Name: generation and isolation of cell cycle-arrested cells with complex karyotypes
Uploaded: 2018-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי תמיכה המכון קוך (core) גרנט P30-קה 14051 מן המכון הלאומי לסרטן, על ידי נבחרת מוסדות של בריאות גרנט (CA206157-22 ו- GM118066) ו קורט השיש סרטן מחקר לקרן אנג'ליקה אמון. אנג'ליקה אמון הוא גם חוקר של הווארד יוז המכון הרפואי ועל קרן גלן למחקר ביורפואי. ס ס נתמכה על ידי את האמריקאי איטלקי סרטן קרן (AICF), על ידי התמחות בחקר הסרטן של מארי קירי פעולות של האגודה האיטלקית עבור סרטן מחקר (למקורות), ועל -ידי קי Quinquennial סרטן מחקר לאגודה. א. מ נתמכה על ידי התחברות מן המוסד הרפואי הווארד יוז.

מצב התרבות
שורת התאים hTERT RPE-1 היה תרבותי במדיום של Dulbecco ששינה נשר (טבלה של חומרים) בתוספת 10% סרום שור עוברית, 2 מ מגלוטמין ו פניצילין U/ml 100/סטרפטומיצין.... התאים היו מודגרות ב 37 ° C עם 5% CO2 בסביבת humidified. הפרוטוקול המתואר להלן פותחה על-ידי שימוש ס מ-10 מנות, כל הפרטים הטכניים דיווח לפנות את הצלחות. אם משתמש מנות שונות, גודל למעלה או למטה בהתאם.
1. סינכרון של תאי RPE-1
<ol><li>השתמש שהתאים טריים המופשרים שלא עברו יותר מ- 15 קטעים עבור כל הניסויים. יום 1, להפשיר, לוותר על ~2.5 - 5.0 x 10 תאים hTERT5 RPE-1 לתוך תבשיל תרביות רקמה ס מ-10. הוסף 8 מ של מדיום הגידול הסטנדרטי, דגירה בין לילה. לקבוע את מספר הטלפון הנייד באמצעות מונה תא סטנדרטי (כמו hemocytometer). הערה: תא צפיפות מתייחס תנאי הגידול של תאי RPE-1. תנאי הגידול עשוי להשתנות בין שורות תאים שונים; שקול לכוונן אותם בהתאם.</li>
	<li>יום 2, לסנכרן תאים בגבול G1/S על-ידי כ רפה בעברית מדיום הגידול הרגיל והוספת 8 mL בינוני המכיל תימידין 5 מ מ. הערה: תימידין הריכוז והאורך של הטיפול עשוי להשתנות על פני שורות תאים שונים. רצוי לבצע ניסויים פיילוט כדי לקבוע את התנאים הטובים ביותר עבור קווי תא להיבדק.</li>
	<li>יום 3, 24 שעות לאחר הוספת תימידין בינוני (שלב 1.2), שחרר תימידין בבלוק על-ידי כ רפה בעברית בינוני ושטיפת תאים שלוש פעמים עם 1 x PBS. הוסף 8 מ של מדיום הגידול רגילים וחוזרים צלחות החממה.</li>
</ol>2. דור של Aneuploid תאים על ידי הפרעה הפעילות של Mps1 קינאז Mitotic
<ol><li>יום 3, 6 שעות לאחר שחרורו של תימידין בלוק (צעד 1.3; זה בערך 3-6 שעות לפני התאים נכנסים מיטוזה), תשאף בינוני, לשטוף פעם עם 1 x PBS, והחלף בינוני המכיל 500 nM reversine (החומר המדכא Mps1). הערה: תאי RPE-1 להזין מיטוזה 9-12 שעות לאחר תימידין שטיפת-אאוט10,11. עם זאת, קינטיקה מחזור התא משתנים בין שורות תאים שונים. לכן, זה הכרחי לקבוע אלו קינטיקה בניסויים טייס על ידי ביצוע ניתוח מחזור התא על ידי שיטות הוקמה (למשל, על ידי מדידת ניתוח תוכן באמצעות FACS הדנ א). בנוסף, הריכוז עבודה אופטימלית של מעכבי Mps1 עשויים להשתנות בין שורות תאים. הקודם באמצעות תאים RPE1 הוכתר בהצלחה באמצעות reversine-ריכוז העבודה של 500 nM10,11,12. רצוי לבצע ניסויים פיילוט כדי לקבוע ריכוז אופטימלי עבור שורת תאים להיבדק.</li>
	<li>יום 4, 12 שעות לאחר הטיפול reversine (כ 6 שעות לאחר התאים היו מיטוזה), האחות reversine בינוני ולשטוף תאים שלוש פעמים עם 1 x PBS. להוסיף את מדיום הגידול רגיל 8 מ"ל לצלחת וחוזרים תאים החממה.</li>
</ol>3. הסרת תאים אופניים Aneuploid והעשרה מאוכלוסיית ArCK
<ol><li>ביום 6, כ 72 h לאחר תאים להזין את מיטוזה ראשונה (צעד 2.2; זה כ 66 h לאחר reversine שטיפת-אאוט, התואם בערך 2-3 מחזורי תא), תשאף בינוני, לשטוף פעם עם 1 x PBS והחלף בינוני המכיל 300 nocodazole ננומטר. הערה: עבודה אחרונים הראו כי תאי RPE-1 מחסה aneuploid karyotypes genomically לא יציבים, לעצור את התפשטות שלהם על 2-3 מחזורי תאים לאחר10הראשונות מיטוזה פגום. עם זאת, קינטיקה הזה עשוי להשתנות בין שורות תאים שונים. לכן, חשוב לבצע ניסויים פיילוט כדי לקבוע את העיתוי הנכון עבור הסרת תאים אופניים aneuploid.</li>
	<li>ביום 7, 12 שעות לאחר הטיפול nocodazole, תשאף בינונית ומוסיפים 3 מ"ל של 1 x PBS לצלחת. לנער את התאים mitotic על-ידי הקשה על הצד של הצלחת. לסובב את הצלחת בין לכל ברז כדי לאפשר גם הסרה של תאים mitotic.</li>
	<li>כדי להבטיח הסרה מלאה של תאים mitotic, חזור על התהליך לנער-off עבור מספר סיבובים (3 - 5 פעמים מומלץ), כ רפה בעברית והוספת 3 מ"ל של PBS x 1 בין כל סיבוב.</li>
	<li>לאחר טלטול-off, תשאף בעדינות כל נוזל אשר דבקה את המכסה או על הקצה של הצלחת. בקצרה, בדוק את הצלחת תחת מיקרוסקופ בהגדלה X 10. ודא כי מספר תאים mitotic שנצפו. אם יותר מ-5 תאים mitotic נראים תחת המטרה X 10, חזור על סיבוב נוסף של שייק-off. הערה: התאים Mitotic יופיע מעוגל, עשוי להיות מנותקת חלקית לאחר טלטול-off. זה חיוני להבטיח הסרה מלאה של תאים mitotic לפני חשיפת התאים לסיבוב הבא של הטיפול nocodazole. כך עשויה להוביל למוות תא mitotic ו/או לגרום הדור של תאים tetraploid.</li>
	<li>לאחר הסופי לנער-off, לשטוף תאים פעם אחת עם 5 מ של 1 x PBS. הוסף 8 מ ל בינוני המכיל 330 nocodazole ננומטר המשקולת, תקופת דגירה של 12 שעות.</li>
	<li>חזור nocodazole טיפול/שייק-off (שלבים 3.1-3.5) כל 12 שעות עד אין תאים mitotic שנצפו לאחר דגירה. בדרך כלל, 4-5 סיבובים של טיפול/שייק-לא מומלץ. הערה: המידע הניתן כאן מתייחסים תאי RPE-1. מספר סיבובים של טיפול/שייק-off עשוי להשתנות בין שורות תאים שונים. כדי למנוע חשיפה ממושכת ומיותר nocodazole זה הכרחי לקביעת בקפידה, בניסוי פיילוט, מספר סיבובים הנדרשים להסרת מלאה ויעילה של תאים אופניים aneuploid.</li>
	<li>אחרי 4-5 סיבובים של nocodazole טיפול/שייק-off (שלבים 3.1-3.6), להוסיף 10 מ של מדיום הגידול הרגיל, דגירה. מאפשרים לתאים לנוח במשך 12-24 שעות לפני השימוש מניפולציה או assay בעתיד. הערה: לאחר הסופי לנער-off, בתאי שנותרה על הצלחת מחזור התא נעצר, כפי שמוצג לאחרונה10, הנמל karyotypes מורכבים. תאים אלה מכונים תאי ArCK (Arrested עם קריוטיפ מורכבים). רצוי לבצע מבחני על אוכלוסיות ArCK בתוך שבוע של בידוד.</li>
