Teknik destek için J. van de Gaar ve M. Vroomen (Maastricht University, Hollanda) teşekkür etmek istiyorum. Buna ek olarak, K. Verboven, D. Hansen, J. Jocken, teşekkür etmek istiyorum ve E. Blaak kan ve doku biyopsisi sağlamak için bu iletişim kuralını ve sonraki deneyler ayarlama için kullanılan.

Visseral ve subkutan örnekleri tıbbi etik Komitesi Jessa hastane, Hasselt ve Hasselt Üniversitesi, Belçika, Helsinki Deklarasyonu doğrultusunda tarafından onaylanan çalışma kayıtlı konulardan alınmıştır.
1. hazırlanması reaktifler
<ol><li>Collagenase çözüm<ol>
<li>1 g geçiyoruz Collagenase ben fosfat 10 ml serum fizyolojik (PBS, kalsiyum ve magnezyum olmadan) 100 mg/mL stok çözüm yapmak için arabelleğe alınmış. 200 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın</li>
		<li>Collagenase XI 1 g 10 ml 100 mg/mL stok çözüm yapmak için PBS çözülür. 200 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın</li>
		<li>Dnaz 10 mg dağıtılması ı yapmak a 10 mg/mL stok eriyik için PBS 10 mL. 180 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın</li>
		<li>100 µL Collagenase ekleyin ben (100 mg/mL), 100 µL Collagenase XI (100 mg/mL) ve 90 µL Dnaz 10 mL DMEM Ham'ın F12 için ben (10 mg/mL). Collagenase çözüm her yalıtım için taze olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eritrosit lizis arabellek<ol>
<li>0,84 g NH4Cl ultrasaf su 100 ml geçiyoruz.</li>
		<li>PH 7.4 kullanmadan önce ayarlayın. Bir cam şişeye 4 ° C'de depolayın</li>
		<li>Eritrosit lizis arabellek buz kullanmadan önce yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>FACS arabellek<ol>
<li>0.5 g sığır serum albumin (BSA) 100 mL % 0.5 BSA PBS elde etmek için PBS çözülür.</li>
		<li>65 mg NaN3 10 mM NaN%3 0.5 BSA PBS elde etmek için 100 mL % 0.5 BSA PBS çözülür. Bir cam şişeye 4 ° C'de çözümde mağaza</li>
		<li>Kullanmadan önce buzda yer FACS arabellek. Dikkat: NaN3 çok zehirli. Bir duman mahallede çalışma ve koruyucu gözlük ve eldiven NaN3işleme koruma için giymek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İnsan IgG blok<ol>
<li>10 mg insan IgG 10 ml 1 mg/mL elde etmek için PBS çözülür. 100 µL aliquots hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın</li>
		<li>İnsan IgG blok buz kullanmadan önce yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. izolasyon SVF AT üzerinden
<ol><li>1 g biyopsi bir 50 mL santrifüj tüpü (örneğin, Falcon tüp) bir neşter ve transferi ile küçük parçalara (± 2 mm2) kesti. Her örnek, 10 mL collagenase çözeltisi ekleyin. Not: tamamen tüp kapağını kapatın ve kapağı ¼ geri döndürmek.</li>
	<li>Nazik (60 devir/dak) sallayarak altında bir su banyosu içinde 37 ° C'de 60 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Elde edilen süspansiyon 200 µM ile filtre ve yeni bir 50 mL santrifüj tüpü örnek toplamak. 7 mL PBS filtre durulama ve tüm hücreleri elde etmek için filtre üzerine ekleyin.</li>
	<li>280 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Kayan adipocyte kesir pipetting tarafından kaldırın. Hücre Pelet SVF var. Not: SVF elde etmek için adipocyte kesir kaldırın. Çünkü bu sadece PBS ve değil kayan adiposit kaldırır tüm uç örnek batış kaçının.</li>
	<li>SVF PBS collagenase kaldırmak için süspansiyon 70 µM ile filtre, filtre 5 mL PBS ile durulayın ve 280 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi 5 ml resuspend</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve Pelet 3 mL eritrosit lizis arabellek resuspend.</li>
	<li>Buz üzerinde 5 min için kuluçkaya. PBS 7 mL kuluçka sonra ekleyin.</li>
	<li>280 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi</li>
</ol>3. boyama SVF Akış Sitometresi Analizi için
<ol><li>Hücre Pelet 90 µL 4 ° C FACS arabelleği dağıtılması ve 1 mg/mL insan IgG blok 10 µL ekleyin. Hücre süspansiyon 96 v-shape iyi plaka 2 Wells bölün. Plaka Buza koyun ve 15dk için kuluçkaya insan IgG blok izin.</li>
	<li>Yıkama ve plaka ile 280 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi için her örnek için 100 µL FACS arabellek ekleyin Süpernatant plaka baş aşağı bir düzgün hareket plaka dokunarak olmadan devrilme tarafından kaldırın. Not: kalan herhangi bir sıvı bir doku ile plaka üst plaka baş aşağı tutarak kaldırmak emin olun.</li>
	<li>Antikor kokteyller Tablo 1 ve Tablo 2' de açıklandığı gibi makrofaj ve DC alt kümeleri (FACS Masası 1) ve T ve B hücre alt kümeleri (FACS panel 2) için hazır olun. Tablo 1 ve Tablo 2 ' de anlatıldığı birimler antikor konsantrasyonları optimize sonra seçilir ve bir KDV veya uydu örnek için yeterli. Not: FACS Masası'nda 1, CD303 ve CD141 işaretleri onaylamak için bu CD11C+ CD11Bdüşük hücrelerdir DCs. Ancak, bu işaretler bir canlı/ölü boyama içerecek şekilde panelinden dışlamak için tavsiye edilir. Her iki FACS Masası 1 ve 2 CD303 panelinde 1 PE kanalı olarak hariç kullanılmayan ne zaman boyama canlı/ölü Fixable kırmızı ölü hücre leke Kit canlılığı ile kombine edilebilir. Üreticinin yönergelerine göre boyama canlılık gerçekleştirin.</li>
	<li>29,5 µL antikor FACS paneli 1 kokteyl Pelet ve 23 µL antikor FACS panel 2 kokteyl resuspend. Buz üstünde karanlıkta 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Her şey için 150 µL FACS arabellek eklemek ve ikinci bir yıkama adım gerçekleştirmek için hücre Pelet resuspend. 280 x g ve 4 ° c, 5 min için plaka santrifüj kapasitesi Süpernatant plaka baş aşağı devrilme tarafından kaldırın.</li>
	<li>150 µL % 1 formaldehit çözüm hücreleri düzeltmek için her şey için ekleyin. Hücre süspansiyon P200 pipet ile pipetting tarafından karşılık gelen FACS tüp her kuyudan aktarın. 7 gün karanlık up FACS tüpler 4 ° C'de depolayın. Not: Doğrudan ölçüm olanağı da sağlar. Her şey yerine % 1 formaldehit 150 µL FACS arabellek eklemek, karşılık gelen FACS tüpler için P200 pipet ile pipetting tarafından hücreleri aktarmak ve hücreleri analiz. Dikkat: Formaldehit çok toksiktir. Formaldehit çözümleri inhalasyon önlemek ve eldiven ve koruyucu gözlük koruma için bir duman başlıklı çalışırken hazırlayın.</li>
</ol>4. Akış Sitometresi Analizi
<ol><li>İlk ölçüm önce bir günahı negatif kontrol ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) ayarlamak için kullanın. Akış Sitometresi üretici yönergelerine göre voltaj ilgi tüm örneğin alınma olasılığını FSC ve SSC grafikte görünür ve enkaz ve canlı hücreleri arasında bir ayrım yapılabilir şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Üreticinin protokol sonrası antikor yakalama boncuk ile çok renkli tazminat çözümlemesi gerçekleştirin.</li>
