Name: generation and isolation of cell cycle-arrested cells with complex karyotypes
Uploaded: 2018-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes at JoVE.com

Bu eser kısmen Koch Enstitüsü destek (çekirdek) Grant P30-CA 14051 Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından Ulusal kurumları sağlık Grant'ın (CA206157-22 ve GM118066) ve Angelika Amon Curt mermer kanser araştırma fonu tarafından desteklenmiştir. Angelika Amon da Howard Hughes tıp Enstitüsü ve Glenn Vakfı Biyomedikal Araştırma için bir dedektif olduğunu. S. S. tarafından Amerikan İtalyan kanser Vakfı (AICF), kanser araştırma Marie Curie eylemleri ve İtalyan Derneği kanser araştırma (AIRC) için bir arkadaş grubu tarafından ve bir KI Quinquennial kanser araştırma bursu tarafından desteklenmiştir. E.M. Howard Hughes tıp Enstitüsü'nden bir arkadaş grubu tarafından desteklenmiştir.

Kültür durumu
RPE-1 hTERT hücre kültürünü kültürlü Dulbecco'nın modifiye kartal % 10 ile desteklenmiş orta (Tablo reçetesi) Fetal sığır Serum, 2 mM L-glutamin ve 100 U/ml penisilin/streptomisin. Hücreleri oksijen bir ortamda % 5 CO2 37 ° C'de inkübe. Aşağıda açıklanan protokol 10 cm yemekleri kullanılarak geliştirilen ve tüm teknik detayları bildirdi o yemekleri için başvurun. Farklı yemekler kullanıyorsanız, ölçek yukarı ya da buna göre aşağı.
1. senkronizasyon 1 RPE hücrelerinin
<ol><li>Tüm deneyler için 15'ten fazla pasajlar tabi tutulmuştur değil taze çözdürülen hücreler kullanın. Gün 1, çözülme ve ~2.5 - 5.0 x 105 RPE-1 hTERT hücreleri bir 10 cm doku kültürü çanak içine dağıtmak. Standart büyüme Orta 8 mL ekleyin ve gecede kuluçkaya. Standart hücre sayaç (örneğin, hemasitometre) kullanarak cep numarasını belirleyin. Not: Hücre yoğunluğu 1 RPE hücrelerinin büyüme koşullarına anlamına gelir. Büyüme koşulları farklı hücre hatları arasında değişebilir; Buna göre ayarlayarak göz önünde bulundurun.</li>
	<li>2 günde hücreleri G1/S sınır normal büyüme orta alıyorum ve 5 mM timidin içeren 8 mL orta ekleyerek eşitleyin. Not: Timidin konsantrasyon ve tedavi uzunluğunu farklı hücre hatları arasında değişebilir. Test edilecek hücre satırları için en iyi koşulları belirlemek için pilot deney gerçekleştirmek için tavsiye edilir.</li>
	<li>Timidin ekledikten sonra günde 3, 24 h orta (Adım 1.2), serbest timidin bloğundan orta alıyorum ve hücreleri üç kez 1 x PBS ile yıkama tarafından. 8 mL normal büyüme ortamının eklemek ve tabakları da kuluçka için dönmek.</li>
</ol>2. nesil Aneuploid Mitotik kinaz Mps1 aktivite ile girişim tarafından hücreleri
<ol><li>Günde 3, yayımlanmasından sonra 6 h timidin Block (1.3; adım hücreler mitoz girmeden önce yaklaşık 3-6 h bu), Aspire orta, bir kez 1 x PBS ile yıkayın ve 500 nM reversine (Mps1 inhibitörü) içeren orta ile değiştirin. Not: RPE-1 hücreler mitoz 9-12 h girin timidin wash-out10,11' den sonra. Ancak, hücre döngüsü Kinetik farklı hücre hatları arasında değişiklik gösterir. Bu nedenle, pilot deneylerde Bu kinetik tarafından kurulan yöntemleri (DNA analizi içerik üzerinden FACS ölçme tarafındanörneğin,) hücre döngüsü analizi gerçekleştirerek belirlemek çok önemlidir. Ayrıca, Mps1 inhibitörü en uygun çalışma konsantrasyonu hücre hatları arasında değişebilir. Önceki deneyler RPE1 hücreleri kullanarak bir çalışma konsantrasyonu 500 nM10,11,12reversine kullanarak başarılı olmuştur. Test edilecek hücre satırı için en uygun konsantrasyonu belirlemek için pilot deney gerçekleştirmek için tavsiye edilir.</li>
	<li>Günde 4, 12 h reversine tedavi (yaklaşık 6 hücreler mitoz sonra h gibi) sonra reversine orta Aspire edin ve hücreleri üç kez 1 x PBS ile yıkayın. 8 mL normal büyüme orta plakasına eklemek ve hücreler için kuluçka dönmek.</li>
</ol>3. Aneuploid Bisiklete binme hücreleri ve ArCK nüfus zenginleştirme kaldırılması
<ol><li>Günde 6, hücreleri ilk mitoz girdikten sonra yaklaşık 72 h (2.2; adım yaklaşık 66 h reversine yıkama hakkında için karşılık gelen çıkış sonra bu 2-3 hücre döngüsü), Aspire orta, bir kez 1 x PBS ile yıkayın ve 300 nM nocodazole içeren orta ile değiştirin. Not: Son iş aneuploid karyotypes yataklık RPE-1 hücreleri genomically kararsız olan ve onların yayılması hakkında tutuklama göstermiştir ilk hatalı mitoz10sonra 2-3 hücre döngüsü. Ancak, bu Kinetik farklı hücre hatları arasında değişebilir. Bu nedenle, aneuploid Bisiklete binme hücreleri kaldırılması için uygun zamanlama belirlemek için pilot deney gerçekleştirmek çok önemlidir.</li>
	<li>Gün 7, 12 h nocodazole tedavi sonra orta Aspire edin ve 3 mL 1 x PBS için plaka ekleyin. Mitotik hücre plaka tarafında dokunarak sallamak. Mitotik hücre bile kaldırılmasına izin için her dokunun arasında plaka döndür.</li>
