我々 感謝したい j. ヴァン ・ デ ・創刊と M. Vroomen (マーストリヒト大学、オランダ) テクニカル サポートのため。さらに、k. Verboven、D. ハンセン、j. Jocken に感謝したいと思います、血液や組織生検を提供するため E. Blaak はこのプロトコルとその後の実験の設定に使用します。

内臓や皮下のサンプル」では、医療倫理委員会ジェッサ病院、ハッセルト、ヘルシンキ宣言に基づき、ベルギーのハッセルト大学によって承認された研究対象から採取しました。
1. 試薬の調製
<ol><li>コラゲナーゼの解決<ol>
<li>1 g を溶かすコラゲナーゼのリン酸塩の 10 mL で緩衝生理食塩水 (PBS、カルシウムとマグネシウムなし) 100 mg/mL の原液をします。200 μ L の因数を準備し、-20 ° C で保存</li>
		<li>コラゲナーゼ XI PBS 100 mg/mL の原液を 10 mL に 1 g を溶解します。200 μ L の因数を準備し、-20 ° C で保存</li>
		<li>DNase の 10 mg を溶解 10 mg/mL の原液に PBS の 10 mL で。180 μ 因数を準備し、-20 ° C で保存</li>
		<li>100 μ L コラゲナーゼを追加 (100 mg/mL)、100 μ L コラゲナーゼ XI (100 mg/mL)、および 90 μ L DNase I (10 mg/mL) 10 mL を DMEM ハム f12 キー。各分離の新鮮なコラゲナーゼの解決を確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>赤血球の換散バッファー<ol>
<li>0.84 g NH4Cl 100 mL の純水に溶解します。</li>
		<li>使用する前に 7.4 で pH を設定します。4 ° C でガラスのフラスコに格納します。</li>
		<li>使用前に氷の上には、赤血球の換散バッファーを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>FACS バッファー<ol>
<li>0.5 g ウシ血清アルブミン (BSA) を 0.5% BSA PBS を取得する PBS の 100 mL に溶かしてください。</li>
		<li>10 mM ナン3 0.5% BSA PBS を取得する 100 mL 0.5% BSA PBS にナン3 65 mg を溶解します。4 ° C でガラスのフラスコの中のストア ソリューション</li>
		<li>使用する前に氷の上場所 FACS バッファー。 注意: ナン3は非常に有毒です。発煙のフードで働き、安全メガネとナン3の処理中の保護のため手袋を着用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>人間の IgG ブロック<ol>
<li>10 mL の PBS 1 mg/mL を取得するにはヒト IgG の 10 mg を溶解します。100 μ L の因数を準備し、-20 ° C で保存</li>
		<li>使用する前に氷の上には、人間の IgG ブロックを配置します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. AT からの SVF の分離
<ol><li>1 g の生検で小さく切る (± 2 mm2) メスと転送 (例えばファルコン管) 50 mL 遠心管に。コラゲナーゼ溶液 10 mL を各サンプルに追加します。 注: 管の蓋を完全に閉めるし、蓋 1/4 ターンを元に戻す。</li>
	<li>穏やかな揺れ (60 サイクル/分) の下水浴の 37 ° C で 60 分間インキュベートします。</li>
	<li>200 μ M フィルター結果の懸濁液をフィルタ リングし、新しい 50 mL 遠心チューブにサンプルを収集します。フィルターを洗浄し、すべてのセルの取得フィルターの上に 7 mL の PBS を追加します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 280 x g でサンプルを遠心分離します。</li>
	<li>ピペッティングで浮動脂肪細胞分画を削除します。細胞ペレットは、SVF です。 注: は、SVF を取得する脂肪細胞分画を削除します。これだけ、PBS とフローティングの脂肪細胞ではないが削除されますので、サンプルの全体の先端を水没は避けてください。</li>
	<li>5 mL の PBS コラゲナーゼを削除、70 μ M フィルターで懸濁液をフィルタ リング、5 ml の PBS のフィルターを洗浄し、4 ° C で 5 分間 280 x g でサンプルを遠心分離機で SVF を再懸濁します</li>
	<li>上澄みを除去し、赤血球の換散バッファーの 3 mL にペレットを再懸濁します。</li>