	<li>Eksi bir (FMO) denetimleri floresan antikor mix yaparak hazırlamak ancak bir antikor karışımından dışarıda. 8 antikor karışımları FACS paneli 1 ve 6 antikor karışımları FACS panel 2 için oluşturma her antikor için bunu. Bu FMO antikor karışımları bu protokol için daha önce açıklandığı gibi SVF leke için kullanılır.</li>
	<li>Tüm FMO denetimleri ölçmek ve gating stratejisi FMO denetimlere dayalı ayarlayın. FMO denetimleri mümkün auto-floresan hücreleri algılamak için kullanır. Not: bir antikor karışımından kaldırarak, bu kanalda tespit herhangi bir floresan arka plan/autofluorescent sinyal düzeydir. Bu nedenle, farklı FMO karşılaştırarak FACS sonuçları denetlemek, gates belirli nüfus gatings pozitif hücreleri temel alan ve auto-floresan üzerinde temel almayan sağlanması üzerinde çizilebilir.</li>
	<li>Akış Sitometresi yerleştirerek ve ölçüm başlamadan önce 800 rpm'de girdap FACS tüpler. Not: En az 50.000 olayları canlı kapısında yeterince hücre her subpopulation ölçülür sağlamak için önerilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+immunity,+and+metabolic+disease.">Macrophages, immunity, and metabolic disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li><li>Makki, K., Froguel, P., Wolowczuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+in+obesity-related+inflammation+and+insulin+resistance:+cells,+cytokines,+and+chemokines.">Adipose tissue in obesity-related inflammation and insulin resistance: cells, cytokines, and chemokines.</a> ISRN Inflamm. 2013, 139239 (2013).</li><li>DeFuria, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+promote+inflammation+in+obesity+and+type+2+diabetes+through+regulation+of+T-cell+function+and+an+inflammatory+cytokine+profile.">B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5133-5138 (2013).</li><li>Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+transiently+infiltrate+intra-abdominal+fat+early+in+the+course+of+high-fat+feeding.">Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding.</a> J Lipid Res. 49 (9), 1894-1903 (2008).</li><li>Han, J. M., Levings, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+regulation+in+obesity-associated+adipose+inflammation.">Immune regulation in obesity-associated adipose inflammation.</a> J Immunol. 191 (2), 527-532 (2013).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+deficiency+and+pharmacological+stabilization+of+mast+cells+reduce+diet-induced+obesity+and+diabetes+in+mice.">Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice.</a> Nat Med. 15 (8), 940-945 (2009).</li><li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++effector+T+cells+contribute+to+macrophage+recruitment+and+adipose+tissue+inflammation+in+obesity.">CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity.</a> Nat Med. 15 (8), 914-920 (2009).</li><li>Koh, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+vascular+fraction+from+adipose+tissue+forms+profound+vascular+network+through+the+dynamic+reassembly+of+blood+endothelial+cells.">Stromal vascular fraction from adipose tissue forms profound vascular network through the dynamic reassembly of blood endothelial cells.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (5), 1141-1150 (2011).</li><li>Peinado, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stromal-vascular+fraction+of+adipose+tissue+contributes+to+major+differences+between+subcutaneous+and+visceral+fat+depots.">The stromal-vascular fraction of adipose tissue contributes to major differences between subcutaneous and visceral fat depots.</a> Proteomics. 10 (18), 3356-3366 (2010).</li><li>Leggate, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+inflammatory+and+prominent+proteomic+changes+in+plasma+and+adipose+tissue+after+high-intensity+intermittent+training+in+overweight+and+obese+males.">Determination of inflammatory and prominent proteomic changes in plasma and adipose tissue after high-intensity intermittent training in overweight and obese males.</a> Journal of Applied Physiology. 112 (8), 1353-1360 (2012).</li><li>Divoux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+in+human+adipose+tissue:+link+with+morbid+obesity,+inflammatory+status,+and+diabetes.">Mast cells in human adipose tissue: link with morbid obesity, inflammatory status, and diabetes.</a> J Clin Endocrinol Metab. 97 (9), E1677-E1685 (2012).</li><li>Harford, K. A., Reynolds, C. M., McGillicuddy, F. C., Roche, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fats,+inflammation+and+insulin+resistance:+insights+to+the+role+of+macrophage+and+T-cell+accumulation+in+adipose+tissue.">Fats, inflammation and insulin resistance: insights to the role of macrophage and T-cell accumulation in adipose tissue.</a> Proc Nutr Soc. 70 (4), 408-417 (2011).</li><li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+induces+a+phenotypic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization.">Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).</li><li>Morris, D. L., Singer, K., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+macrophages:+phenotypic+plasticity+and+diversity+in+lean+and+obese+states.">Adipose tissue macrophages: phenotypic plasticity and diversity in lean and obese states.</a> Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14 (4), 341-346 (2011).</li><li>Wentworth, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+CD11c+CD206++adipose+tissue+macrophages+are+associated+with+insulin+resistance+in+human+obesity.">Pro-inflammatory CD11c+CD206+ adipose tissue macrophages are associated with insulin resistance in human obesity.</a> Diabetes. 59 (7), 1648-1656 (2010).</li><li>Wouters, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+classical+monocytes+are+associated+with+CD11c++macrophages+in+human+visceral+adipose+tissue.">Circulating classical monocytes are associated with CD11c+ macrophages in human visceral adipose tissue.</a> Sci Rep. 7, 42665 (2017).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+subpopulations+characterize+acute+infection+and+chronic+inflammatory+lung+disease.">Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease.</a> J Immunol. 189 (2), 946-955 (2012).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+contributes+to+false-positive+intracellular+Foxp3+staining+in+macrophages:+a+lesson+learned+from+flow+cytometry.">Autofluorescence contributes to false-positive intracellular Foxp3 staining in macrophages: a lesson learned from flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 386 (1-2), 101-107 (2012).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Bu yöntemler KDV SVF yalıtmak anlatan ve oturdu ve bu dokularda bağışıklık hücreleri göreli miktarda ölçmek. Ayrıca, belirli hücre tipleri üzerinde işaretleri ifade belirleme yöntemleri devlet.