	<li>Mitotik hücre tümüyle kaldırılmasını sağlamak için alıyorum ve 3 mL 1 x PBS her turun arasında ekleme (3 - 5 kez önerilir), birden fazla mermi için shake-off işlemi tekrarlayın.</li>
	<li>Sallamak-off sonra yavaşça kapağı veya plaka kenarına yapıştırılır herhangi bir sıvı Aspire edin. Kısaca, plaka 10 X büyütme, mikroskop altında kontrol edin. Kaç Mitotik hücre gözlenir emin olun. Beşten fazla Mitotik hücre 10 X amaç altında görülürse, başka yuvarlak-in sallamak-off yineleyin. Not: Mitotik hücreler yuvarlak görünür ve shake-kapalı sonra kısmen müstakil olabilir. Nocodazole tedavi bir sonraki turda hücrelere açığa önce Mitotik hücre tümüyle kaldırılmasını sağlamak çok önemlidir. Aksi halde Mitotik hücre ölüme yol ve/veya tetraploid hücreler nesilde neden.</li>
	<li>Son sallamak-off sonra bir kez 5 mL 1 x PBS de içeren hücreleri yıkayın. 330 nM nocodazole plaka içeren 8 mL orta ekleyin ve 12 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Nocodazole tedavi/sallamak-off (Adım 3.1-3,5) her 12 h tekrarlayın kadar hiçbir Mitotik hücre kuluçka sonra gözlenir. Genellikle, 4-5 tur tedavi/sallamak-kapalı tavsiye edilir. Not: burada sağlanan bilgi RPE-1 hücrelere bakın. Tedavi/sallamak-off tur sayısını farklı hücre hatları arasında değişebilir. Nocodazole uzun süreli ve gereksiz maruz önlemek için dikkatli bir şekilde, pilot bir deneyde aneuploid Bisiklete binme hücreleri verimli ve tam kaldırılması için gerekli tur sayısını belirlemek önemlidir.</li>
	<li>4-5 tur sonra nocodazole tedavi/sallamak-off (Adım 3.1-3.6), normal büyüme orta 10 mL ekleyin ve kuluçkaya. Hücreler için 12-24 h gelecekteki manipülasyon veya tahlil kullanmadan önce dinlenmek izin verir. Not: Son sallamak kapalı sonra plaka üzerinde kalan hücreleri hücre döngüsü tutuklandı ve10, son zamanlarda görüldüğü gibi karmaşık karyotypes liman var. Bu hücreler ArCK (karmaşık karyotip ile Arrested) hücreler olarak adlandırılır. Bu deneyleri ArCK nüfus üzerinde yalıtım bir hafta içinde gerçekleştirmek için tavsiye edilir.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, karmaşık karyotypes tutuklandı hücrelerle yüzdesi değerlendirmek için toplamak ve standart hücre sayaç kapalı her sallamak-hücreleri saymak.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig1.jpg"> Şekil 1: genel olarak oluşturmak ve karmaşık karyotip (ArCK) ve temsilcisi görüntüleri ile aneuploid hücreleri izole etmek için kullanılan yönteminin şematik. (A) üretimi ve yalıtım Protokolü şematik ArCK hücreleri. (B) temsilcisi görüntüleri RPE-1 hTERT hücre tedavisi her aşamasında. (Kırmızı özetlenen) son paneli izole ArCK hücreleri temsil eder. Ölçek bar 100 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
4. ArCK nüfus karakterizasyonu
<ol><li>ArCK nüfusunun başarılı yalıtım aşağıdaki testleri gerçekleştirerek onaylayın.<ol>
<li>Eşek beta-galaktozidaz (yaşlanma marker) Boyama ticari olarak kullanılabilir kullanarak (tablo malzemeleri görmek) kit.</li>
		<li>CCL2 gibi pro-inflamatuar sitokinlerin salgılanmasını piyasada kitleri (tablo malzemeleri görmek) istihdam ederek ölçmek.</li>
		<li>Hücre döngüsü inhibitörleri p53, p21, p16 Western Blot tarafından yüksek düzeyde onaylayın. Not: düzgün bu deneyleri denetlemek için ArCK nüfusu euploid ve aneuploid Bisiklete binme hücrelere göre olmalıdır. Eski düşük geçiş, katlanarak büyüyen yaban tipi RPE-1 hTERT hücreleri. İkinci RPE-1 hTERT kromozom mis segregasyon inducing ve sonra ilk anormal mitoz hücre 72 h hasat tarafından alınabilir. Bunu yapmak için ilk nocodazole tedavi (Adım 3.1) önce adım 1.1 ve hasat hücrelerden yukarıda açıklanan Protokolü uygulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Karyotip tutuklandı hücre değerlendirmek için tek hücreli sıralama gerçekleştirir. Not: Tek hücreli sıralama tek hücre düzeyi13hücre nüfus arasında kromozom ve alt kromozom değişiklikleri belirlemek için köklü bir yöntemdir. Tek hücreli sıralama gerçekleştirmeye ilişkin ayrıntılı yordamlar10başka bir yerde bulunabilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Santaguida, S., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-+and+long-term+effects+of+chromosome+mis-segregation+and+aneuploidy.">Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).</li><li>Pfau, S. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+instability+and+aneuploidy+in+cancer:+from+yeast+to+man.">Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man.