	<li>氷の上で 5 分間インキュベートします。孵化後 7 mL の PBS を追加します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 280 x g でサンプルを遠心分離します。</li>
</ol>3. 染色 SVF のフローサイトメトリー解析
<ol><li>90 μ L 4 ° C FACS バッファー内細胞ペレットを溶解し、1 mg/mL ヒト IgG ブロックの 10 μ L を追加します。V 字 96 well プレートの 2 ウェルズに細胞懸濁液を分割します。氷の上のプレートを置き、15 分間インキュベート人間の IgG ブロックができます。</li>
	<li>各サンプルを洗浄し、遠心分離機の 4 ° C で 280 x g で 5 分間プレートに 100 μ L FACS バッファーを追加します。プレートをタップしないで 1 つの滑らかな動きで上下プレートをひっくり返すことによって上澄みを削除します。 メモ: は、プレートを逆さまに維持しながらティッシュでプレートの上から残りの液体を削除することを確認してください。</li>
	<li>表 1と表 2に記載のマクロファージと DC サブセット (FACS パネル 1) および T および B 細胞サブセット (FACS パネル 2) 抗体カクテルを準備します。表 1と表 2に記載されているボリュームは抗体濃度の最適化後に選択された、1 つの付加価値税または土のサンプルのために十分です。 注: FACS パネルで 1、使用して CD303 と CD141 マーカーを確認するその CD11C+ CD11B低細胞、Dc。ただし、ライブ/デッド染色を含むようにパネルからこれらのマーカーを除外することをお勧めします。1 と 2 両方 FACS パネルは、パネル 1 PE チャネルとしての CD303 を除くが使用されないときに染色ライブ/デッド修正赤死んだ細胞染色キット生存率と組み合わせることができます。製造元の指示に従って染色性を実行します。</li>
	<li>FACS パネル 2 のためのカクテル 23 μ L 抗体と 29.5 μ L 抗体 FACS パネル 1 のためのカクテルでペレットを再懸濁します。氷の上の暗闇の中で 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>各ウェルに 150 μ L FACS バッファーを追加し、2 番目の洗浄ステップを実行する細胞ペレットを再懸濁します。280 x g と 4 ° C で 5 分間プレートを遠心分離します。上清を削除するには、プレートを逆さまに転倒します。</li>
	<li>セルを修正する各ウェルに 150 μ L 1% ホルムアルデヒド溶液を追加します。P200 ピペットでピペッティングによる各ウェルから対応する FACS チューブに細胞懸濁液を転送します。最大 7 日間暗闇で 4 ° C で FACS チューブを格納します。 注: 直接測定も可能です。1% のホルムアルデヒドではなく各ウェルに 150 μ L FACS バッファーを追加、対応する FACS チューブに P200 ピペットでピペッティングにより細胞を転送および細胞を分析します。 注意: ホルムアルデヒドは非常に有毒です。ヒューム フード吸入を避けるために、手袋、保護のため保護メガネ着用で作業中のホルムアルデヒド溶液を準備します。</li>
</ol>4. 流れフローサイトメトリー解析
<ol><li>最初の測定の前に無染色のネガティブ コントロールを使用 (FSC) 前方散乱、側方散乱 (SSC) を設定できます。関心のすべての人口は破片と生きた細胞の区別を行うことができます、FSC と SSC のグラフに表示されるよう、製造元の指示に従って流れの cytometer の電圧を調整します。</li>
	<li>次の製造元のプロトコル抗体キャプチャ ビーズ マルチ色補正解析を行います。</li>
	<li>抗体ミックスすることによってマイナス 1 つ (FMO) コントロール蛍光を準備がミックスから 1 つの抗体を除外します。すべての抗体は、FACS パネル 1、8 抗体ミックスと FACS パネル 2 の 6 の抗体のミックスを作成するこれを行います。これらの FMO の抗体の混合物はこのプロトコルで前述した SVF を染色に使用されます。</li>
	<li>FMO のすべてのコントロールを測定し、FMO コントロールに基づいてゲーティング戦略を設定します。FMO コントロールを使用して、セルの可能な自動蛍光を検出します。 注: ミックスの 1 つの抗体を外してこのチャンネルで検出された任意の蛍光レベル背景/蛍光信号です。したがって、異なる FMO を比較することによって FACS 結果を制御、ゲート、gatings 陽性細胞に基づく、自動蛍光に基づいていないこと、特定の集団に描画できます。</li>
	<li>渦、FACS チューブ流れの cytometer でそれらを配置して、測定開始前に 800 の rpm で。 注: 十分なセルがそれぞれの亜種から測定されますを確保するためには、最低 50,000 イベント ライブのゲートでの使用をお勧めします。</li>
</ol>

