</li>
		<li>Drenaj slaytları aşırı arabelleğinden. Yavaşça DPS slaytları, oda sıcaklığında 30 dakika bırakın.</li>
		<li>% 70 etanol, oda sıcaklığında 30 dk için slaytları yavaşça bırakın. Adım 4'e devam.</li>
	</ol></li></ol> 4. Kuyruklu yıldız slaytlar leke <ol><li>kuru slaytlar için 10-15 dk içinde belgili tanımlık karanlık 37 ° C'de.</li>
	<li>Yer 50-100 µL yeşil flüoresan nükleik asit çözüm her boyama kurutulmuş özel ve 15 dakika içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında leke.</li>
	<li>Slaytları kısaca dH 2 içinde O durulayın ve tamamen 37 ° C'de karanlık kuru. Resim alma ve analiz için devam.</li>
</ol> 5. Görüntü toplama ve analizi Not: görselleştirme ve miktar olan DNA epifluorescence mikroskobu ve kuyruklu yıldız tahlil yazılım dayalı (Tablo malzemeleri görmek) 12 .
<ol><li>Yer slaytları bir slayt tutucu mikroskopla üstünde. Özel jel objektif lens dönük olduğundan emin olun. Rastgele bir floresan mikroskop ile 10 x objektif lens kullanarak lekeli kuyruklu yıldız slaytlardan çekim. Kenarları ve herhangi bir hava kabarcıkları çevresinde kaçının.</li>
	<li>Emin olun her kuyruklu yıldız kuyruk yatay olarak dağıtılır. Kuyruklu yıldız kafaları köken sol ve sağ kuyruk.</li>
	<li>Her resim parlak DNA leke ve koyu arka plan ile ikili bir TIF biçiminde kaydedin. Yüklemek için yazılım kullanarak görüntüleri &#34; seçin dosyaları analiz etmek için &#34; araç çubuğunun solunda bulunan düğme. ( şekil 1) bir görüntü görünüm pencere belirmelidir.</li>
	<li>Ölçüm çerçevesi ekrana çizdiğiniz ve boyutuna uygun olarak hücre kuyruklu yıldız ayarlayın. ' I tıklatın &#34; ayarla &#34; baş, kuyruklu yıldız ve kuyruk görüntü göre eşik ayarlamak için düğme, o zaman tıkırtı &#34; başlatmak ölçümleri &#34; düğmesini ( şekil 1).</li>
	<li>Çerçeve kullanarak bir hücre seçin ve fare ile tıklayarak ölçüm harekete geçirmek &#34; kuyrukluyıldız tahlil &#34; düğme; bir yoğunluk görüntü üzerinde gösterir &#34; profiller &#34; penceresi seçili ölçüm parametreleri ile. Sonuçlar'ı tıklatarak kaydedilebilmesi için &#34; sonucu depolamak &#34; düğmesini ( şekil 1). 
	Not: Yazılım kuyruklu yıldız kuyruk, kuyruklu DNA, kuyruk moment (TM) ve zeytin kuyruk an (OTM) yüzdesi dahil parametreleri hesaplar. Kuyruk anlar formüller tarafından takip hesaplanır: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56450/56450eq1.jpg" /> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56450/56450eq2.jpg" /></li> <li>en az 50 hücreleri analiz tedavi başına.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Tice, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+gel/comet+assay:+guidelines+for+in+vitro+and+in+vivo+genetic+toxicology+testing.">Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.</a> Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).</li><li>Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxicity+in+lead+treated+human+lymphocytes+evaluated+by+micronucleus+and+comet+assays.">Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays.</a> Indian J Exp Biol. 54 (8), 502-508 (2016).</li><li>Azqueta, A., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+comet+assay:+a+comprehensive+guide+to+measuring+DNA+damage+and+repair.">The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair.</a> Arch Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).</li><li>Goldstein, M., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+implications+for+tumor+responses+to+radiation+and+chemotherapy.">The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy.</a> Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).</li><li>Gavande, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+targeted+therapy:+The+past+or+future+of+cancer+treatment?.">DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment?.</a> Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).</li><li>Torgovnick, A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+mechanisms+in+cancer+development+and+therapy.">DNA repair mechanisms in cancer development and therapy.</a> Front Genet. 6, 157 (2015).</li><li>Weston, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PARP+inhibitor+olaparib+induces+significant+killing+of+ATM-deficient+lymphoid+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo.">The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo.</a> Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).