</a> EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).</li><li>Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+aneuploidy+in+cancer.">Causes and consequences of aneuploidy in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).</li><li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boveri+revisited:+chromosomal+instability,+aneuploidy+and+tumorigenesis.">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 478-487 (2009).</li><li>Meena, J. K., Cerutti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+abrogates+aneuploidy-induced+telomere+replication+stress,+senescence+and+cell+depletion.">Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress, senescence and cell depletion.</a> The EMBO Journal. , 1-14 (2015).</li><li>Ohashi, A., Ohori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+generates+proteotoxic+stress+and+DNA+damage+concurrently+with+p53-mediated+post-mitotic+apoptosis+in+SAC-impaired+cells.">Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells.</a> Nature Communications. 6, 7668 (2015).</li><li>Passerini, V., Ozeri-Galai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+extra+chromosomes+leads+to+genomic+instability.">The presence of extra chromosomes leads to genomic instability.</a> Nature Communications. 7, 10754 (2016).</li><li>Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+drives+genomic+instability+in+yeast.">Aneuploidy drives genomic instability in yeast.</a> Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).</li><li>Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotypic+determinants+of+chromosome+instability+in+aneuploid+budding+yeast.">Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast.</a> PLoS Genetics. 8 (5), e1002719 (2012).</li><li>Santaguida, S., Richardson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Mis-segregation+Generates+Cell-Cycle-Arrested+Cells+with+Complex+Karyotypes+that+Are+Eliminated+by+the+Immune+System.">Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System.</a> Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).</li><li>Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy-induced+cellular+stresses+limit+autophagic+degradation.">Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation.</a> Genes &amp; Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).</li><li>Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+MPS1+in+chromosome+biorientation+and+the+spindle+checkpoint+through+the+small+molecule+inhibitor+reversine.">Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).</li><li>L&#243;pez-Soto, A., Gonzalez, S., L&#243;pez-Larrea, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosurveillance+of+Malignant+Cells+with+Complex+Karyotypes.">Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes.</a> Trends in cell biology. , 1-4 (2017).</li><li>Watson, E. V., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+Police+Detect+Chromosomal+Imbalance+Triggering+Immune+Crackdown!.">Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown!.</a> Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Oluşturmak ve karmaşık karyotypes (ArCK) ile tutuklandı hücreler için zenginleştirmek için bu roman yöntemi birden çok kromozom kazancı veya zararı var ve bölmek ateşkes hücreleri çalışma için sağlar. Yöntem kurulum hızlı ve güvenilir bir şekilde ArCK hücre izolasyon kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.
Bu tahlil en kritik adımda titizlikle ilaç tedavisi kronolojisi ve en önemlisi, aneuploid Bisiklete binme hücre kaldırma kontrol ediyor. En iyi sonuçlar için nocodazole tedavi ve shake-off onlar hala yuvarlak ve Mitotik, Mitotik hücre ölümü veya kayma olasılığı G1 içine önleme iken Bisiklete binme hücreleri plaka kaldırılır emin olmak için özellikle önem zamanı, potansiyel bir tetraploid nüfus oluşturma. Sallamak-off zamanlaması önerilen 12-h nocodazole kuluçka üzerinden iki saatten fazla sapma tavsiye edilmez.
Hücreleri nasıl karmaşık karyotypes daha derin bir anlayış kolaylaştırmak için potansiyel var ArCK gelecek çalışmalar hücre fizyolojisi etkiler. Özellikle, yeni yapılan bir çalışmada bağışıklık sistemi hücrelerinin ile etkileşim edebiliyoruz ve10ArCK tetikleyici bağışıklık Gümrükleme hücreleri gösterdi. Burada açıklanan yöntemi ArCK hücreleri bağışıklık izni dönüştürülmemiş hücrelere ve nasıl oncogenic dönüştürme çalışmanın temel moleküler mekanizmaları açıklama da dahil olmak üzere, daha fazla karakterizasyonu için mükemmel bir başlangıç noktası sağlar Bu gözetim mekanizması, alan14,15dakika içinde çok önemli bir soru atlamak.