<ol>
	<li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+immunity,+and+metabolic+disease.">Macrophages, immunity, and metabolic disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li><li>Makki, K., Froguel, P., Wolowczuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+in+obesity-related+inflammation+and+insulin+resistance:+cells,+cytokines,+and+chemokines.">Adipose tissue in obesity-related inflammation and insulin resistance: cells, cytokines, and chemokines.</a> ISRN Inflamm. 2013, 139239 (2013).</li><li>DeFuria, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+promote+inflammation+in+obesity+and+type+2+diabetes+through+regulation+of+T-cell+function+and+an+inflammatory+cytokine+profile.">B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5133-5138 (2013).</li><li>Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+transiently+infiltrate+intra-abdominal+fat+early+in+the+course+of+high-fat+feeding.">Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding.</a> J Lipid Res. 49 (9), 1894-1903 (2008).</li><li>Han, J. M., Levings, M. 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著者は利益相反を宣言しません。

これらのメソッドは、付加価値税からの SVF を分離する方法について説明し座って、これらの組織内にある免疫細胞の相対的な量を定量化します。さらに、メソッドは状態特定の細胞型のマーカーの発現を決定する方法です。
免疫細胞のフローサイトメトリーは、組織の免疫学的状態の表現型に強力な手法です。免疫細胞の定量化は、多くのアプリケーションを持つことができます。結果に従って、特定の免疫細胞 (例えば、肥満と無駄のない) の患者のグループの間の存在を比較することが可能です。さらに、またフローサイトメトリーを実行すると同じ患者の血液、循環細胞と細胞の間の関連を調べることができます。このアプリケーションでは、単球の循環の特定のサブセットをプロ炎症性 CD11C に関連付けられていることを確認することができました+脂肪組織マクロファージ16。
記述のプロトコルを調整多数入手可能な蛍光抗体作る cytometry 流れ非常に多彩な応用が広がります。異なった抗体とほぼすべての細胞の種類を区別できるし、多くのマーカーの発現を検出することができます。さらに、構造の蛍光抗体の細胞内結合を許可する細胞膜によって細胞内マーカーを染色することが可能です。これらの特性は、過度に簡略化された M1 と M2 マクロファージ サブタイプを超えて非常に多様な大食細胞集団の区別を許可します。表面マーカー式の測定のほか、細胞内マクロファージの機能に関する情報を提供を (すなわちサイトカイン) の蛋白質に汚すことができます。また、キ67 など増殖マーカーが増殖率を定量化する使用されます。前述のように、マクロファージと Dc の違いは DC マーカーの MFI のレベルに基づいていた。CD68 などの一般的なマクロファージ マーカーは、マクロファージ パネル (FACS パネル 1) に組み込むことができます。ただし、CD68 は望ましくないとプロトコルを拡張する細胞膜の細胞内に必要な透過を染色する必要があります。他の大食細胞のマーカーは、CD163 や CD206 CD11c、ここに提示マクロファージ パネルに統合されている後者など一部マーカーです。
私たちの FACS のパネルでライブと死んでいるセルを区別するためにマーカー含まれませんでした、FSC と SSC の使用よりも死んだ細胞のより正確な除外できるのでこれが望ましいでしょう。頻繁に使用されるが、DNA 染色性染料 propidium ヨウ化 (PI) または 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) と同様、遊離アミン反応染料ライブ/デッド修正死んだ細胞染色キットなど、別の色素の色で利用可能です。ただし、PI、DAPI は、セルを固定するときに使用できません。プロトコルに従って、LIVE/デッド修正赤死んだ細胞生存率の染色に統合できます両方のパネル全体 FACS の戦略をゲートに影響を与えずに。
さらに、データは、相対的なすべてのデータを意味生きているセルの割合として表されます。正確な入力、するだけに流れの cytometer 細胞数を知られていることは可能セル タイプごとの正確な数字を決定します。セルのおおよその数は、カウント箱を用いた SVF 分数でセルをカウント後に計算される可能性があります。この番号は生検組織、SVF を分離するために使用量を調整するだろうしかしで肥満に赤身を比較するとき、これは制限があります。満ちている脂質が大きく拡大した肥満の AT のような質量は、以下の脂肪細胞で構成されます。これは免疫細胞または脂肪細胞ごとでのグラム当たりの数として表示される場合免疫細胞数を過小評価する可能性があります。
人間の研究では、非常に重要な実験の手順の標準化を作る時間の長い期間にわたって患者の包含は通常行われます。流れ cytometry データ患者間の比較のためにいくつかのオプションがあります。このプロトコルに従って、細胞は同じ日にいくつかのサンプルの解析をできるように測定する前に修正できます。これは、すべてのサンプルの間で等しくなるようにプロシージャを汚すことができますそれらを染色には、細胞の生存率が影響を受ける前に、SVF を凍結によっても達成することができます。最後に、本研究で採用も、補正レベルをインストールする蛍光ビーズ、cytometer 追跡ビーズは、cytometer の日々 の測定を標準化する隔週を使用されました。この最後のオプションは、最も効率的な時間の長い期間に渡る研究からのサンプルの測定を行う場合。
フローサイトメトリー用の制限要因は、一般に蛍光性の使用です。同時に検出できる蛍光ラベルの数による発光スペクトルの重複制限されます。ただし、スマート FACS パネル開発と付加価値税または土サンプルごとのいくつかの抗体カクテルの使用は、このプロトコルで説明されているようこの問題を克服することができます。FACS パネル開発の重要な側面は、FMO のコントロールです。1 つを除いてパネルの全ての抗体を使用して、潜在的な自発レベルがフル パネルに FMO を比較するとき、それが理解できます。これにより、人口の正確なゲートと新しい FACS パネルを設定するときにこれらの手順を実行する必要があります。さらに、新世代の FACS デバイスはセルごとの多くの特徴の同時検出を許可する最大 50 パラメーターを検出できます。蛍光面に関連する別の問題は、特にマクロファージ細胞の蛍光です。FACS レーザによる細胞 (主に 488 nm 波長励起)、励起後これらの細胞は、蛍光シグナルを出す (主に < 640 nm) をことができる抗体の発光スペクトルと重複ラベル17,18。この点を考慮するには、無染色の細胞は各チャンネルで蛍光を決定する測定べきであります。この知識があれば、螢光色素は蛍光信号を超えると信号強度を表示するを選択してください。人口のゲーティングの戦略を決定するとき、この蛍光バック グラウンド信号考慮に入れする必要があります。したがって、このプロトコルとインテリジェント FACS パネル デザインのアプリケーションによって深度表現型マクロファージ サブタイプにすることが可能です。新しい個別でマクロファージとその機能を特徴づけることができます。