	<li>לחלופין, כדי להעריך את אחוז תאים נעצר עם karyotypes מורכבים, לאסוף ולספור תאים כל טלטול-off באמצעות מונה תא סטנדרטי.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig1.jpg"> איור 1: בסך הכל סכמטי של השיטה המשמשת ליצירה לבודד תאים aneuploid עם מורכבות קריוטיפ (ArCK) ותמונות נציג. (א) סכמטי של ArCK תאים פרוטוקול דור ובידוד. (B) להחליפן בתמונות של תאי RPE-1 hTERT בכל שלב של הטיפול. הלוח האחרון (המתוארים באדום) מייצג את התאים ArCK מבודדים. סולם בר 100 מיקרומטר. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
4. אפיון אוכלוסיית ArCK
<ol><li>לאשר הבידוד מוצלח מאוכלוסיית ArCK על ידי ביצוע של מבחני הבאים.<ol>
<li>בטא ישבנים-צביעת (דה מרקר של הזדקנות ביולוגית) galactosidase באמצעות זמינים מסחרית קיט (ראה טבלה של חומרים).</li>
		<li>למדוד הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים, כגון CCL2, על ידי העסקת ערכות זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים).</li>
		<li>אשר רמות מוגברת של מחזור התא מעכבי p53, p21, p16 מאת המערבי כתם. הערה: לשלוט כראוי את מבחני אלה, ArCK אוכלוסיות צריך להשוות לתאים אופניים הן euploid והן aneuploid. הראשון הוא המעבר נמוך, פראי-סוג RPE-1 hTERT תאים שצומחת אקספוננציאלית. האחרון ניתן להשיג על ידי גרימת כרומוזום סגרגציה שגויה ב RPE-1 hTERT קצירת תאים 72 h לאחר מיטוזה aberrant הראשון. לשם כך, בצע את הפרוטוקול המתואר לעיל מתאי שלב 1.1 והקציר ממש לפני הטיפול nocodazole הראשון (שלב 3.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע רצף תא בודד כדי להעריך את קריוטיפ של התאים נעצר. הערה: רצף תא בודד היא שיטה מבוססת היטב כדי לקבוע שינויים כרומוזומלית ולא משנה כרומוזומלית לרוחב אוכלוסיה תא-ברמה תא בודד13. הליכים מפורטים כיצד לבצע רצף תא בודד ניתן למצוא במקום אחר10.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Santaguida, S., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-+and+long-term+effects+of+chromosome+mis-segregation+and+aneuploidy.">Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).</li><li>Pfau, S. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+instability+and+aneuploidy+in+cancer:+from+yeast+to+man.">Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man.</a> EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).</li><li>Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+aneuploidy+in+cancer.">Causes and consequences of aneuploidy in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).</li><li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boveri+revisited:+chromosomal+instability,+aneuploidy+and+tumorigenesis.">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 478-487 (2009).</li><li>Meena, J. K., Cerutti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+abrogates+aneuploidy-induced+telomere+replication+stress,+senescence+and+cell+depletion.">Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress, senescence and cell depletion.</a> The EMBO Journal. , 1-14 (2015).</li><li>Ohashi, A., Ohori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+generates+proteotoxic+stress+and+DNA+damage+concurrently+with+p53-mediated+post-mitotic+apoptosis+in+SAC-impaired+cells.">Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells.</a> Nature Communications. 6, 7668 (2015).</li><li>Passerini, V., Ozeri-Galai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+extra+chromosomes+leads+to+genomic+instability.">The presence of extra chromosomes leads to genomic instability.</a> Nature Communications. 7, 10754 (2016).</li><li>Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+drives+genomic+instability+in+yeast.">Aneuploidy drives genomic instability in yeast.</a> Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).</li><li>Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotypic+determinants+of+chromosome+instability+in+aneuploid+budding+yeast.">Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast.</a> PLoS Genetics. 8 (5), e1002719 (2012).</li><li>Santaguida, S., Richardson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Mis-segregation+Generates+Cell-Cycle-Arrested+Cells+with+Complex+Karyotypes+that+Are+Eliminated+by+the+Immune+System.">Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System.</a> Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).</li><li>Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy-induced+cellular+stresses+limit+autophagic+degradation.">Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation.</a> Genes &amp; Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).</li><li>Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+MPS1+in+chromosome+biorientation+and+the+spindle+checkpoint+through+the+small+molecule+inhibitor+reversine.">Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).</li><li>L&#243;pez-Soto, A., Gonzalez, S., L&#243;pez-Larrea, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosurveillance+of+Malignant+Cells+with+Complex+Karyotypes.">Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes.</a> Trends in cell biology. , 1-4 (2017).</li><li>Watson, E. V., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+Police+Detect+Chromosomal+Imbalance+Triggering+Immune+Crackdown!.">Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown!.</a> Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