Kromozom ayrımı sürecinde hataları anöploidi, haploit tamamlayıcı1,2,3,4katı değil bir kromozom sayısı ile karakterize bir durum neden. Aneuploid daha fazla genomik istikrarsızlık5,oluşturur tetikleyicisi çoğaltma stres karyotypes6,7,8,9,10, artırır karyotip karmaşıklık ve sonuçta bir subpopulation hücre10hücre döngüsü tutuklanması yol açar. Burada sunulan yöntemin amacı oluşturmak ve hücreleri Bisiklete binme böyle bir subpopulation ayrı etmektir. Ucuz doku kültürü teknikleri kullanarak, bu iletişim kuralı yalıtım ve hücre döngüsü tutuklandı karmaşık karyotypes aneuploid hücrelerle karakterizasyonu kolaylaştırır. Bu hücreler ArCK (karmaşık karyotip ile Arrested) hücreleri ve euploid Bisiklete binme karşılıkları denetimleri olarak adlandırılır.
Bu iletişim kuralı bu amaçla kurulacak Birincisi ve yalıtım için izin verir ve daha fazla dahil, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, onların indüklenen yaşlanma ve yaşlanma ilişkili salgı fenotip (SASP), onların pro-inflamatuar ArCK satırlarının çalışma özellikleri ve bağışıklık hücreleri ile girmeye yeteneklerini. Burada sunulan yöntem dönüştürülmemiş, ölümsüzleştirdi insan hücrelerinde geliştirilmiştir ancak kanser satırlarında henüz test edilmemiştir. Bazı dönüştürülmüş hücrelerin hücre döngüsü tutuklama bir veya birden çok yolları bastırılması nedeniyle duyarsız olabilir; Bu nedenle, daha fazla doğrulama diğer hücre satırlarında gerçekleştirilmesi gerekiyor.