肥満の特徴は、低悪性度の AT を炎症1と (vAT、土) で内臓や皮下の炎症性免疫細胞の浸潤。付加価値税のプロ炎症性免疫細胞の蓄積はタイプ 2 の糖尿病2を開発するための主な危険因子であるインスリン抵抗性に します。CD4 肥満で、マクロファージ、肥満細胞、好中球などの自然免疫と適応免疫システムの両方の免疫細胞がある+および CD8+の T 細胞および B 細胞3,4,5,6 ,7。これらの免疫細胞、内皮細胞、間質細胞や脂肪前駆細胞、線維芽細胞、周と共に SVF8を構成するもので、AT9プロ炎症性物質の主な情報源。
西部のしみ10、qPCR11、免疫組織化学11などのテクニックで AT の炎症状態を調べた一般的.しかし、これらの技術、全体で、脂肪細胞、SVF を使用する場合、使用されます。量と免疫細胞で現在のサブセットを決定するは困難します。免疫細胞マクロファージなどに分類し、定義してさまざまな細胞のマーカーがあります。マクロファージは、機能や細胞表面マーカー式12で重要な不均一性を示します。したがって、しばしば 2 つの大食細胞集団に分けられる: M1 と M2。M2 マクロファージは通常また活性化マクロファージ12,13と呼ばれ、無駄のない代謝正常人間14AT 内に存在します。ただし、肥満の間に、M1 マクロファージに、表現型スイッチは M2 マクロファージから発生します。これらは古典的な M1 マクロファージ エクスプレス CD11C12と13クラウンのような構造を形成する死んだ脂肪細胞の周りに蓄積を活性化。それは示されているその CD11C+で、マクロファージはインスリン作用を損なうし、肥満人間15のインスリン抵抗性に関連付けられています。M1 と M2 の大食細胞を識別するために免疫組織化学はオプションです。このテクニックは、組織におけるマクロファージの場所に関する情報を与えます。ただし、1 つの染色で使用できるマーカーの数が制限されます。また、定量化することは困難ですも。そこで、vAT および土の沈殿物の異なる免疫細胞サブセットを調べるためには、流れの cytometry アプローチを開発しました。このアプローチは私たちの細胞のサブセットを定義し、各サブセットで預金の存在の数をカウントする 1 つのフローのフローサイトメトリー解析と細胞 1 個あたり複数のマーカーを使用する機会を与えます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich Rotanta 460R</td>
			<td>5660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)-Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco ThermoFisher</td>
			<td>31330-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7657-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0130-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01145.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06688.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;M syringe Filcons</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M filter</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>542070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block / human IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04003.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>301324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-Fitc</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-Fitc</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b-Fitc</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56-Fitc</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c-APC-Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>337218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-V500</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56-APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>318310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-PerCP-Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-APC-H7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>641400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD303-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>354204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD141-APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS-Canto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 v-shape well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>651101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS PH 7.4</td>
			<td>Gibco ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from human serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rat Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L23102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA&#160;MS 3 basic shaker</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z645028-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of immune cells in human adipose tissue by using flow cytometry

(に) 預金皮下脂肪および内臓脂肪組織での免疫細胞の浸潤は、2 型糖尿病などの肥満関連の合併症の開発に貢献する低悪性度の炎症につながります。定量的および定性的調査預金でヒトの免疫細胞のサブセットを流れの cytometry アプローチを開発しました。免疫細胞を含む間質血管分数 (SVF) は、コラゲナーゼの消化力によって皮下脂肪および生検で内臓から分離されます。脂肪細胞は、遠心分離後に削除されます。SVF 細胞は免疫細胞のサブセットの間で区別するために選択し、フローサイトメトリーを用いて複数の膜結合型マーカーのステンド グラスします。このアプローチは、プロおよび抗炎症の大食細胞サブセットの結果として樹状細胞 (Dc)、B 細胞、CD4+および CD8+の T 細胞、NK 細胞を検出および定量化することができます。このメソッドは、免疫細胞とそれぞれの特定のサブセットの量に関する詳細情報を提供します。利用できる多数の蛍光抗体があるので流れ cytometry 取り組みは興味の様々 なの他の細胞および細胞内マーカーを測定する調整できます。