שיטה חדשנית זו כדי ליצור ולהעשיר עבור תאים נעצר עם קומפלקס karyotypes (ArCK) מאפשר חקר התאים יש כרומוזום רווחים או הפסדים מרובים. ולהפסיק לחלק. הגדרת השיטה תוכנן כדי להקל על הבידוד של תאים ArCK בצורה מהירה ואמינה.
השלב הקריטי ביותר זה וזמינותו בקפדנות שולט על ציר הזמן של הטיפול בתרופה, והכי חשוב, הסרת תאים אופניים aneuploid. לקבלת תוצאות מיטביות, העיתוי של טיפול nocodazole ו- shake-off יש חשיבות מיוחדת כדי להבטיח כי תאים אופניים יוסרו מן הצלחת בזמן שהם עדיין מעוגל, mitotic, מונע את האפשרות של מוות של תאים mitotic או גלישה לתוך G1, יצירת פוטנציאל אוכלוסיה tetraploid. לא מומלץ כי העיתוי של שייק-off סוטה יותר משעתיים מ הדגירה המומלץ nocodazole 12-h.
מחקרים עתידיים על ArCK תאים יש את הפוטנציאל לקדם הבנה עמוקה יותר של מה מורכב karyotypes להשפיע על פיזיולוגיה של התא. בפרט, מחקר שנערך לאחרונה הראה כי תאים של המערכת החיסונית הם אינטראקציה עם, סיווג המערכת החיסונית הגורם המפעיל של ArCK תאים10. השיטה המתוארת כאן מספקת נקודת התחלה מצוינת עבור אפיון נוסף של תאים ArCK, כולל לבירור המנגנונים המולקולריים שבבסיס סיווג המערכת החיסונית תאים untransformed, המחקר של טרנספורמציה איך oncogenic ייתכן לעקוף את מנגנון מעקב זה, שאלה קריטית14,שדה15.

