RIBO-seq olarak da adlandırılan ribozom profilleme tekniği, şu anda in vivo protein sentezi sürecini incelemek için en etkili araçtır. Bu yöntemin avantajı, ribozomların konumunu ve sayısını tam olarak haritalayarak çeviriyi izleme yeteneğidir. RIBO-seq, ribozomların mRNA molekülüne bağlanarak, ribonükleaz sindirimi üzerine transkriptin gömülü parçasını koruduğu gerçeğine dayanır.
Ribozomal ayak izleri olarak adlandırılan elde edilen parçalar, ribozomların tam konumunun belirlenmesine neden olarak, çıktıkları transkript üzerine sıralanabilir ve eşlenebilir. RIBO-seq ile eş zamanlı olarak, bir referans noktası sağlamak ve veri analizi sırasında hem RIBO-seq hem de RNA-seq'ten gelen verilerin karşılaştırılmasını sağlamak için yüksek aktarım hızı toplam mRNA dizilimi gerçekleştirilir. Hücreler hasat etmeden önce, isteğe bağlı olarak, çeviriyi engellemek için bakteri kültürüne, mililitre başına 100 mikrogramlık son konsantrasyona kloramfenikol ekleyebilirsiniz.
Kültürü antibiyotikle bir dakika kuluçkaya yatır. Çeviri inhibisyonu numune toplama süresini uzatmaya izin verdiğinden, hasat normalden daha uzun sürüyorsa bu adım önemlidir. Numuneleri önceden ısıtılmış bir filtreleme sistemi ile toplayın.
Büyüme koşullarını taklit etmek için sallamayı tanıtabilirsiniz. Tüm ortamlar zardan geçtiğinde filtrelemeyi durdurun, ancak filtrenin tamamen kurumasına izin vermeyin. Önceden ısıtılmış, dezenfekte edilmiş bir kepçe kullanarak filtre diskinin hücrelerini hızla kazıyarak bakteriyel peletleri toplayın.
Hasat edilen hücrelerle birlikte tüm kepçeyi hemen sıvı azotla dolu 50 mililitrelik tüpe yerleştirin. Hasat edilen pelet tamamen sıvı nitrojenle kaplanmalıdır. Peletin iyice donmasına izin verin ve daha önce soğutulmuş bir kepçe kullanarak donmuş hücreleri yerinden sökün.
Kapağı kapatın ve delinmiş olduğundan emin olun. Sıvı nitrojen, buharlaşma üzerine basınç değişimi nedeniyle kapalı kapların patlamasına neden olabileceği için bu önemlidir. Iysase için gmpp, DNA çubuğu ve taze Eppendorf tüpleri hazırlayın.
Gerekirse kloramfenikol ilavesi ile lizis tamponu hazırlayın. Numune başına 500 mikrolitre lizis tamponu ayrı Eppendorf tüplerine ayırın ve buza yerleştirin. Laboratuvar dezenfektanı ve% 70 etanol ile harç ve pestle dekontamine edin.
Harcın içine sıvı azot dökerek serin harç ve pestle. Donmuş bakteri peletini önceden soğutulmuş bir harç içine aktarın ve bir toz haline getirin. Yaklaşık bir hacim alüminyum oksit ekleyin ve taşlamaya devam edin.
Harcın içeriğinin çözülmesine izin vermemek için gerektiğinde sıvı azot dökerek harcı, pestleyi ve hücreleri serin tutun. Kullanmadan hemen önce, lizis tampon aliquot içine GMPPNP ve DNA çubuğu ekleyin. Çözeltiyi harcın içine aktarın ve taşlamaya devam edin.
Taşlama yaparken iysase'nin yavaşça çözülmesine izin verin. Iysase tamamen çözüldüğünde, karışımı önceden soğutulmuş Eppendorf tüpüne aktarın ve buza geri dönün. Santrifüj lysase 20,0000 G'de dört santigrat derecede beş dakika.