土および付加価値税から分離された SVF は、フローサイトメトリーを用いて測定しました。流れの cytometry の測定は、細胞マーカー (図 1 aと1 b) に基づいて異なる細胞集団を示すプロットを生成します。まず、プロットすることによって転送幅 (FSC W) を散布前後散布面積 (FSC-A)、セルの集計は、低 FSC w. として単一のセルをゲートでさらに分析から除去できます。次に、ライブのセルが選択されていると細胞の残骸がゲーティング セル、正しいサイズと FSC を使用して複雑さによって除外されて- と側散布領域 (SSC-A)、それぞれ。死んだ細胞が小さく、したがって異なる人口として目に見える小さな FSC A.次に、免疫細胞は、汎白血球マーカー CD45 の使用 (パネル 1 と 2、図 1 a) が選ばれました。T 細胞サブセット (CD3) B 細胞 (CD19)、好中球など他の免疫細胞のマクロファージを分析する (CD66b+ CD11b+)、これらの細胞をターゲットと異なる抗体を用いたが、同じ NK 細胞 (CD56) がさらなる分析から除外されたと螢光色素。残りのセルのさらなる細分化は CD11b と CD11c 表現に基づいていた。これ次の人口で起因した: CD11b+ CD11c+マクロファージ、CD11b+ CD11c-マクロファージと CD11b低/- CD11c+ Dc (FACS パネル 1、図 1 b)。平均蛍光強度 (MFI) の測定を許可 CD303 の式の定量化 (形質細胞様 DC マーカー) と CD141 (DC マーカー)、CD11b の+ CD11c+マクロファージと CD11b低/- CD11c+ Dc。両方のこれらのマーカーの発現が高かった CD11b低/- CD11c+を確認する細胞その CD11b低/- CD11c+セルされた DCs (図 1)。
CD45+細胞 (図 1 a) は、T 細胞と B 細胞に分けられた CD3 と CD19、それぞれ使用しています。T 細胞は、ヘルパー T 細胞に細分された (CD4+) と細胞傷害性 T 細胞 (CD8+)。最後に、CD3-CD19-セルされた NK 細胞マーカー CD56 を使用して定量化するプロット (FACS パネル 2,図 1)。各ゲート内のセルの数は定量化され、すべての生きているセル (表 3) のこの型のセルの割合を計算する使用ことができます。
すべての平均の計算を許可する各教科科目のグループでたとえば、特定免疫細胞、すなわち、プロ炎症性の CD11b の豊かさを表示する無駄のないまたは肥満の男性の生活細胞の割合を計算できます+CD11c+内臓のマクロファージ (図 2)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig1.jpg"> 図 1。内臓脂肪組織の戦略をゲート FACS 。FSC A と側面の散布領域強度に基づいて前方散乱幅強度 (FSC W) と (FSC A) を含むのみ単一のセル選択 (赤) FACS プロットに続いてゲート前方散乱領域強度のすべてのイベント (黒) の (A) FACS プロット (SSC-A)生きているセル (ライト グリーン) を選択するゲートを含みます。次に SSC a プロット CD45 蛍光強度を含む選択すべて CD45 ゲートと+ (免疫) 細胞 (青)。(B) FACS CD11b 蛍光強度とゲート CD19、CD3、CD66b、CD56 陰性、すべてのセルを選択する (ブラウン) さらに集団に分割の CD19、CD3 や CD66b、CD56 の蛍光強度のプロット。CD11b と CD11c の蛍光強度に基づいて次のプロットにさらに細分化。CD11b を含むゲートが表示されます+ CD11c+マクロファージ (ダーク グリーン)、CD11b+ CD11c-マクロファージ (紫) と CD11b低/- CD11c+樹状細胞 (青)。(C) CD11b 量+、CD11c+または CD11b低/- CD11c+ CD303 と CD141、及び平均対応する定量化の蛍光強度 (x 軸) のレベルを表示するセル (y 軸)蛍光強度 (MFI)。以前 CD45 を表示する (D) FACS プロット+ゲートの両方 CD3 (マゼンタ) の T 細胞、B 細胞 (ダーク グリーン) と非蛍光細胞 (グリーン) 負の選択を含む CD19、CD3 の蛍光強度に基づいて人口 (ブルー)CD19。次のプロットは CD4 を選択するゲートの CD4 および CD8 の蛍光に基づいて+ (ライト グリーン) および CD8+ (マゼンタ) T 細胞。同一ゲート戦略は、皮下脂肪組織に使用されます。同一ゲート戦略は、皮下脂肪組織に使用されます。この図は、参加らから変更されています。16<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57319/57319fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig2.jpg"> 図 2。肥満の付加価値税を含むより多くのプロ炎症性マクロファージ。CD11b 量+ CD11c+リーン、肥満の男性の付加価値税のすべての生きているセルの割合として提示マクロファージ。すべてのデータは、平均 ± SEM;n = 20 リーンと n = 31 の肥満。リーン対p ≤ 0.01。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57319/57319fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ターゲット</td>
			<td>ターゲットの定義</td>
			<td>上に存在します。</td>
			<td>螢光色素</td>
			<td>数量</td>
			<td>クローン</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11B</td>
			<td>骨髄性インテグリン マーカー</td>
			<td>顆粒球、単球/マクロファージ、樹状細胞低ナチュラル キラー細胞</td>
			<td>BV421</td>
			<td>2.5 Μ L</td>
			<td>ICRF44</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>一般的な B 細胞抗原</td>
			<td>海つぼみ B 細胞と B 細胞にプロ B 細胞からの b 細胞の開発</td>
			<td>Fitc</td>
			<td>3 Μ L</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>一般的な T 細胞抗原</td>
			<td>T リンパ球、ナチュラル キラー T 細胞および胸腺細胞</td>
			<td>Fitc</td>
			<td>3 Μ L</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD66B</td>
			<td>癌胎児性抗原 (CEA) のメンバー-糖蛋白質家族のように</td>
			<td>顆粒球</td>
			<td>Fitc</td>
			<td>5 Μ L</td>
			<td>G10F5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>大きくグリコ接着タンパク質</td>
			<td>ナチュラル キラー細胞、ナチュラル キラー T 細胞</td>
			<td>Fitc</td>
			<td>5 Μ L</td>
			<td>B159</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD303</td>
			<td>タイプ II 膜貫通型糖タンパク質</td>
			<td>形質細胞様樹状細胞</td>
			<td>PE</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td>201A</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD141</td>
			<td>トロンボモジュリン</td>
			<td>単球/マクロファージ低、樹状細胞の亜集団</td>