</li><li>Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+Repair+in+Cancer:+Beyond+PARP+Inhibitors.">Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors.</a> Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensitivity+of+IDH1-Mutated+Gliomas+Due+to+an+Impairment+in+PARP1-Mediated+DNA+Repair.">Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair.</a> Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).</li><li>Konca, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+public+domain+PC+image-analysis+program+for+the+comet+assay.">A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay.</a> Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).</li><li>Valverde, M., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+and+occupational+biomonitoring+using+the+Comet+assay.">Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay.</a> Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).</li><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair:+principles,+applications,+and+limitations.">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li><li>Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+high-throughput+processing+of+slides+for+the+comet+assay.">Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay.</a> Sci Rep. 4, 7200 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Kuyruklu yıldız tahlil tek ve iki iplikçikli DNA sonları hücresel düzeyde ölçmek için etkili bir araçtır. Tahlil yaygın olarak13genotoxicity ve biomonitoring ile ilgili olarak, temel lezyonlar, DNA Glossar, ilaç geliştirme ve alkali hassas siteler arasında değişen çalışmalarda "altın standart" olarak uygulanmıştır. Bu da çalışmanın, sırasıyla alkali ve tarafsız kuyruklu yıldız deneyleri, iki ayrı adım adım protokollerde gösterdik. Tek hücre Elektroforez, floresan mikroskopi ve görüntü yorumu birleştiren, her iki alkali ve tarafsız kuyruklu yıldız deneyleri DNA ölçüde değerlendirmek için kantitatif yaklaşımlar vitrozarar sağlar.
Birkaç temel adımı kuyruklu yıldız tahlil başarılı yürütülmesi için gereklidir. Örneğin, reaktif hazırlık adımda özen gösterilmelidir. Her çözüm taze hazırlanmış olmalı ve en az 30 dk kullanmadan, endojen DNA hasarı önlemek veya numune hazırlama sırasında onarım için uygun sıcaklıkta tutulur. Başka bir önemli adımdır uygun tek hücre süspansiyon hazırlanması. Özel kullanımdan hücre survival kuyruklu yıldız slaytların hazırlanması sırasında en üst düzeye çıkarmak için önce 37 ° C'de tutmak önemlidir. Hücre/özel süspansiyon hemen tahlil başlamadan önce hazırlanmalıdır. Böylece hücrelerin çoğu aynı odak düzlemi mikroskobu sırasında yerleştirilebilir pipet ipuçları yan cep/özel süspansiyon yaymak için kullandığı özel slaytlar üzerinde ince bir tabaka elde etmek için yardımcı olur. İsteğe bağlı olarak, özel eki geliştirmek için bir elmas uçlu kalem kullanarak slaytları kenarlarını kaşı.
Kuyruklu yıldız tahlil avantajları rağmen bu geleneksel yöntem14,15bazı sınırlamaları vardır. Örneğin, akış verimi, kuyruklu yıldız tahlil cam slayt hazırlama işlemi tarafından sınırlıdır. Bazı durumlarda, bir sekiz benzetti cam slayt tahlil üretilen işi artırmak için bir çözüm sağlar. Kuyruklu yıldız tahlil sadece hücrelerdeki parçalanmış DNA oranını temsil eden başka bir kısıtlamadır. Hücresel değişikliklerin yanı sıra DNA hasarı iyice tasvir için ek destekleyici bilgiler gerekiyor. Bu durumda, Apoptozis analizi, γH2A.X boyama ve immunoblotting ajanlar zarar DNA etkisini ortaya çıkarmak için farklı yönleri ayrıntılı bir analizi sağlamak çok yararlı olabilir.
Kuyruklu yıldız görüntü analizi için birçok yazılım vardır ve farklı parametreleri çeşitli çıktı içerir. En sık kullanılan parametreler kuyruk uzunluğu, DNA'sı yüzde kuyruk ve kuyruk an vardır. Kuyruk uzunluğu sadece kuyruk kurulan14olduğunda değiştirmek eğiliminde değil DNA hasarı, düşük düzeyde kullanılabilir. Daha sonra zarar geliştirilmiş kuyruk yoğunluğu artar. Doğrusal kesir frekans ilgili olarak DNA kuyruklu yıldız kuyruk başka bir yararlı parametre, yüzdesidir. Kuyruk uzunluğu ve bir tek değer şiddeti kuyruk kuyruk an birleştirir, bu nedenle, en yararlı ve sık kullanılan parametre.
Kuyruklu yıldız tahlil yaygın olarak genotoxicity test ve insan biomonitoring uygulanmıştır. DNA onarım enzim inhibitörleri gelişmesiyle birlikte, kuyruklu yıldız tahlil geleneksel kemoterapi sonucu geliştirmek kombinasyon tedavileri test etmek için değerli bir araç olabilir.