Süpernatantları taze, önceden soğutulmuş Eppendorf tüplerine aktarın ve buza yerleştirin. Her seyreltilmiş numunedeki RNA konsantrasyonu NanoDrop ile ölçün. Her bir lisatı RIBO-seq için 0,5 ila 1 miligram RNA ve geri kalanını RNA-seq için olmak üzere iki bölüme bölün.
RNA'nın bir miligramında, Tris pH 8'e 3,8 mikrolitre MNase ekleyin ve toplam 500 mikrolitre hacmine lizis tamponu ile üst üste yerleştirin. 25 santigrat derecede, dakikada 300 mermi, 45 dakika kuluçkaya yatır. Kuluçka tamamlandığında, numuneleri piyasada bulunan bir RNA temizleme kiti ile temizleyin.
Sekiz azı dişi üre ile %15 poliakrilamid TBE jeli hazırlayın ve TBE tamponlu bir tanka yerleştirin. 200 voltluk sabit voltajda en az 10 dakika önceden çalıştırın. Numuneleri TBE-Üre numune tamponu ile karıştırın.
Bir dakika boyunca 95 santigrat derecede denatüre edin ve hemen buza yerleştirin. Bir şırınna kullanarak jel kuyularına TBE tamponu enjekte ederek üreyi yıkayın. Her numuneyi ayırmak ve çapraz kontaminasyonu önlemek için aralarında bir kuyu boşluğu bırakarak numuneleri yükleyin.
İşaretleyici olarak 29 nükleotid uzunluğunda oligo ve 26 ve 32 nükleotid uzunluğunda oligo karışımı kullanın. Elektroforezini 180 voltluk sabit bir voltajda çalıştırın. Gecelik inkübasyon için steril tampon hazırlayın.
Elektroforez bittikten sonra jeli SYBR Gold ile lekelayın. Jelin 26 ila 32 nükleotit arasındaki parçalarını steril bir iğne veya jiletle kesin ve jel parçalarını ayrı Eppendorf tüplerine yerleştirin. Numuneler arasındaki iğneyi veya jile bıçağı değiştirin.
Her Eppendorf'a 200 mikrolitre gece kuluçka tamponu ekleyin ve numuneleri bir gecede dakikada 1000 mermi, 10 santigrat derecede kuluçkaya bırakın. Ertesi gün, numuneleri RNA temizleme kiti ile temizleyin ve 18 mikrolitre çekirdeksiz suya boşaltın. Elde edilen ribozomal ayak izleri kütüphane hazırlığı için hazırdır.
Piyasada bulunan bir kit kullanarak RNA-seq örnekleri için ribozomal RNA tükenmesi gerçekleştirin. Ardından, numuneleri RNA temizleme kiti ile temizleyin. Alkali hidrolizi aşağıdaki gibi gerçekleştirin;alkali hidroliz tamponu hazırlayın, numunenin bir hacmine bir hacim tampon ekleyin ve 25 dakika boyunca 95 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Reaksiyonun durdurulması için her numuneye beş mikrolitre 3 Molar sodyum asetat pH 5.5 ekleyin. Numuneleri RNA temizleme kiti ile temizleyin ve 18 mikrolitre çekirdeksiz suya boşaltın. Elde edilen rastgele parçalanmış RNA kütüphane hazırlığı için hazırdır.
Her numuneye 10 mikrolitre 10x reaksiyon tamponu ve beş mikrolitre T4 polinükleotid kinaz ekleyin. Bir buçuk saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yaslanın. Bu süreden sonra, bir milimolar ATP'nin üç mikrolitresini ekleyin ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Ardından, numuneleri RNA temizleme kiti ile temizleyin. Burada sağlanan protokole göre, piyasada bulunan kiti kullanarak kütüphane hazırlığı gerçekleştirin. %6 poliakrilamid jel kullanarak PAGE gerçekleştirin.
Jeli SYBR Gold ile lekele. Kütüphaneleri içeren tüketim jeli parçaları. RNA-seq örnekleri için kütüphane 135 ila 180 nükleotit, RIBO-seq için ise 135 ila 170 nükleotid arasındadır.