			<td>APC</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td>M80</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C</td>
			<td>タイプ I の膜貫通型糖タンパク質。インテグリン αx</td>
			<td>単球/マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、ナチュラル キラー細胞、B および T 細胞のサブセット</td>
			<td>APC Cy7</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
			<td>Bu15</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>一般的な白血球抗原</td>
			<td>リンパ球、単球、顆粒球、好酸球、および胸腺を含むすべての人間の白血球</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>FACS バッファー</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>7.5 μ l</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 1。抗体のカクテル FACS panel サブセット マクロファージと樹状細胞集団を識別する 1.記載されている抗体の量は 1 つのサンプルの分析のためです。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ターゲット</td>
			<td>ターゲットの定義</td>
			<td>上に存在します。</td>
			<td>螢光色素</td>
			<td>数量</td>
			<td>クローン</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>一般的な B 細胞抗原</td>
			<td>海つぼみ B 細胞と B 細胞にプロ B 細胞からの b 細胞の開発</td>
			<td>BV421</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>一般的な T 細胞抗原</td>
			<td>T リンパ球、ナチュラル キラー T 細胞および胸腺細胞</td>
			<td>V500</td>
			<td>3 Μ L</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>大きくグリコ接着タンパク質</td>
			<td>ナチュラル キラー細胞、ナチュラル キラー T 細胞</td>
			<td>APC</td>
			<td>5 Μ L</td>
			<td>HCD56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>免疫グロブリンスーパーファミリー型膜貫通型糖タンパク質</td>
			<td>ヘルパー T 細胞、胸腺細胞、単球/マクロファージ、タイプ II 自然なキラー T 細胞</td>
			<td>PerCP Cy5.5</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td>RPA T4</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>ジスルフィド分子複合体の α サブユニット</td>
			<td>細胞傷害性 T 細胞、胸腺細胞、ナチュラル キラー細胞のサブセット</td>
			<td>APC H7</td>
			<td>2 Μ L</td>
			<td>SK1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>一般的な白血球抗原</td>
			<td>リンパ球、単球、顆粒球、好酸球、および胸腺を含むすべての人間の白血球</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>FACS バッファー</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10 μ l</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2。抗体のカクテル FACS パネル 2T および B 細胞の人口を識別する。記載されている抗体の量は 1 つのサンプルの分析のためです。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>マクロファージ パネル</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ゲート名</td>
			<td># セル</td>
			<td>ライブの %</td>
		</tr>
<tr>
<td>単一のセル</td>
			<td>183054</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ライブ</td>
			<td>10477</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>4100</td>
			<td>39.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>ダンプ-
</td>
			<td>771</td>
			<td>7.36</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C- CD11B+
</td>
			<td>430</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11B+
</td>
			<td>104</td>
			<td>0.99</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11B低/-
</td>
			<td>15</td>
			<td>0.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>T 細胞、B 細胞、NK 細胞パネル</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ゲート名</td>
			<td>#Cells</td>
			<td>ライブの %</td>
		</tr>
<tr>
<td>単一のセル</td>
			<td>34616</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ライブ</td>
			<td>3728</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45+
</td>
			<td>1589</td>
			<td>42.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>NK 細胞</td>
			<td>29</td>
			<td>0.78</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3+
</td>
			<td>953</td>
			<td>25.56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4+
</td>
			<td>601</td>
			<td>16.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8+
</td>
			<td>328</td>
			<td>8.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19+
</td>
			<td>20</td>
			<td>0.54</td>
		</tr>
</tbody></table>表 3。付加価値税の異なる細胞型の免疫細胞豊富。生きた細胞の総量に基づいて各ゲート内のセルの数と異なった細胞のタイプの割合。