שגיאות בתהליך של כרומוזום סגרגציה להוביל aneuploidy, מצב המאופיין מספר כרומוזום זה אינו כפולה של3,42,1,המשלים הפלואידי. Aneuploid karyotypes על ההדק שכפול הלחץ שיוצר עוד אי יציבות גנומית5,6,7,8,9,10, מגביר קריוטיפ המורכבות, ומוביל בסופו של דבר לעצור את מחזור התא של subpopulation של תאים10. מטרת השיטה המובאת כאן היא ליצירה להפריד כזה subpopulation רכיבה על אופניים תאים. על ידי שימוש בטכניקות תרביות רקמה זולה, פרוטוקול זה מקלה על בידוד ואפיון של מחזור התא נעצר תאים aneuploid עם karyotypes מורכבים. תאים אלו נקראים תאים ArCK (Arrested עם מורכבות קריוטיפ) ואת עמיתיהם אופניים euploid כפקדים.
פרוטוקול זה הוא הראשון שהוקם למטרה זו מאפשרת הבידוד ואת המשך מחקר של קווי ArCK, כולל אך לא מוגבל, הזדקנות ביולוגית המושרה שלהם ועל פנוטיפ הזדקנות ביולוגית-הקשורים הפרשה (SASP), שלהם פרו-דלקתיים תכונות, היכולת שלהם לעסוק עם תאים חיסוניים. השיטה המוצגת כאן פותחה ב untransformed, מונצחים תאים אנושיים, אך לא נבדק עדיין בשורות סרטן. כמה תאים טרנספורמציה עשוי להיות חסר רגישות מחזור התא מעצר בשל דיכוי אחד או מספר מסלולים; לכן, נוסף אימות צריכה להתבצע בתוך שורות תאים אחרים.