Akış Sitometresi doku bağışıklık hücrelerinin fenotip dokuların immünolojik devlet için güçlü bir tekniktir. Doku bağışıklık hücreleri miktar birçok uygulamaları olabilir. Sonuçlar açıklandığı gibi belirli bağışıklık hücreleri (örn, vs obez yalın) hasta grupları arasında varlığı karşılaştırmak mümkündür. Buna ek olarak, aynı zamanda Akış Sitometresi aynı hastaların kan gerçekleştirerek, dolaşan hücre ve doku hücreleri arasındaki ilişkileri araştırılması. Bu uygulama ile biz monosit dolaşan belirli bir alt pro-inflamatuar CD11C ile ilişkili olduğunu belirlemek mümkün+ yağ doku makrofajlar16.
Çok sayıda mevcut floresan antikor Akış Sitometresi çok yönlü yapmak gibi ayarlamalar açıklanan protokol uygulamaları genişleyecektir. Farklı antikorlar ile neredeyse tüm hücre tiplerinin ayırt edilebilir ve birçok işaretleri ifade tespit edilebilir. Ayrıca işaretleri intracellularly floresan antikor hücre içi bağlantısına izin için hücre zarının permeabilizing tarafından leke mümkündür. Bu özellikleri ötesinde aşırı Basitleştirilmiş M1 ve M2 makrofaj alt türlerinden çok farklı makrofaj nüfusun ayrım sağlar. Yüzey marker ifade ölçümü yanı sıra, intracellularly bilgi makrofaj işlevselliği sağlayan proteinler (Yani, sitokinler) Boyanabilen. Ayrıca, nükleer silahların yayılmasına karşı işaretleri Ki67 gibi nükleer silahların yayılmasına karşı oranları ölçmek için kullanılır. Açıklandığı gibi makrofajlar ve DCs arasında ayrım DC işaretlerinin MFI düzeylerine göre. CD68 gibi bir genel makrofaj marker makrofaj Masası (FACS panel 1) dahil edilebilir. Ancak, CD68 tercih değildir ve protokol uzanacak hücre membran intracellularly gerektiren permeabilization lekeli gerekir. Diğer makrofaj işaretleri CD163 ve CD206 veya CD11c, ikincisi burada sunulan makrofaj panelinde varlık bütünleşmek gibi alt işaretleri vardır.
Bizim FACS paneller, canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için bir işaretleyici dahil değildi çünkü o ölü hücreleri daha doğru bir dışlama FSC ve SSC kullanımı daha bırakmak hangi tercih olacaktır. Sık kullanılan DNA canlılığı boyalar propidium iyodür (PI) veya 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) yanı sıra ücretsiz Amin boya canlı/ölü Fixable ölü hücre leke kiti gibi farklı boya renk seçenekleri olan tepki boyama. Ancak, PI ve DAPI ne zaman hücreleri fixing kullanılamaz. İletişim kuralında açıklandığı gibi canlı/ölü Fixable kırmızı ölü hücre canlılığı boyama her iki panelleri strateji çoğunluğuna genel FACS etkilemeden entegre edilebilir.
Buna ek olarak, verileri canlı hücreleri tüm veri göreli anlamına gelir yüzdesi olarak ifade edilir. Yalnızca bir tam girerek, Akış Sitometresi hücre sayısı bilinen her hücre tipi tam numaraları belirlemek mümkün. Hücreleri yaklaşık bir sayısını SVF kesir hücrelerde sonra sayım sayım odası kullanarak hesaplanan. Ancak, bu sayı SVF ayırmak için kullanılan biyopsi doku miktarı için ayarlanacak olurdu, ama bu, obez için yalın karşılaştırırken sınırlamaları vardır. Onlar lipidler ile doldurulur ve büyük ölçüde genişlettik obez AT benzer bir kitle daha az adiposit oluşur. Bu bir küçümseme veya adipocyte, gram başına bağışıklık hücrelerinin sayı olarak gösterilmesini sağlar Eğer bağışıklık hücre sayının neden olabilir.
İnsan çalışmalarda hastaların eklenmesi genellikle büyük önem deneysel prosedürler standardizasyon yapmak zaman uzun bir süre içinde yapılır. Akış Sitometresi veri hastalar arasında karşılaştırma için birkaç seçenek vardır. Bu protokol için açıklandığı gibi hücreleri ölçüm analiz çeşitli örneklerinin aynı gün izin önce düzeltilebilir. Bu da onları boyama, boyama yordamı tüm örnekleri arasında eşit olarak sağlar ancak hücre canlılığı etkilenebilir önce SVF dondurarak elde edilebilir. Son olarak, Ayrıca bu çalışmada istihdam, tazminat düzeyleri yüklemek için floresan boncuk vardır ve sitometresi izleme boncuk iki haftada sitometresi günlük ölçümleri standartlaştırmak için kullanılmıştır. Bu son seçenek en verimli olur ne zaman uzun bir zaman aralığını kapsayan bir çalışma örnekleri ölçme.
Akış Sitometresi için kısıtlayıcı bir faktör genel Floresans kullanımıdır. Aynı anda tespit edilebilir floresan etiket sayısını emisyon spectra birbiri üzerine çakışması nedeniyle sınırlıdır. Ancak, akıllı FACS paneli geliştirme ve çeşitli antikor kokteyller KDV veya uydu örnek başına kullanımı ile bu sorun bu protokol için açıklandığı gibi üstesinden gelebilir. Önemli bir FACS paneli geliştirme FMO denetimleri yönüdür. Panelin bir dışında tüm antikorları kullanarak, FMO tam paneli ile karşılaştırırken potansiyel autofluorescence düzeyleri takdir edilebilir. Bu doğru nüfus çoğunluğuna izin verir ve yeni bir FACS panel ayarlarken bu yordamları yapılmalıdır. Buna ek olarak, yeni nesiller FACS cihazların en fazla 50 parametreleri aynı anda birçok özellikleri tespiti hücre başına izin algılayabilir. Hücreleri, özellikle makrofajlar autofluorescence floresan yönü ile ilgili başka bir sorun var. FACS lazer hücrelerle (özellikle ile 488 nm dalga boyu uyarma) uyarma sonra bu hücreleri floresan bir sinyal yayarlar (esas olarak < 640 nm) örtüşme antikor emisyon spectra ile etiketleri bu otelde17,18. Bunun için hesabınıza, günahı hücreleri her kanaldaki autofluorescence belirlemek için ölçülmelidir. Bu bilgiyle, fluorochromes autofluorescent sinyal aşan bir sinyal gücü görüntüleyen seçilmesi gerekir. Bu autofluorescent arka plan sinyal nüfusun gating stratejisi belirlerken dikkate alınmalıdır. Bu nedenle, bu protokolü ve akıllı FACS panel tasarım uygulama tarafından derinlik fenotip makrofaj alt içinde mümkündür. Yeni farklı AT makrofajlar ve işlevlerine ile karakterizedir.