Kuyruklu yıldız tahlil ilk Ostling ve Johanson tarafından 1984 yılında çekirdeği bir nötr koşul1altında üzerinden göç DNA parçaları göstererek geliştirilmiştir. Teknik bir alkali durumu önemli ölçüde artan özgüllük ve tekrarlanabilirlik tahlil2gösterilen Singh vdtarafından daha sonra geliştirildi. O zamandan beri tarafsız kuyruklu yıldız tahlil çoğunlukla ise alkali kuyruklu yıldız tahlil DNA hasar, tek gibi küçük miktarlar için daha duyarlı ve Çift Kişilik iplikçik DNA tatili, alkali değişken siteler, DNA-DNA çift iplikçikli DNA tatili, algılamak için kullanılır veya DNA-protein cross-linking ve DNA tek iplikçikli kırılmalar eksik eksizyon ile ilişkili siteleri3,4onarın. Her iki deneyleri görselleştirme parçalanmış DNA'ın izin ve kantitatif DNA hasarı değerlendirmek için basit bir yol sağlar. Kuyruklu yıldız tahlil içinde in vitro ve in vivo genetik toksikolojik çalışmalar için hassas bir yöntemi olarak kabul edilir ve erken uyuşturucu-aday seçimi, çevresel izleme, insan biomonitoring gibi farklı araştırma alanları için geçerlidir, ve araştırma DNA hasarı ve5onarım temel.
Tahlil bir elektrik alanı altında parçalanmış DNA (olarak da bilinen "kuyruklu yıldız kafa") çevrili vücut dışına geçirir ve özel jel (olarak da bilinen "kuyruklu yıldız kuyruğu") bir DNA leke oluşturur ilkedir. Nükleotit boyama ile DNA hasar ölçüde "kuyruklu yıldızlar bu tek hücre Elektroforez tarafından kurulan" analiz ederek sayısal. Kuyruk an hesaplanması daha fazla DNA hasar farklı deneysel grupları arasında karşılaştırmak için yardımcı olabilir. DNA hasar tespiti geleneksel yöntemlere göre kuyruklu yıldız tahlil doğrudan, hassas, ucuz ve oldukça basit olduğunu.
Radyoterapi ve chemotherapies kanser tedavisi için ortak stratejiler tek iplikçik oluşturarak ve Çift Kişilik iplikçik DNA kromozom6' tatili. DNA onarım inhibitörleri son gelişme kombinasyon kemoterapi tarafından daha etkili bir genotoksik etkiyi sağlar ve bu nedenle, potansiyel olarak anemi, enfeksiyon ve kemik iliği baskılanması7, gibi sistemik yan etkileri azaltır 8. bu çalışmada, bir Poli (ADP-riboz) polimeraz (PARP) inhibitörü, olaparib (Ola)9incelenmesi gösterdik. PARP bol bir nükleer protein ve Poli (ADP-riboz) polimer10oluşturarak DNA baz eksizyon tamiri için sorumludur. Temozolomide (TMZ) sözlü olarak kullanılabilir bir bölücü ve yaygın olarak tümörü hasta tedavi için kullanılan. Kuyruklu yıldız tahlil DNA hasarı ölçmek için kullanarak, biz olaparib derinden temozolomide ile birleştirerek olaparib/temozolomide kombinasyon tedavisi tümörü, tedavi etmek için etkili bir strateji olduğunu göstermektedir DNA hasarı gliyom hücrelerdeki geliştirir göstermek temozolomide yalnız11ile karşılaştırıldığında.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS(Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; free)</td><td>TEKnova</td><td>P0196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>TEKnova</td><td>E0308</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>Sodium lauryl sarcosinate</td><td>Sigma</td><td>L7414</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma</td><td>32318</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acetate</td><td>Sigma</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>95% ethanol</td><td>WARNER-GRAHAM</td><td>#64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>GIBICO</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tissue slides</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>63422-11</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>KIMberly-Clark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td><td>DENVILLE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips</td><td>SHARP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Avanti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>PRECISION</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horizontal electrophoresis chamber</td><td>TREVIGEN</td><td>Cometassay ES II</td><td></td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Quincy Lab</td><td>Model 12-140E</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluating in vitro dna damage using comet assay