<table><tbody><tr><td>DMEM (Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium)&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1859</td><td></td></tr><tr><td>Reversine</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>10004412</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1410</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p53 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p21 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6246</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p16 antibody</td><td>BD</td><td>554079</td><td></td></tr><tr><td>Senescence b-Galactosidase Staining Kit</td><td>Cell Signaling Technology&amp;nbsp;</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>ARY005B</td><td></td></tr></tbody></table>

generation and isolation of cell cycle-arrested cells with complex karyotypes

סגרגציה שגויה כרומוזום מוביל aneuploidy, מצב שבו תאים הנמל מספר כרומוזום מאוזנת. מספר קווי ראיה מציינות בחום שאנאפלואידיה הזה מעורר יציבות הגנום, בסופו של דבר ליצירת תאים עם karyotypes מורכבים זה לעצור את התפשטות שלהם. בידוד ואפיון של תאים מחסה karyotypes מורכבים מכריעים לחקור את ההשפעה של מספר כרומוזום מאוזנת על פיזיולוגיה של התא. נכון להיום, אין שיטות הוקמו באופן אמין בידוד תאי aneuploid כזה. מאמר זה מספק פרוטוקול העשרה וניתוח של תאים aneuploid karyotypes מורכבים ניצול טכניקות תרביות רקמה סטנדרטי, זולה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לנתח מספר תכונות של תאים aneuploid עם karyotypes מורכבים לרבות פנוטיפ הפרשה הזדקנות ביולוגית-הקשורים המושרה, תכונותיהם הפרו דלקתיים, ואת היכולת לתקשר עם תאים חיסוניים. כי התאים הסרטניים הנמל לעיתים קרובות חוסר איזון, כרומוזום מספר, זה הכרחי לפענח כיצד אנאפלואידיה משפיעה על פיזיולוגיה של התא בתאים נורמליים, עם המטרה הסופית של חשיפת שני tumorigenic pro אנטי השפעותיו.

שיטה זו משתמשת מערכת תרביות רקמה במבחנה כדי לבודד תאים aneuploid עם karyotypes מורכבים זה לעצור את ההתפשטות שלהם. אוכלוסייה זו נחשבת תאים ArCK (Arrested עם Karyotypes מורכבים). איור 1A מציג את הערכה של הניסוי. פראי-סוג אופניים RPE-1 hTERT תאים מסונכרנים בגבול G1/S עם תימידין, מטופלים עם מעכב Mps1 לזירוז כרומוזום סגרגציה שגויה. Nocodazole רעל ציר נוסף התאים 72 h לאחר אינדוקציה של כרומוזום סגרגציה שגויה. 12 שעות לאחר הטיפול nocodazole, התאים aneuploid כי הם עדיין מסוגלים להתרבות הזן מיטוזה, לכוד בשלב זה מחזור התא עקב הפרעה microtubule הפילמור. אלה לכודים תאים ואז מוסרות בקלות ע י טלטול עדין-off. התהליך לנער-off הוא חוזרות 3 - 5 פעמים כדי להבטיח הסרה מלאה של רכיבה על אופניים תאים. איור 1B מציג את התמונות נציג של תאי RPE-1 בכל שלב של הטיפול.
תאים ArCK להציג רמות מוגברת של מעכבי מחזור התא, כגון p53, p21 p16 לעומת euploid ו- aneuploid על אופניים תאים, כפי שמוצג באיור 2A. בנוסף, איור 2B מראה חיובי β-galactosidase מכתים בתאים ArCK לעומת תאים שליטה euploid, סמן ומבוססת על הזדקנות ביולוגית הסלולר.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig2.jpg"> איור 2: תוצאות נציג ניצול תאים ArCK. ((א)) תספיג הערכת רמות מעכב מחזור התא euploid, aneuploid על אופניים ותאים ArCK. הרמות של p53, p21 p16 נקבעו על ידי ניתוח תספיג חלבון. אקטין שימש פקד הטעינה. (B) β-galactosidase מכתים הערכת רמת הזדקנות ביולוגית בתאים ArCK. הזדקנות ביולוגית-הקשורים β-galactosidase (β-גל) פעילות נקבע ב- euploid תאים ותאים ArCK. סולם בר 100 מיקרומטר. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
מחזור התא זו מעצר הוא מאפיין בולט של תאים aneuploid עם karyotypes מורכבים, כפי שמוצג על ידי ניתוח קריוטיפ נציג של תא בודד רצף איור 3, שבו תאים ArCK להציג מרובים, כרומוזום אקראי רווחים והפסדים. ממצא זה בהסכם מלא עם דוחות קודמים10.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig3.jpg"> איור 3: נציג תא בודד רצף של תאים ArCK. פילוח חלקות המציגה של קריוטיפ 6 תאים ArCK נציג. פילוח מראים את המספר עותק של כל הכרומוזומים בין 1 ל- X ביחס הפניה euploid בקנה מידה2 יומן (סוג פראי RPE-1 הוא קו תא דיפלואידי ממוצא הנשי). כרומוזום רווחי מסומנים באדום, הפסדים כרומוזום בצבע ירוק. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes at JoVE.com