Obezite ile düşük dereceli AT ile karakterize iltihap1 ve pro-inflamatuar bağışıklık hücreleri (KDV, oturdu), visseral ve subkutan infiltrasyonu. Pro-inflamatuar bağışıklık hücreleri KDV birikimi tip 2 diyabet2geliştirmek için birincil bir risk faktörü olan insülin direnci yol açar. Doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sisteminin bağışıklık hücreleri makrofajlar, nötrofiller, mast hücreleri gibi obez AT CD4 bulunur+ ve CD8+ T-hücre ve B-hücreleri3,4,5,6 ,7. Endotel hücreleri, stromal hücreler, adipocyte ataları, fibroblastlar ve perisitlerden, bu bağışıklık hücreleri SVF8 oluşturmaktadır ve AT9pro-inflamatuar maddeler ana kaynaktır.
AT inflamatuar durumunu yaygın olarak Western blot10, qPCR11ve immünhistokimya11gibi teknikleri tarafından araştırıldı. Ancak, bu teknikler, tüm AT, adipositler ve SVF kullanıldığında kullanılır. Bu zor tutar ve bağışıklık hücreleri AT mevcut alt kümelerine belirlemek yapar. Bağışıklık hücreleri tanımlamak ve onları, makrofajlar gibi kategorilere ayırmak için çeşitli hücre işaretleri var. Makrofajlar önemli heterojenite içinde işlev ve hücre yüzey marker ifade12i göster. Bu nedenle, sık sık iki makrofaj nüfus kategorize edilir: M1 ve M2. M2 makrofajlar genellikle alternatif olarak aktif makrofajlar12,13 denir ve yalın, metabolik olarak normal insanlar14AT bulunur. Ancak, obezite sırasında fenotipik anahtarı M2 makrofajlar M1 makrofajlar için oluşur. Bunlar klasik makrofajlar CD11C12 hızlı ve ölü adiposit taç benzeri yapıları13oluşturmak üzere birikir M1 aktif. Bu gösterilmiştir o CD11C+ AT makrofajlar insülin eylem zayıflatabilir ve obez insanlar15insülin direnci ile ilişkili. AT M1 ve M2 makrofajlar tanımlamak için immünhistokimya bir seçenektir. Bu teknik doku makrofajlar konumu hakkında bilgi verir. Ancak, bir boyama kullanılan işaretleri sayısı sınırlar. Ayrıca, ölçmek zordur. Bu nedenle, farklı bağışıklık hücre alt kümeleri KDV ve uydu mevduat araştırmak için biz bir Akış Sitometresi yaklaşım geliştirdik. Bu yaklaşım bize hücre alt kümeleri tanımlamak ve her alt AT yataklarında mevcut sayıları saymak için bir Akış Sitometresi Analizi ile hücre başına birden çok işaretçileri kullanmak için fırsat verir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich Rotanta 460R</td>
			<td>5660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)-Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco ThermoFisher</td>
			<td>31330-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7657-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0130-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01145.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06688.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;M syringe Filcons</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M filter</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>542070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block / human IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04003.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>301324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-Fitc</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-Fitc</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b-Fitc</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56-Fitc</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c-APC-Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>337218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-V500</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56-APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>318310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-PerCP-Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-APC-H7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>641400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD303-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>354204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD141-APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS-Canto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 v-shape well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>651101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS PH 7.4</td>
			<td>Gibco ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from human serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rat Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L23102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA&#160;MS 3 basic shaker</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z645028-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of immune cells in human adipose tissue by using flow cytometry