DNA hasar her hücre için ortak bir fenomen onun ömrü ve genomik DNA'ın kimyasal yapısı bir değişiklik tanımlanır. Gibi radyo ve kemoterapi, kanser tedavileri kanser ilerleme sınırlamak için hücre döngüsü tutuklama ve Apoptozis yol ek DNA hasar çok büyük miktarda tanıtmak. DNA hasarı kantitatif değerlendirilmesi deneysel kanser tedavisi sırasında genotoksik aracısı etkinliğini haklı göstermek için önemli bir adımdır. Bu çalışmada, biz bir tek hücre elektroforez yöntemi, olarak da bilinen tek ölçmek kuyruklu yıldız tahlil odaklanmak ve iki iplikçikli DNA vitrotatili. Kuyruklu yıldız tahlil verimli ve gerçekleştirmek kolay bir DNA hasarı miktar yöntemidir ve düşük saat/bütçe talepleri ve yüksek tekrarlanabilirlik vardır. Burada, olaparib/temozolomide kombinasyon tedavisi U251 tümörü hücrelere genotoksik etkisini değerlendirerek kuyruklu yıldız tahlil preklinik bir çalışma için yardımcı programı vurgulayın.

Kuyruklu yıldız tahlil yürütme ve veri analizi (şekil 1) için adım adım iş akışı mevcut protokolünü açıklar. Alkali ve tarafsız kuyruklu yıldız deneyleri sonuçları doksorubisin tedavi U251 hücreler (1 µM, 20 h) kuyrukluyıldızın kuyruğunun daha uzun ve daha yüksek DNA şiddeti, parçalanmış DNA kemoterapi (Şekil 2) nedeniyle önemli bir birikimi düşündüren vardı gösterdi.
Kantitatif analiz alkali veya nötr kuyruklu yıldız tahlil için önemli ölçüde artış kuyruklu yıldız kuyruk oluşumu gösteren DNA hasarı doksorubisin tedavi (şekil 3A) sonra gösterdi. Sonuçları ortalama ± SEM ve tsunulmaktadır-testleri istatistiksel karşılaştırmalar için kullanılmıştır. Miktar kuyruk an her iki deneyleri doğruladı ortalama kuyruk an artış: 0,134 ± 0.0448 alkali kuyruklu yıldız tahlil için (n 52 =) 13.84 ± 1.325 vs (n = 51), p &#60; 0,01; Tarafsız kuyruklu yıldız tahlil, 0.596 ± 0.06668 için (n = 78) 9.979 ± 0.658 vs (n = 51), p &#60; 0,01. Bu veriler DNA hasarı değerlendirmek için ölçülebilir bir dizin sağlar. Ayrıca, kombinasyon tedavisi PARP inhibitörü olaparib ve temozolomide önemli ölçüde bir artan uzunluğu ve kuyruklu