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Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

この記事では、脂肪組織とフローサイトメトリーを使用して後続の解析から免疫細胞の分離による脂肪組織の免疫細胞の内容を分析する方法について説明します。

フローサイトメトリーを用いたひと脂肪組織での免疫細胞のキャラクタリゼーション

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

characterization-immune-cells-human-adipose-tissue-using-flow

Research

JoVE Journal

Medicine

17.3K ビュー.  MUMC. この記事では、脂肪組織とフローサイトメトリーを使用して後続の解析から免疫細胞の分離による脂肪組織の免疫細胞の内容を分析する方法について説明します。

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Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

医学

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパ​​ミン-2受容体に対する抗体を検出する

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after stroke. These myeloid cell subpopulations can display different phenotypes and functions and need to be distinguished and characterized to study their regulation and contribution to tissue damage. This protocol provides two different methodologies for brain immune cell characterization: a precise stereological approach and a flow cytometric analysis. The stereological approach is based on the optical fractionator method, which calculates the total number of cells in an area of interest (infarcted brain) estimated by a systematic random sampling. The second characterization approach provides a simple way to isolate brain leukocyte suspensions and to characterize them by flow cytometry, allowing for the characterization of microglia, infiltrated monocytes and neutrophils of the ischemic tissue. In addition, it also details a cerebral ischemia model in mice that exclusively affects brain cortex, generating highly reproducible infarcts with a low rate of mortality, and the procedure for histological brain processing to characterize infarct volume by the Cavalieri method.

Brain myeloid cells characterization following stroke can be performed by stereology using the optical fractionator method, or by a flow cytometric analysis of brain leukocytes suspensions. Both are useful techniques to perform an accurate phenotypical distinction of the main myeloid cell subsets found in the ischemic brain.

一時的または恒久的な脳虚血モデルにおける白血球亜集団の立体解析とフローサイトメトリーキャラクタリゼーション

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Human Brown Adipose Tissue Depots Automatically Segmented by Positron Emission Tomography/Computed Tomography and Registered Magnetic Resonance Images

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in humans. Detecting BAT is typically confirmed by the uptake of the injected radioactive tracer 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) into adipose tissue depots, as measured by positron emission tomography/computed tomography (PET-CT) scans after exposing the subject to cold stimulus. Fat-water separated magnetic resonance imaging (MRI) has the ability to distinguish BAT without the use of a radioactive tracer. To date, MRI of BAT in adult humans has not been co-registered with cold-activated PET-CT. Therefore, this protocol uses 18F-FDG PET-CT scans to automatically generate a BAT mask, which is then applied to co-registered MRI scans of the same subject. This approach enables measurement of quantitative MRI properties of BAT without manual segmentation. BAT masks are created from two PET-CT scans: after exposure for 2 hr to either thermoneutral (TN) (24 &#176;C) or cold-activated (CA) (17 &#176;C) conditions. The TN and CA PET-CT scans are registered, and the PET standardized uptake and CT Hounsfield values are used to create a mask containing only BAT. CA and TN MRI scans are also acquired on the same subject and registered to the PET-CT scans in order to establish quantitative MRI properties within the automatically defined BAT mask. An advantage of this approach is that the segmentation is completely automated and is based on widely accepted methods for identification of activated BAT (PET-CT). The quantitative MRI properties of BAT established using this protocol can serve as the basis for an MRI-only BAT examination that avoids the radiation associated with PET-CT.

The method presented here uses 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) positron emission tomography/computed tomography (PET-CT) and fat-water separated magnetic resonance imaging (MRI), each scanned following 2 hr exposure to thermoneutral (24 &#176;C) and cold conditions (17 &#176;C) in order to map brown adipose tissue (BAT) in adult human subjects.

人間の褐色脂肪組織デポは自動的に陽電子放射断層撮影/コンピュータ断層撮影法で区分されると磁気共鳴画像登録

Reliably differentiating brown adipose tissue (BAT) from other tissues using a non-invasive imaging method is an important step toward studying BAT in ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

移植のためのカプセル化サーモ前脂肪細胞の脂肪組織デポへ

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. It is hypothesized that pro-atherogenic mediators released from fat tissues particularly in association with central/visceral adiposity may promote pathogenic vascular changes locally and systemically, and the notion that cardiovascular disease may be the consequence of adipose tissue dysfunction continues to evolve. Here, we describe a unique method of videomicroscopy that involves analysis of vasodilator and vasoconstrictor responses of intact small human arterioles removed from the adipose depot of living human subjects. Videomicroscopy is used to examine functional properties of isolated microvessels in response to pharmacological or physiological stimuli using a pressured system that mimics in vivo conditions. The technique is a useful approach to gain understanding of the pathophysiology and molecular mechanisms that contribute to vascular dysfunction locally within the adipose tissue milieu. Moreover, abnormalities in the adipose tissue microvasculature have also been linked with systemic diseases. We applied this technique to examine depot-specific vascular responses in obese subjects. We assessed endothelium-dependent vasodilation to both increased flow and acetylcholine in adipose arterioles (50 - 350 &#181;m internal diameter, 2 - 3 mm in length) isolated from two different adipose depots during bariatric surgery from the same individual. We demonstrated that arterioles from visceral fat exhibit impaired endothelium-dependent vasodilation compared to vessels isolated from the subcutaneous depot. The findings suggest that the visceral microenvironment is associated with vascular endothelial dysfunction which may be relevant to clinical observation linking increased visceral adiposity to systemic disease mechanisms. The videomicroscopy technique can be used to examine vascular phenotypes from different fat depots as well as compare findings across individuals with different degrees of obesity and metabolic dysfunction. The method can also be used to examine vascular responses longitudinally in response to clinical interventions.