Subkutan ve viseral Yağ dokusundan (AT) mevduat bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonu tip 2 diyabet gibi obezite ile ilişkili komplikasyonların gelişmesine katkıda bulunan bir düşük dereceli iltihabı neden olur. Nicelik ve nitelik itibariyle mevduat insan bağışıklık hücre alt kümeleri araştırmak için bir Akış Sitometresi yaklaşım geliştirdik. Stromal vasküler kesir (SVF), bağışıklık hücreleri içeren subkutan ve visseral biyopsi, collagenase sindirim tarafından izole edilmiştir. Adiposit Santrifüjü sonra kaldırılır. SVF hücreleri bağışıklık hücre alt kümeleri arasında ayırt etmek için seçilen ve Akış Sitometresi kullanılarak analiz birden çok membran bağlı işaretler için lekeli. Bu yaklaşım, pro ve anti inflammatory makrofaj alt kümeleri, bir sonucu olarak dendritik hücreler (DCs), B-hücreleri, CD4+ ve CD8+ T-hücreleri, ve NK hücreleri tespit ve sayılabilir. Bu yöntem AT bağışıklık hücreleri ve her belirli alt miktarı hakkında ayrıntılı bilgi verir. Mevcut çok sayıda floresan antikor olduğundan, Akış Sitometresi yaklaşımımız çeşitli diğer hücresel ve hücre içi işaretleri ilgi ölçmek için ayarlanabilir.