yıldız kuyruk sinyalin yoğunluğunu (şekil 3 c), tümörü hücrelerdeki DNA hasar geliştirilmiştir. Olaparib yalnız tanıtmak değil DNA hasarı, kemoterapi Ajan temozolomide genotoksik etkisini potentiated ise (DMSO, 0.9836 ± 0.3377 (n = 64); Olaparib, 0.6663 ± 0.2325 (n = 51); TMZ, 6.197 ± 0.572 (n = 51); Olaparib + TMZ, 44.04 ± 1.269(n = 115), p &#60; 0,01).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56450/56450fig1.jpg"> 
Resim 1 : Bir kuyruklu yıldız tahlil yazılımını kullanarak görüntü analiz adım adım kılavuzu. (A) kuyruklu yıldız tahlil araç yazılım. (B) alkalin kuyruklu yıldız tahlil örnek olarak: kuyruklu yıldız tahlil yazılım kullanıcı arabirimi bir görüntüsü gibi yoğunluk profil ve veri alma penceresi oluşur. (C) görüntü arka plan, kuyruklu yıldız bölge ve kuyruklu yıldız başı yazılımda tanımlanmış. Kuyruklu yıldız baş (kırmızı) ve kuyruk (yeşil) (D) yoğunluğu profilleri sırasıyla çizilir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56450/56450fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56450/56450fig2.jpg"> 
Resim 2 : Alkali ve tarafsız kuyruklu yıldız deneyleri temsilcisi görüntülerini. U251 tümörü hücreleri doksorubisin ile tedavi edildi ve alkali (üst panelleri) ve nötr (alt panelleri) bir kuyruklu yıldız tarafından deneyleri araştırıldı (ölçek çubuğu 10 µm =). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56450/56450fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56450/56450fig3.jpg"> 
Şekil 3: Kuyruklu yıldız temsilcisi veri kuyruk an. (A)alkalin kuyruklu yıldız tahlil veri arsa. p &#60; 0,01. (B) tarafsız kuyruklu yıldız tahlil veri arsa. p &#60; 0,01. (C) kuyruklu yıldız tahlil analiz ortaya temozolomide (TMZ) ve olaparib (Ola) dahil olmak üzere kombinasyon tedavisi sinerjik etkisi. p &#60; 0,01. (D) temsilcisi görüntüleri kombinasyon tedavisinde temozolomide ve olaparib altında gliyom hücrelerinin (ölçek çubuğu 10 µm =). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56450/56450fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay at JoVE.com