Videomicroscopy systems are used to examine functional properties of isolated adipose tissue arterioles in response to physiological and pharmacological stimuli. This technique can be used to examine microvascular phenotypes in different adipose tissue domains in obese humans.

顕微鏡を用いたひと脂肪組織血管機能評価

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to expend energy has made it a potential target for novel therapies to ameliorate obesity and associated metabolic disorders in humans. Though this tissue has been well studied in small animals, BAT&#39;s thermogenic capacity in humans remains largely unknown due to the difficulties of measuring its volume, activity, and distribution. Identifying and quantifying active human BAT is commonly performed using 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) positron emission tomography and computed tomography (PET/CT) scans following cold-exposure or pharmacological activation. Here we describe a detailed image-analysis approach to quantify total-body human BAT from 18F-FDG PET/CT scans using an open-source software. We demonstrate the drawing of user-specified regions of interest to identify metabolically active adipose tissue while avoiding common non-BAT tissues, to measure BAT volume and activity, and to further characterize its anatomical distribution. Although this rigorous approach is time-consuming, we believe it will ultimately provide a foundation to develop future automated BAT quantification algorithms.

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Using free, open-source software, we have developed an analytical approach to quantify total and regional brown adipose tissue (BAT) volume and metabolic activity of BAT using 18F-FDG PET/CT.

人間の活動の地域の定量化と全身褐色脂肪組織18F-FDG PET/CT を使用

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent evidence indicates a potential inflammatory component of the disease, with both T-cells and monocytes/macrophages potentially associated with the pathogenesis of OA. Further studies postulated an important role for subsets of both inflammatory cell lineages, such as Th1, Th2, Th17, and T-regulatory lymphocytes, and M1, M2, and synovium-tissue-resident macrophages. However, the interaction between the local synovial and systemic inflammatory cellular response and the structural changes in the joint is unknown. To fully understand how T-cells and monocytes/macrophages contribute towards OA, it is important to be able to quantitively identify these cells and their subsets simultaneously in synovial tissue, secondary lymphatic organs and systemically (the spleen and bone marrow). Nowadays, the different inflammatory cell subsets can be identified by a combination of cell-surface markers making multi-color flow cytometry a powerful technique in investigating these cellular processes. In this protocol, we describe detailed steps regarding the harvest of synovial tissue and secondary lymphatic organs as well as generation of single cell suspensions. Furthermore, we present both an extracellular staining assay to identify monocytes/macrophages and their subsets as well as an extra- and intra-cellular staining assay to identify T-cells and their subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue. Each step of this protocol was optimized and tested, resulting in a highly reproducible assay that can be utilized for other surgical and non-surgical OA mouse models.

Here, we describe a detailed and reproducible flow cytometry protocol to identify monocyte/macrophage and T-cell subsets using both extra- and intracellular staining assays within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue, utilizing an established surgical model of murine osteoarthritis.

変形性関節症モデルにおけるマウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織における免疫細胞サブセットのフローサイトメトリー解析

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Fat-Covered Islet Transplantation Using Epididymal White Adipose Tissue

Islet transplantation is a cellular replacement therapy for severe diabetes mellitus. The intraperitoneal cavity is typically the transplant site for this procedure. However, intraperitoneal islet transplantation has some limitations, including poor transplant efficacy, difficult graft detection ability, and a lack of graftectomy capability for post-transplant analysis. In this paper, "fat-covered islet transplantation", an intraperitoneal islet transplantation method that utilizes epididymal white adipose tissue, is used to assess the therapeutic effects of bioengineered islets. The simplicity of the method lies in the seeding of islets onto epididymal white adipose tissue and using the tissue to cover the islets. While this method can be categorized as an intraperitoneal islet transplantation technique, it shares characteristics with intra-adipose tissue islet transplantation. The fat-covered islet transplantation method demonstrates more robust therapeutic effects than intra-adipose tissue islet transplantation, however, including the improvement of blood glucose and plasma insulin levels and the potential for graft removal. We recommend the adoption of this method for assessing the mechanisms of islet engraftment into white adipose tissue and the therapeutic effects of bioengineered islets.

This fat-covered islet transplantation method is suitable for the detection of engrafted islets in the intraperitoneal cavity. Notably, it does not require the use of biobinding agents or suturing.

精巣上体白色脂肪組織を用いた脂肪被覆膵島移植

Islet transplantation is a cellular replacement therapy for severe diabetes mellitus. The intraperitoneal cavity is typically the transplant site for this ...