Steril iğneler veya jiletler kullanın ve eksiz jel parçalarını ayrı Eppendorf tüplerine yerleştirin. Numuneler arasında iğneyi veya jile bıçağı değiştirmeyi unutmayın. Her eksiz jel parçasına 100 mikrolitre çekirdeksiz su ekleyin.
Ve onları 10 santigrat derecede kuluçkaya yatır, dakikada 450 mermi, bir gecede. Ertesi gün, örnekleri DNA temizleme kiti ile temizleyin. Elde edilen kütüphaneler, yüksek hassasiyetli kalite ve miktar kontrolüne, çip üzerinde DNA elektroforezi ve daha sonra yeni nesil sıralama için hazırdır.
Elde edilen cDNA kütüphaneleri, yüksek hassasiyetli DNA çip üzerinde elektroforezi ile doğrulanan yeni nesil sıralama için gerekli olan uygun bir miktar ve kalite sunar. RIBO-seq kitaplıklarını temsil eden bantlar ve tepeler, RNA-seq kitaplıklarını temsil edene kıyasla daha dar ve daha iyi tanımlanmıştır. Çip üzerindeki elektroforezlere göre kütüphaneler beklenen merceklere sahip.
RIBO-seq kitaplıklarında bulunan 200 baz çiftine yakın ek tepeler, hazırda bekletilen ribozomları, tamamen sindirilmemiş ribozomal ayak izlerini veya rRNA gibi eserleri gösterebilir ve sıralamadan elde edilen veriler kırpıldığında ve rRNA tRNA filtrelendiğinde biyoinformatik analiz sırasında atılabilir. Kütüphane hazırlamada üretilen ortalama cDNA miktarı 32 nanogramdır ve yeni nesil sıralama için yeterli miktarda malzeme sağlar. Çipli elektroforezi ile kalite kontrolünden sonra, bir Illumina'nın NextSeq 500 platformunda tek ve 50 baz çifti dizilimi için kütüphaneler çekildi.
Adaptörlerin ve düşük kaliteli dizilerin kırpılması, RNA-seq örnekleri için örnek başına 25 ila 47 milyon okuma ve RIBO-seq örnekleri için örnek başına 25 ila 50 milyon okuma ile sonuçlandı. Elde edilen veriler FastQC ile kalite kontrolü kontrol edildi. Hem RNA-seq hem de RIBO-seq örnekleri çok kaliteli sundu.
Açıklanan protokole göre hazırlanan kütüphanelerin haritalandırılması, RNA-seq örnekleri için örnek başına 2,4 ila 9,6 milyon, RIBO-seq örnekleri için 2,3 ila 10,4 milyon benzersiz haritalı okuma sağladı. RIBO-seq verileri, RNA-seq verilerinde gözlenmeyen ribozomal ayak izlerinin başlangıç ribozomlarına ve karakteristiğine karşılık gelen üç periyodiklik ve uzun, dar bir tepe sergiler. Ayrıca, kodlama dizilerindeki ribozomal ayak izlerinin ve mRNA parçalarının ortalama kapsama profillerini gösteren çizim, beklendiği gibi RIBO-seq veri kümesindeki CDS'lerle eşlenen okumaların daha yüksek oranını ortaya koymaktadır.
Eşlenen ribozomal ayak izlerinin görselleştirilmesi, sakkaroz gradyan ultrasantrifüjasyonu ile monozomlu iyileşmeyi içeren standart RIBO-seq prosedürüne göre gerçekleştirilen aynı deneyden elde edilen sonuçlara kıyasla çok benzer desenler göstermiştir. Protokolümüz, çeviri düzenlemesini çeşitli büyüme koşullarında araştırmak için kullanılmıştır, ancak çeviri başlatma sitelerinin ve yeni protein kodlama genlerinin tespiti gibi çevirinin diğer yönlerini incelemek için uygulanabilir. Kılavuzlarımıza göre hazırlanan kütüphanelerin sıraya dizilimi, kapsamlı biyoinformatik analiz için yeterli veri ile sonuçlanır.
Burada sunduğumuz protokol hızlı, kolay ve uygun maliyetlidir ve standart laboratuvar ekipmanları ile gerçekleştirilebilir.