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Vitro DNA hasarı kuyruklu yıldız tahlil kullanarak değerlendirmek

Kuyruklu yıldız tahlil tek ve çift iplikçikli DNA içeren DNA hasarı tatili algılamak için verimli bir yöntemdir. Kemoterapi tedavi edici etkisini değerlendirmek için kanser hücrelerinin DNA hasarı ölçmek için alkali ve tarafsız kuyruklu yıldız deneyleri tarif.

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

evaluating-in-vitro-dna-damage-using-comet-assay

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

37.2K Görüntüleme.  National Cancer Institute. Kuyruklu yıldız tahlil tek ve çift iplikçikli DNA içeren DNA hasarı tatili algılamak için verimli bir yöntemdir. Kemoterapi tedavi edici etkisini değerlendirmek için kanser hücrelerinin DNA hasarı ölçmek için alkali ve tarafsız kuyruklu yıldız deneyleri tarif.

Video: Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Kanser Araştırmaları

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human central nervous system (CNS). However, both the cytological origin and the evolutionary process of HBs (including neovascularization) remain controversial, and anti-angiogenesis for VHL-HBs, based on classic HB angiogenesis, have produced disappointing results in clinical trials. One major obstacle to the successful clinical translation of anti-vascular treatment is the lack of a thorough understanding of neovascularization in this vascular tumor. In this article, we present a comprehensive procedure to evaluate in vitro whether classic tumor angiogenesis exists in HBs, as well as its role in HBs. With this procedure, researchers can accurately understand the complexity of HB neovascularization and identify the function of this common form of angiogenesis in HBs. These protocols can be used to evaluate the most promising anti-vascular therapy for tumors, which has high translational potential either for tumors treatment or for aiding in the optimization of the anti-angiogenic treatment for HBs in future translations. The results highlight the complexity of HB neovascularization and suggest that this common form angiogenesis is only a complementary mechanism in HB neovascularization.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

This paper presents a comprehensive procedure to evaluate in vitro whether classic tumor angiogenesis exists in hemangioblastomas (HBs) and its role in HBs. The results highlight the complexity of HB-neovascularization and suggest that this common form of angiogenesis is only a complementary mechanism in the HB-neovascularization.

Sözde Hemangioblastoma tahlil çimlenme küresel kullanarak neovaskülarizasyon Vitro performansını değerlendirmek için kapsamlı bir yordam

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: İnsan Microarrayed hücrelerde DNA hasarına ölçülmesi için bir Yüksek verim 96 Oyuklu Platformu

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Biyomühendislik

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other environmental stressors. Use of the comet assay in regulatory testing for genotoxic potential in rodents has been driven by adoption of an Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline in 2014. Comet assay slides are typically prepared from fresh tissue at the time of necropsy; however, freezing tissue samples can avoid logistical challenges associated with simultaneous preparation of slides from multiple organs per animal and from many animals per study. Freezing also enables shipping samples from the exposure facility to a different laboratory for analysis, and storage of frozen tissue facilitates deferring a decision to generate DNA damage data for a given organ. The alkaline comet assay is useful for detecting exposure-related DNA double- and single-strand breaks, alkali-labile lesions, and strand breaks associated with incomplete DNA excision repair. However, DNA damage can also result from mechanical shearing or improper sample processing procedures, confounding the results of the assay. Reproducibility in collection and processing of tissue samples during necropsies may be difficult to control due to fluctuating laboratory personnel with varying levels of experience in harvesting tissues for the comet assay. Enhancing consistency through refresher training or deployment of mobile units staffed with experienced laboratory personnel is costly and may not always be feasible. To optimize consistent generation of high quality samples for comet assay analysis, a method for homogenizing flash frozen cubes of tissue using a customized tissue mincing device was evaluated. Samples prepared for the comet assay by this method compared favorably in quality to fresh and frozen tissue samples prepared by mincing during necropsy. Moreover, low baseline DNA damage was measured in cells from frozen cubes of tissue following prolonged storage.

This protocol describes several procedures for preparing high quality frozen tissue samples at the time of necropsy for use in the comet assay to assess DNA damage: 1) minced tissue, 2) scraped epithelial cells from the gastrointestinal tract, and 3) cubed tissue samples, requiring homogenization using a tissue mincing device.

DNA Hasarının Değerlendirilmesinde Kuyruklu Yıldız Testinde Donmuş Dokunun Kullanımı

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...