<table><tbody><tr><td>DMEM (Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium)&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1859</td><td></td></tr><tr><td>Reversine</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>10004412</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1410</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p53 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p21 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6246</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p16 antibody</td><td>BD</td><td>554079</td><td></td></tr><tr><td>Senescence b-Galactosidase Staining Kit</td><td>Cell Signaling Technology&amp;nbsp;</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>ARY005B</td><td></td></tr></tbody></table>

generation and isolation of cell cycle-arrested cells with complex karyotypes

Kromozom mis segregasyon anöploidi, hücreleri bir dengesiz kromozom sayısı liman bir koşul için yol açar. Kanıt birkaç satırlık şiddetle o anöploidi genom istikrarsızlık, sonuçta onların yayılması tutuklamak karmaşık karyotypes içeren hücreleri üreten tetikler gösterir. Yalıtım ve karmaşık karyotypes yataklık hücrelerin karakterizasyonu bir dengesiz kromozom sayısı hücre fizyolojisi üzerinde etkisini incelemek büyük önem taşımaktadır. Bugüne kadar hiçbir yöntem güvenilir bir şekilde böyle aneuploid hücreleri izole etmek için kurulmuştur. Bu kağıt standart, ucuz doku kültürü teknikleri kullanan karmaşık karyotypes ile zenginleştirme ve aneuploid hücre analizi için bir protokol sağlar. Bu iletişim kuralı aneuploid hücrelerin çeşitli özellikler ile indüklenen yaşlanma ilişkili salgı fenotip, pro-inflamatuar özellikleri ve bağışıklık hücreleri ile etkileşim yeteneği de dahil olmak üzere karmaşık karyotypes analiz etmek için kullanılabilir. Kanser hücrelerinin kez dengesizlikler kromozom sayısı içinde liman çünkü anöploidi hem yanlısı ve anti tumorigenic etkileri ortaya çıkararak nihai hedefi ile normal hücrelerde hücre fizyolojisi nasıl etkilediğini deşifre önemlidir.

Bu yöntem bir vitro doku kültürü sistemi onların yayılması tutuklamak karmaşık karyotypes ile aneuploid hücreleri izole etmek için kullanır. Bu nüfus ArCK (Arrested karmaşık Karyotypes ile) hücreler olarak adlandırılır. Şekil 1A deney düzeni gösterir. Vahşi tipi Bisiklete binme RPE-1 hTERT hücreleri timidin G1/S sınırında eşzamanlı ve kromozom mis segregasyon ikna etmek için Mps1 inhibitörü ile tedavi. İğ zehir nocodazole hücrelere 72 h kromozom mis segregasyon indüksiyon sonra eklenir. 12 saat sonra nocodazole tedavi, hala çoğalırlar edebiliyoruz aneuploid hücreleri mitoz girin ve Mikrotubul polimerizasyonu ile girişim nedeniyle bu hücre döngüsü aşamasında sıkışıp kalırlar. Bunlar tuzağa hücreleri kolayca nazik sallamak-off tarafından kaldırıldı sonra. Sallamak-off işlem tekrarlanan 3 - 5 kere hücreleri Bisiklet tümüyle kaldırılmasını sağlamaktır. Şekil 1B 1 RPE hücrelerinin temsilcisi görüntüleri tedavinin her aşamasında gösterir.
ArCK hücreler, hücre döngüsü yavaşlatıcılar, p53, p21 ve euploid ve aneuploid hücreleri, Bisiklete binme şekil 2Agösterildiği gibi kıyasla p16 gibi daha yüksek düzeyde görüntüler. Ayrıca, şekil 2B olumlu β-galaktozidaz ile karşılaştırıldığında euploid kontrol hücreleri, ArCK hücrelerdeki hücresel yaşlanma köklü bir marker boyama gösterir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig2.jpg"> Resim 2: ArCK hücreleri kullanan temsilcisi sonuçları. (A) Western blot değerlendirilmesi hücre döngüsü inhibitörü düzeyleri euploid, aneuploid Bisiklete binme ve ArCK hücreleri. P53, p21 ve p16 düzeyde western blot analizi ile belirlenmiştir. Aktin yükleme denetimi olarak görev yaptı. (B) β-galaktozidaz yaşlanma ArCK hücrelerdeki düzeyini değerlendirmek boyama. Yaşlanma ile ilişkili β-galaktozidaz (β-Gal) faaliyet euploid hücreleri ve ArCK hücreleri tespit edilmiştir. Ölçek bar 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Bu hücre döngüsü tutuklama aneuploid hücreleri ile karmaşık karyotypes, önemli bir özelliği tek hücreli ArCK hücreler birden çok, görüntüler şekil 3' te, rasgele kromozom kazançları ve kayıpları sıralama temsilcisi karyotip analizi tarafından gösterildiği gibidir. Bu bulgu önceki raporları10ile tam anlaşma mevcuttur.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig3.jpg"> Şekil 3: temsilcisi tek hücreli sıralama ArCK hücrelerinin. Karyotip altı temsilcisi ArCK hücre gösterilen segmentasyon çizer. Segmentasyon araziler (vahşi RPE-1 kadın kökenli diploit hücre kültürünü türüdür) bir günlük2 ölçekte x 1 euploid başvuru göre kromozom tüm kopya sayısını gösterir. Kromozom kazançlar kırmızı, kromozom kayıp yeşil vurgulanır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes at JoVE.com