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

אנאפלואידיה מוביל לחוסר יציבות הגנום, אשר בסופו של דבר מייצר תאים בבידוד-מחזור התא עם karyotypes מורכבים. מאמר זה מספק שיטה פשוטה ונוחה לבודד תאים aneuploid עם karyotypes מורכבים זה להפסיק לחלק.

דור ובידוד של מחזור התא נעצר תאים עם Karyotypes מורכבים

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

generation-isolation-cell-cycle-arrested-cells-with-complex

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.4K Views.  Massachusetts Institute of Technology. אנאפלואידיה מוביל לחוסר יציבות הגנום, אשר בסופו של דבר מייצר תאים בבידוד-מחזור התא עם karyotypes מורכבים. מאמר זה מספק שיטה פשוטה ונוחה לבודד תאים aneuploid עם karyotypes מורכבים זה להפסיק לחלק.

Video: Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

לימוד מחזור גנים ביטוי מוסדר על ידי שני פרוטוקולי סינכרון התא

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Genetics

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum deprivation; chemicals which arrest cells at different cell cycle phases; or the use of mitotic shake-off which exploits their reduced adherence. However, all of these have disadvantages. For example, serum starvation works well for normal cells but less well for tumor cells with compromised cell cycle checkpoints due to oncogene activation or tumor suppressor loss. Similarly, chemically-treated cell populations can harbor drug-induced damage and show stress-related alterations. A technique which circumvents these problems is counterflow centrifugal elutriation (CCE), where cells are subjected to two opposing forces, centrifugal force and fluid velocity, which results in the separation of cells on the basis of size and density. Since cells advancing through the cycle typically enlarge, CCE can be used to separate cells into different cell cycle phases. Here we apply this technique to primary acute lymphoblastic leukemia cells. Under optimal conditions, an essentially pure population of cells in G1 phase and a highly enriched population of cells in G2/M phases can be obtained in excellent yield. These cell populations are ideally suited for studying cell cycle-dependent mechanisms of action of anticancer drugs and for other applications. We also show how modifications to the standard procedure can result in suboptimal performance and discuss the limitations of the technique. The detailed methodology presented should facilitate application and exploration of the technique to other types of cells.

This protocol describes the use of centrifugal elutriation to separate primary acute lymphoblastic leukemia cells into different cell cycle phases.

הכנה של תאים לוקמיה לימפובלסטית חריפה העיקרית בשלבים שונים של מחזור התא על ידי צנטריפוגלי Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Biochemistry

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Developmental Biology

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Biology

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

מדידת מחזור התא קינטיקס התקדמות עם סימון מטבוליות cytometry זרימה

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

הכנת כרומוזום מתאים בתרבית

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

תא Assay חינם לחקר הכרומטין Decondensation בסוף מיטוזה

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...