KDV'den izole ve oturdu SVF Akış Sitometresi kullanılarak ölçüldü. Akış Sitometresi ölçümleri hücresel işaretleri (şekil 1A ve 1B) göre farklı hücre popülasyonlarının gösterilen araziler oluşturmak. İlk olarak, komplo tarafından ileri genişliği (FSC-W) dağılım ve toplamları daha fazla analiz tek hücre düşük FSC-W. çoğunluğuna tarafından elimine edilebilir dağılım alanı (FSC-A), hücre ileri Sonraki, canlı hücreler seçilir ve hücresel enkaz hariç, doğru boyut ve karmaşıklık FSC kullanarak hücreleri çoğunluğuna tarafından-bir ve yan dağılım alanı (SSC-A), anılan sıraya göre. Ölü hücreleri küçük ve bu nedenle ayrı bir nüfus olarak görünür küçük bir ile FSC-A. Sonraki, bağışıklık hücreleri pan-lökosit işaretçiyi CD45 (Panel 1 ve 2, şekil 1A) kullanımı ile seçildi. Diğer bağışıklık hücreleri T hücreleri gibi (CD3), B-hücreleri (CD19), nötrofiller makrofajlar analiz etmek için (CD66b+ CD11b+), ve NK hücreleri (CD56) farklı antikorlar bu hücreler hedefleme kullanarak ama aynı ile daha fazla çözümleme hariç fluorochrome. Kalan hücrelerin daha fazla alt bölümü CD11b ve CD11c ifadesine dayanıyordu. Bu aşağıdaki nüfus sonuçlandı: CD11b+ CD11c+ makrofajlar, CD11b+ CD11c- makrofajlar ve CD11bdüşük /- CD11c+ DCs (FACS Masası 1, şekil 1B). Ortalama Floresans yoğunluğu (MFI) ölçümü izin CD303 ifade miktar (plazmasitoid DC marker) ve CD141 (DC marker), CD11b üzerinde+ CD11c+ makrofajlar ve CD11bdüşük /- CD11c+ DCs. Her iki işaretleyiciyi de ifade edildi CD11b içinde daha yüksekdüşük /- CD11c+ hücreleri onaylayan bu CD11bdüşük /- CD11c+ hücreleri olduğunu DCs (şekil 1 c).
CD45+ hücreleri (şekil 1A) T-hücre ve B-hücre ayrıldı CD3 ve CD19, sırasıyla kullanarak. T-hücreleri T yardımcı hücreleri alt (CD4+) ve sitotoksik T-hücreleri (CD8+). Son olarak, CD3-CD19-hücreler NK hücreleri işaretçisi CD56 kullanarak ölçmek için çizilen (FACS panel 2, şekil 1 d). Her kapı hücre sayısı sayısal ve bütün canlı hücreler (Tablo 3) bu hücre türü yüzdesini hesaplamak için kullanılabilir.
Tüm ortalama hesaplama sağlayan her konu grubu içinde örneğin özel bir bağışıklık hücreye, Yani, pro-inflamatuar CD11b bolluk görüntüleme yağsız ya da obez erkek konular için canlı hücreler yüzdesi hesaplanabilir+ CD11c+ makrofaj visseral AT içinde (Şekil 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig1.jpg"> Şekil 1. Strateji visseral yağ dokusunun çoğunluğuna FACS. (A) FACS arsa ileri dağılım genişliği yoğunluğu (FSC-G) ve (FSC-A) tarafından bir FACS komplo takip sadece tek hücreleri (kırmızı) seçmek için bir kapı içeren ileri dağılım alan yoğunluğu ile tüm olayların (siyah) dayalı FSC-A ve yan dağılım alan yoğunluğu üzerinde (SSC-A) canlı hücreleri (açık yeşil) seçerek bir kapı içeren. Sonraki SSC-A ile arsa ve CD45 floresan yoğunluğu içeren tüm CD45 seçerek bir kapı+ (bağışıklık) hücreleri (mavi). (B) FACS CD19, CD3, CD66b ve CD56 floresan yoğunluğu CD11b floresan yoğunluğu ve CD19, CD3, CD66b ve CD56 negatif tüm hücreleri seçmek için bir kapısı (kahverengi) daha fazla nüfus lige karşı bir komplo. Sonraki komplo CD11b ve CD11c floresan yoğunluğu dayalı olarak daha fazla alt bölümü. Gates CD11b içeren görüntülenir+ CD11c+ makrofajlar (koyu yeşil), CD11b+ CD11c- makrofajlar (mor) ve CD11bdüşük /- CD11c+ dendritik hücreler (mavi). (C) CD11b tutarı+, CD11c+, veya CD11bdüşük /- CD11c+ CD303 ve CD141 ve ortalama karşılık gelen miktar için floresan yoğunluğu (x ekseni) düzeylerinin görüntüleme hücreleri (y ekseni) Floresan yoğunluğu (MFI). Önceki CD45 görüntüleme (D) FACS arsa+ için her iki CD3 T-hücreleri (macenta), B-hücreleri (koyu yeşil) ve sigara autofluorescent hücreleri (yeşil) negatif seçme gates içeren CD3 ve CD19 floresan yoğunluğu dayalı nüfus (mavi) ve CD19. Aşağıdaki çizim CD4 ve CD8 Floresans CD4 seçme gates ile dayanır+ (açık yeşil) ve CD8+ (macenta) T-hücreleri. Aynı bir perdeleme strateji deri altı yağ dokusu için kullanılır. Aynı bir perdeleme strateji deri altı yağ dokusu için kullanılır. Bu rakam Wouters vd değiştirildi 16 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57319/57319fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig2.jpg"> Şekil 2. Obez KDV içeren daha fazla pro-inflamatuar makrofajlar. CD11b miktarı+ CD11c+ makrofajlar tüm canlı hücreler yalın ve obez erkeklerin KDV yüzdesi olarak sundu. Tüm veri anlamına gelir ± SEM vardır; n = 20 için yalın ve n = 31 için obez. p ≤ 0,01 yalın vs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57319/57319fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hedef</td>
			<td>Tanım hedef</td>
			<td>Mevcut</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>Miktar</td>
			<td>Klon</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11B</td>
			<td>myeloid integrin marker</td>
			<td>granülosit, monosit/makrofajlar, dendritik hücrelerdüşük ve doğal katil hücreler</td>
			<td>BV421</td>
			<td>2.5 ΜL</td>
			<td>ICRF44</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>ortak B hücresi antijen</td>
			<td>Blastoid B hücre ve plazma B hücre için pro-B hücre b hücre gelişimi</td>
			<td>FITC</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>ortak T hücre antijen</td>
			<td>T lenfositler, doğal katil T hücreleri ve timositleri</td>
			<td>FITC</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD66B</td>
			<td>carcinoembryonic antijen (CEA) üyesi-glikoprotein ailesi gibi</td>
			<td>granülosit</td>
			<td>FITC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>G10F5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>ağır glikozile yapışma protein</td>
			<td>doğal katil hücreler ve doğal katil T hücreleri</td>
			<td>FITC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>B159</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD303</td>
			<td>tip II transmembran glikoprotein</td>
			<td>plazmasitoid dendritik hücreler</td>
			<td>PE</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>201</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD141</td>
			<td>thrombomodulin</td>
			<td>monosit/makrofajlardüşük, dendritik hücre subpopulation</td>
			<td>APC</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>M80</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C</td>
			<td>transmembran glikoprotein yazın; integrin αx</td>
			<td>monosit/makrofajlar, dendritik hücreler, granülosit, doğal katil hücreler, B ve T hücre alt grubunu</td>
			<td>APC-Cy7</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
			<td>Bu15</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>ortak lökosit antijen</td>
			<td>lenfosit, monosit, granülosit, eozinofil ve timositleri dahil olmak üzere tüm insan lökosit</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>FACS arabellek</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>7.5 µl</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Antikor için kokteyl FACS panel alt kümeleri makrofaj ve dendritik hücreler örneğin alınma olasılığını belirlemek için 1. Bir örnek analiz için açıklanan antikor miktarıdır.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hedef</td>
			<td>Tanım hedef</td>
			<td>Mevcut</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>Miktar</td>
			<td>Klon</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>ortak B hücresi antijen</td>
			<td>Blastoid B hücre ve plazma B hücre için pro-B hücre b hücre gelişimi</td>
			<td>BV421</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>ortak T hücre antijen</td>
			<td>T lenfositler, doğal katil T hücreleri ve timositleri</td>
			<td>V500</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>ağır glikozile yapışma protein</td>
			<td>doğal katil hücreler ve doğal katil T hücreleri</td>
			<td>APC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>HCD56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>Ig süper, tip ı transmembran glikoprotein</td>
			<td>T yardımcı hücresi, timositleri, monosit/makrofajlar, tip II doğal katil T hücreleri</td>
			<td>PerCP-Cy5.5</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>RPA-T4</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>Α-alt disülfür bağlı bimolecular kompleks</td>
			<td>sitotoksik T hücreleri, timositleri, doğal katil hücre alt grubunu</td>
			<td>APC-H7</td>
			<td>2 ΜL</td>
			<td>SK1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>ortak lökosit antijen</td>
			<td>lenfosit, monosit, granülosit, eozinofil ve timositleri dahil olmak üzere tüm insan lökosit</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>FACS arabellek</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10 µl</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2. Antikor için kokteyl FACS paneli 2T ve B hücre popülasyonlarının tanımlamak için. Bir örnek analiz için açıklanan antikor miktarıdır.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Makrofaj paneli</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Geçidi adı</td>
			<td># Hücreleri</td>
			<td>% canlı</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tek hücre</td>
			<td>183054</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>canlı</td>
			<td>10477</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>4100</td>
			<td>39.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>döküm-
</td>
			<td>771</td>
			<td>7,36</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C- CD11B+
</td>
			<td>430</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11B+
</td>
			<td>104</td>
			<td>0,99</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11Bdüşük /-
</td>
			<td>15</td>
			<td>0,14</td>
		</tr>
<tr>
<td>T-hücre, B-hücresi, NK hücre paneli</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Geçidi adı</td>
			<td>#Cells</td>
			<td>% canlı</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tek hücre</td>
			<td>34616</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Canlı</td>
			<td>3728</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45+
</td>
			<td>1589</td>
			<td>42.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>NK hücreleri</td>
			<td>29</td>
			<td>0.78</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3+
</td>
			<td>953</td>
			<td>25,56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4+
</td>
			<td>40'lı</td>
			<td>16.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8+
</td>
			<td>328</td>
			<td>8.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19+
</td>
			<td>20</td>
			<td>0.54</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3. Farklı hücre tipleri KDV bağışıklık Hücre bolluğu. Her kapı hücre sayısı ve farklı hücre tipleri yüzdesi dayalı canlı hücreler toplam miktarı.