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Anöploidi sonunda karmaşık karyotypes içeren hücre döngüsü tutuklandı hücreleri üreten genom istikrarsızlık yol açar. Bu kağıt aneuploid hücreleri bölmek için ateşkes karmaşık karyotypes ile izole etmek için basit ve uygun bir yöntem sağlar.

Üretimi ve yalıtım karmaşık Karyotypes içeren hücrelerin hücre döngüsü tutuklandı

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

generation-isolation-cell-cycle-arrested-cells-with-complex

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.4K Görüntüleme.  Massachusetts Institute of Technology. Anöploidi sonunda karmaşık karyotypes içeren hücre döngüsü tutuklandı hücreleri üreten genom istikrarsızlık yol açar. Bu kağıt aneuploid hücreleri bölmek için ateşkes karmaşık karyotypes ile izole etmek için basit ve uygun bir yöntem sağlar.

Video: Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

Hücre Çevrimiyle Düzenlenen Gen İfadesini İki Tamamlayıcı Hücre Senkronizasyon Protokolü İle Çalışmak

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Genetik

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum deprivation; chemicals which arrest cells at different cell cycle phases; or the use of mitotic shake-off which exploits their reduced adherence. However, all of these have disadvantages. For example, serum starvation works well for normal cells but less well for tumor cells with compromised cell cycle checkpoints due to oncogene activation or tumor suppressor loss. Similarly, chemically-treated cell populations can harbor drug-induced damage and show stress-related alterations. A technique which circumvents these problems is counterflow centrifugal elutriation (CCE), where cells are subjected to two opposing forces, centrifugal force and fluid velocity, which results in the separation of cells on the basis of size and density. Since cells advancing through the cycle typically enlarge, CCE can be used to separate cells into different cell cycle phases. Here we apply this technique to primary acute lymphoblastic leukemia cells. Under optimal conditions, an essentially pure population of cells in G1 phase and a highly enriched population of cells in G2/M phases can be obtained in excellent yield. These cell populations are ideally suited for studying cell cycle-dependent mechanisms of action of anticancer drugs and for other applications. We also show how modifications to the standard procedure can result in suboptimal performance and discuss the limitations of the technique. The detailed methodology presented should facilitate application and exploration of the technique to other types of cells.

This protocol describes the use of centrifugal elutriation to separate primary acute lymphoblastic leukemia cells into different cell cycle phases.

Birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri hazırlanmasında farklı hücre döngüsü aşamaları santrifüj Elutriation tarafından

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Kanser Araştırmaları

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Biyokimya

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Gelişim Biyolojisi

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Karyotipik İnsan Embriyonik Kök Hücreleri kromozom Yayılı Hazırlık

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Biyoloji

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

Metabolik Etiketleme ve Flow Sitometri ile Hücre Döngüsü İlerleme Kinetik Ölçüm

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Kültür Hücrelerinin itibaren Kromozom Hazırlık

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

Hücre Testi Mitoz Sonu Kromatin dekondenzasyon Eğitim için

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...