Genetik

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Comet Assay kullanma Hipokampal Nöronlar DNA Hasarı assaying

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Nörobilim

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

Sistemik Oksidatif Stresin bir Dolaylı Tedbir olarak Comet Assay

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

Biyoloji

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

Sıçan Karaciğer DNA Strand Breaks ve Oksidatif DNA Hasar Ölçüm Vivo Alkali Comet Assay ve Enzim-modifiye Alkali Comet Tahlili

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

A High-Throughput Comet Assay Approach for Assessing Cellular DNA Damage

Cells are continually exposed to agents arising from the internal and external environments, which may damage DNA. This damage can cause aberrant cell function, and therefore DNA damage may play a critical role in the development of, conceivably, all major human diseases, e.g., cancer, neurodegenerative and cardiovascular disease, and aging. Single-cell gel electrophoresis (i.e., the comet assay) is one of the most common and sensitive methods to study the formation and repair of a wide range of types of DNA damage (e.g., single- and double-strand breaks, alkali-labile sites, DNA-DNA crosslinks, and, in combination with certain repair enzymes, oxidized purines, and pyrimidines), in both in vitro and in vivo systems. However, the low sample throughput of the conventional assay and laborious sample workup are limiting factors to its widest possible application. With the "scoring" of comets increasingly automated, the limitation is now the ability to process significant numbers of comet slides. Here, a high-throughput (HTP) variant of the comet assay (HTP comet assay) has been developed, which significantly increases the number of samples analyzed, decreases assay run time, the number of individual slide manipulations, reagent requirements, and risk of physical damage to the gels. Furthermore, the footprint of the electrophoresis tank is significantly decreased due to the vertical orientation of the slides and integral cooling. Also reported here is a novel approach to chilling comet assay slides, which conveniently and efficiently facilitates the solidification of the comet gels. Here, the application of these devices to representative comet assay methods has been described. These simple innovations greatly support the use of the comet assay and its application to areas of study such as exposure biology, ecotoxicology, biomonitoring, toxicity screening/testing, together with understanding pathogenesis.

The comet assay is a popular means of detecting DNA damage. This study describes an approach to running slides in representative variants of the comet assay. This approach significantly increased the number of samples while decreasing assay run-time, the number of slide manipulations, and the risk of damage to gels.

Hücresel DNA Hasarını Değerlendirmek için Yüksek Verimli Bir Kuyruklu Yıldız Testi Yaklaşımı

Cells are continually exposed to agents arising from the internal and external environments, which may damage DNA. This damage can cause aberrant cell ...

Alkaline Single Cell Gel Electrophoresis: A Sensitive Technique for Quantitative Estimation of DNA Damage in Individual Cancer Cells Following Chemotherapy

Source: Lu, Y., et al. <a href="https://www.jove.com/v/56450">Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate an alkaline single-cell electrophoresis assay to quantify both single- and double-strand DNA breaks in doxorubicin-treated cells. Alkaline conditions disrupt the hydrogen bonds between DNA base pairs, resulting in the complete unwinding and separation of DNA strands. This allows differential migration of undamaged and damaged DNA fragments in agarose gel upon electrophoresis, revealing a comet-shaped structure of slowly migrating undamaged DNA forming the circular comet head, and rapidly migrating damaged DNA fragments forming the elongated comet tail.

Alkali Tek Hücreli Jel Elektroforezi: Kemoterapiyi Takiben Bireysel Kanser Hücrelerinde DNA Hasarının Kantitatif Tahmini için Hassas Bir Teknik

Source: Lu, Y., et al. Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate an alkaline single-cell ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biyolojik Teknikler

Elektroforez Teknikleri

Comet Assay for DNA Damage Detection in Cells

Source: Ji, Y., et al. <a href="https://app.jove.com/v/63559">A High-Throughput Comet Assay Approach for Assessing Cellular DNA Damage.</a> J. Vis. Exp. (2022).
The video demonstrates the comet assay for detecting DNA damage following exposure to harmful agents. Under alkaline conditions, the DNA unwinds and denatures, and upon electrophoresis, the undamaged and damaged DNA migrate differently in the agarose gel, forming a comet-shaped structure. The slowly migrating undamaged DNA forms the circular comet head, while the rapidly migrating damaged DNA fragments form the elongated comet tail.

Hücrelerde DNA Hasarı Tespiti için Comet Deneyi

Source: Ji, Y., et al. A High-Throughput Comet Assay Approach for Assessing Cellular DNA Damage. J. Vis. Exp. (2022).
The video demonstrates the comet ...