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry at JoVE.com

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Bu makalede bağışıklık hücreleri yağ dokusu ve daha sonraki analiz Akış Sitometresi kullanarak yalıtım tarafından yağ dokusu bağışıklık hücre içeriğini analiz etmek için bir yöntem.

Akış Sitometresi kullanarak insan yağ dokusu içinde bağışıklık hücreleri karakterizasyonu

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

characterization-immune-cells-human-adipose-tissue-using-flow

Research

JoVE Journal

Medicine

17.3K Görüntüleme.  MUMC. Bu makalede bağışıklık hücreleri yağ dokusu ve daha sonraki analiz Akış Sitometresi kullanarak yalıtım tarafından yağ dokusu bağışıklık hücre içeriğini analiz etmek için bir yöntem.

Video: Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Tıp

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after stroke. These myeloid cell subpopulations can display different phenotypes and functions and need to be distinguished and characterized to study their regulation and contribution to tissue damage. This protocol provides two different methodologies for brain immune cell characterization: a precise stereological approach and a flow cytometric analysis. The stereological approach is based on the optical fractionator method, which calculates the total number of cells in an area of interest (infarcted brain) estimated by a systematic random sampling. The second characterization approach provides a simple way to isolate brain leukocyte suspensions and to characterize them by flow cytometry, allowing for the characterization of microglia, infiltrated monocytes and neutrophils of the ischemic tissue. In addition, it also details a cerebral ischemia model in mice that exclusively affects brain cortex, generating highly reproducible infarcts with a low rate of mortality, and the procedure for histological brain processing to characterize infarct volume by the Cavalieri method.

Brain myeloid cells characterization following stroke can be performed by stereology using the optical fractionator method, or by a flow cytometric analysis of brain leukocytes suspensions. Both are useful techniques to perform an accurate phenotypical distinction of the main myeloid cell subsets found in the ischemic brain.

Geçici veya kalıcı Serebral İskemi Modelinde lökosit alt popülasyonlarının Stereolojik ve Sitometrisi Karakterizasyonu

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Human Brown Adipose Tissue Depots Automatically Segmented by Positron Emission Tomography/Computed Tomography and Registered Magnetic Resonance Images

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in humans. Detecting BAT is typically confirmed by the uptake of the injected radioactive tracer 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) into adipose tissue depots, as measured by positron emission tomography/computed tomography (PET-CT) scans after exposing the subject to cold stimulus. Fat-water separated magnetic resonance imaging (MRI) has the ability to distinguish BAT without the use of a radioactive tracer. To date, MRI of BAT in adult humans has not been co-registered with cold-activated PET-CT. Therefore, this protocol uses 18F-FDG PET-CT scans to automatically generate a BAT mask, which is then applied to co-registered MRI scans of the same subject. This approach enables measurement of quantitative MRI properties of BAT without manual segmentation. BAT masks are created from two PET-CT scans: after exposure for 2 hr to either thermoneutral (TN) (24 &#176;C) or cold-activated (CA) (17 &#176;C) conditions. The TN and CA PET-CT scans are registered, and the PET standardized uptake and CT Hounsfield values are used to create a mask containing only BAT. CA and TN MRI scans are also acquired on the same subject and registered to the PET-CT scans in order to establish quantitative MRI properties within the automatically defined BAT mask. An advantage of this approach is that the segmentation is completely automated and is based on widely accepted methods for identification of activated BAT (PET-CT). The quantitative MRI properties of BAT established using this protocol can serve as the basis for an MRI-only BAT examination that avoids the radiation associated with PET-CT.

The method presented here uses 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) positron emission tomography/computed tomography (PET-CT) and fat-water separated magnetic resonance imaging (MRI), each scanned following 2 hr exposure to thermoneutral (24 &#176;C) and cold conditions (17 &#176;C) in order to map brown adipose tissue (BAT) in adult human subjects.

İnsan Brown Yağ Dokusu Depolar otomatik Pozitron Emisyon Tomografi / Bilgisayarlı Tomografi tarafından Parçalı ve Manyetik Rezonans Görüntüler Kayıtlı

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Yağ Dokusu Depolarında içine Nakli Enkapsülasyon termojenik Preadipositler

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. It is hypothesized that pro-atherogenic mediators released from fat tissues particularly in association with central/visceral adiposity may promote pathogenic vascular changes locally and systemically, and the notion that cardiovascular disease may be the consequence of adipose tissue dysfunction continues to evolve. Here, we describe a unique method of videomicroscopy that involves analysis of vasodilator and vasoconstrictor responses of intact small human arterioles removed from the adipose depot of living human subjects. Videomicroscopy is used to examine functional properties of isolated microvessels in response to pharmacological or physiological stimuli using a pressured system that mimics in vivo conditions. The technique is a useful approach to gain understanding of the pathophysiology and molecular mechanisms that contribute to vascular dysfunction locally within the adipose tissue milieu. Moreover, abnormalities in the adipose tissue microvasculature have also been linked with systemic diseases. We applied this technique to examine depot-specific vascular responses in obese subjects. We assessed endothelium-dependent vasodilation to both increased flow and acetylcholine in adipose arterioles (50 - 350 &#181;m internal diameter, 2 - 3 mm in length) isolated from two different adipose depots during bariatric surgery from the same individual. We demonstrated that arterioles from visceral fat exhibit impaired endothelium-dependent vasodilation compared to vessels isolated from the subcutaneous depot. The findings suggest that the visceral microenvironment is associated with vascular endothelial dysfunction which may be relevant to clinical observation linking increased visceral adiposity to systemic disease mechanisms. The videomicroscopy technique can be used to examine vascular phenotypes from different fat depots as well as compare findings across individuals with different degrees of obesity and metabolic dysfunction. The method can also be used to examine vascular responses longitudinally in response to clinical interventions.

Videomicroscopy systems are used to examine functional properties of isolated adipose tissue arterioles in response to physiological and pharmacological stimuli. This technique can be used to examine microvascular phenotypes in different adipose tissue domains in obese humans.

İnsan yağ dokusu mikrovasküler işlevini kullanarak Videomicroscopy değerlendirilmesi

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to expend energy has made it a potential target for novel therapies to ameliorate obesity and associated metabolic disorders in humans. Though this tissue has been well studied in small animals, BAT&#39;s thermogenic capacity in humans remains largely unknown due to the difficulties of measuring its volume, activity, and distribution. Identifying and quantifying active human BAT is commonly performed using 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) positron emission tomography and computed tomography (PET/CT) scans following cold-exposure or pharmacological activation. Here we describe a detailed image-analysis approach to quantify total-body human BAT from 18F-FDG PET/CT scans using an open-source software. We demonstrate the drawing of user-specified regions of interest to identify metabolically active adipose tissue while avoiding common non-BAT tissues, to measure BAT volume and activity, and to further characterize its anatomical distribution. Although this rigorous approach is time-consuming, we believe it will ultimately provide a foundation to develop future automated BAT quantification algorithms.

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Using free, open-source software, we have developed an analytical approach to quantify total and regional brown adipose tissue (BAT) volume and metabolic activity of BAT using 18F-FDG PET/CT.

18F-FDG PET/BT kullanarak yağ dokusu kahverengi tüm vücut ve bölgesel Quantification etkin insan

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent evidence indicates a potential inflammatory component of the disease, with both T-cells and monocytes/macrophages potentially associated with the pathogenesis of OA. Further studies postulated an important role for subsets of both inflammatory cell lineages, such as Th1, Th2, Th17, and T-regulatory lymphocytes, and M1, M2, and synovium-tissue-resident macrophages. However, the interaction between the local synovial and systemic inflammatory cellular response and the structural changes in the joint is unknown. To fully understand how T-cells and monocytes/macrophages contribute towards OA, it is important to be able to quantitively identify these cells and their subsets simultaneously in synovial tissue, secondary lymphatic organs and systemically (the spleen and bone marrow). Nowadays, the different inflammatory cell subsets can be identified by a combination of cell-surface markers making multi-color flow cytometry a powerful technique in investigating these cellular processes. In this protocol, we describe detailed steps regarding the harvest of synovial tissue and secondary lymphatic organs as well as generation of single cell suspensions. Furthermore, we present both an extracellular staining assay to identify monocytes/macrophages and their subsets as well as an extra- and intra-cellular staining assay to identify T-cells and their subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue. Each step of this protocol was optimized and tested, resulting in a highly reproducible assay that can be utilized for other surgical and non-surgical OA mouse models.

Here, we describe a detailed and reproducible flow cytometry protocol to identify monocyte/macrophage and T-cell subsets using both extra- and intracellular staining assays within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue, utilizing an established surgical model of murine osteoarthritis.

Bir Osteoartrit Modelinde Minör Dalak, Kemik İliği, Lenf Düğümleri ve Sinovyal DokuDaki İmmün Hücre Alt Kümelerinin Akış Sitometri Analizi

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Fat-Covered Islet Transplantation Using Epididymal White Adipose Tissue

Islet transplantation is a cellular replacement therapy for severe diabetes mellitus. The intraperitoneal cavity is typically the transplant site for this procedure. However, intraperitoneal islet transplantation has some limitations, including poor transplant efficacy, difficult graft detection ability, and a lack of graftectomy capability for post-transplant analysis. In this paper, "fat-covered islet transplantation", an intraperitoneal islet transplantation method that utilizes epididymal white adipose tissue, is used to assess the therapeutic effects of bioengineered islets. The simplicity of the method lies in the seeding of islets onto epididymal white adipose tissue and using the tissue to cover the islets. While this method can be categorized as an intraperitoneal islet transplantation technique, it shares characteristics with intra-adipose tissue islet transplantation. The fat-covered islet transplantation method demonstrates more robust therapeutic effects than intra-adipose tissue islet transplantation, however, including the improvement of blood glucose and plasma insulin levels and the potential for graft removal. We recommend the adoption of this method for assessing the mechanisms of islet engraftment into white adipose tissue and the therapeutic effects of bioengineered islets.

This fat-covered islet transplantation method is suitable for the detection of engrafted islets in the intraperitoneal cavity. Notably, it does not require the use of biobinding agents or suturing.

Epididim Beyaz Yağ Dokusu Kullanılarak Yağ Kaplı Adacık Nakli

Islet transplantation is a cellular replacement therapy for severe diabetes mellitus. The intraperitoneal cavity is typically the transplant site for this ...