我々 感謝したい j. ヴァン ・ デ ・創刊と M. Vroomen (マーストリヒト大学、オランダ) テクニカル サポートのため。さらに、k. Verboven、D. ハンセン、j. Jocken に感謝したいと思います、血液や組織生検を提供するため E. Blaak はこのプロトコルとその後の実験の設定に使用します。

内臓や皮下のサンプル」では、医療倫理委員会ジェッサ病院、ハッセルト、ヘルシンキ宣言に基づき、ベルギーのハッセルト大学によって承認された研究対象から採取しました。
1. 試薬の調製
<ol><li>コラゲナーゼの解決<ol>
<li>1 g を溶かすコラゲナーゼのリン酸塩の 10 mL で緩衝生理食塩水 (PBS、カルシウムとマグネシウムなし) 100 mg/mL の原液をします。200 μ L の因数を準備し、-20 ° C で保存</li>
		<li>コラゲナーゼ XI PBS 100 mg/mL の原液を 10 mL に 1 g を溶解します。200 μ L の因数を準備し、-20 ° C で保存</li>
		<li>DNase の 10 mg を溶解 10 mg/mL の原液に PBS の 10 mL で。180 μ 因数を準備し、-20 ° C で保存</li>
		<li>100 μ L コラゲナーゼを追加 (100 mg/mL)、100 μ L コラゲナーゼ XI (100 mg/mL)、および 90 μ L DNase I (10 mg/mL) 10 mL を DMEM ハム f12 キー。各分離の新鮮なコラゲナーゼの解決を確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>赤血球の換散バッファー<ol>
<li>0.84 g NH4Cl 100 mL の純水に溶解します。</li>
		<li>使用する前に 7.4 で pH を設定します。4 ° C でガラスのフラスコに格納します。</li>
		<li>使用前に氷の上には、赤血球の換散バッファーを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>FACS バッファー<ol>
<li>0.5 g ウシ血清アルブミン (BSA) を 0.5% BSA PBS を取得する PBS の 100 mL に溶かしてください。</li>
		<li>10 mM ナン3 0.5% BSA PBS を取得する 100 mL 0.5% BSA PBS にナン3 65 mg を溶解します。4 ° C でガラスのフラスコの中のストア ソリューション</li>
		<li>使用する前に氷の上場所 FACS バッファー。 注意: ナン3は非常に有毒です。発煙のフードで働き、安全メガネとナン3の処理中の保護のため手袋を着用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>人間の IgG ブロック<ol>
<li>10 mL の PBS 1 mg/mL を取得するにはヒト IgG の 10 mg を溶解します。100 μ L の因数を準備し、-20 ° C で保存</li>
		<li>使用する前に氷の上には、人間の IgG ブロックを配置します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. AT からの SVF の分離
<ol><li>1 g の生検で小さく切る (± 2 mm2) メスと転送 (例えばファルコン管) 50 mL 遠心管に。コラゲナーゼ溶液 10 mL を各サンプルに追加します。 注: 管の蓋を完全に閉めるし、蓋 1/4 ターンを元に戻す。</li>
	<li>穏やかな揺れ (60 サイクル/分) の下水浴の 37 ° C で 60 分間インキュベートします。</li>
	<li>200 μ M フィルター結果の懸濁液をフィルタ リングし、新しい 50 mL 遠心チューブにサンプルを収集します。フィルターを洗浄し、すべてのセルの取得フィルターの上に 7 mL の PBS を追加します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 280 x g でサンプルを遠心分離します。</li>
	<li>ピペッティングで浮動脂肪細胞分画を削除します。細胞ペレットは、SVF です。 注: は、SVF を取得する脂肪細胞分画を削除します。これだけ、PBS とフローティングの脂肪細胞ではないが削除されますので、サンプルの全体の先端を水没は避けてください。</li>
	<li>5 mL の PBS コラゲナーゼを削除、70 μ M フィルターで懸濁液をフィルタ リング、5 ml の PBS のフィルターを洗浄し、4 ° C で 5 分間 280 x g でサンプルを遠心分離機で SVF を再懸濁します</li>
	<li>上澄みを除去し、赤血球の換散バッファーの 3 mL にペレットを再懸濁します。</li>
	<li>氷の上で 5 分間インキュベートします。孵化後 7 mL の PBS を追加します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 280 x g でサンプルを遠心分離します。</li>
</ol>3. 染色 SVF のフローサイトメトリー解析
<ol><li>90 μ L 4 ° C FACS バッファー内細胞ペレットを溶解し、1 mg/mL ヒト IgG ブロックの 10 μ L を追加します。V 字 96 well プレートの 2 ウェルズに細胞懸濁液を分割します。氷の上のプレートを置き、15 分間インキュベート人間の IgG ブロックができます。</li>
	<li>各サンプルを洗浄し、遠心分離機の 4 ° C で 280 x g で 5 分間プレートに 100 μ L FACS バッファーを追加します。プレートをタップしないで 1 つの滑らかな動きで上下プレートをひっくり返すことによって上澄みを削除します。 メモ: は、プレートを逆さまに維持しながらティッシュでプレートの上から残りの液体を削除することを確認してください。</li>
	<li>表 1と表 2に記載のマクロファージと DC サブセット (FACS パネル 1) および T および B 細胞サブセット (FACS パネル 2) 抗体カクテルを準備します。表 1と表 2に記載されているボリュームは抗体濃度の最適化後に選択された、1 つの付加価値税または土のサンプルのために十分です。 注: FACS パネルで 1、使用して CD303 と CD141 マーカーを確認するその CD11C+ CD11B低細胞、Dc。ただし、ライブ/デッド染色を含むようにパネルからこれらのマーカーを除外することをお勧めします。1 と 2 両方 FACS パネルは、パネル 1 PE チャネルとしての CD303 を除くが使用されないときに染色ライブ/デッド修正赤死んだ細胞染色キット生存率と組み合わせることができます。製造元の指示に従って染色性を実行します。</li>
	<li>FACS パネル 2 のためのカクテル 23 μ L 抗体と 29.5 μ L 抗体 FACS パネル 1 のためのカクテルでペレットを再懸濁します。氷の上の暗闇の中で 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>各ウェルに 150 μ L FACS バッファーを追加し、2 番目の洗浄ステップを実行する細胞ペレットを再懸濁します。280 x g と 4 ° C で 5 分間プレートを遠心分離します。上清を削除するには、プレートを逆さまに転倒します。</li>
	<li>セルを修正する各ウェルに 150 μ L 1% ホルムアルデヒド溶液を追加します。P200 ピペットでピペッティングによる各ウェルから対応する FACS チューブに細胞懸濁液を転送します。最大 7 日間暗闇で 4 ° C で FACS チューブを格納します。 注: 直接測定も可能です。1% のホルムアルデヒドではなく各ウェルに 150 μ L FACS バッファーを追加、対応する FACS チューブに P200 ピペットでピペッティングにより細胞を転送および細胞を分析します。 注意: ホルムアルデヒドは非常に有毒です。ヒューム フード吸入を避けるために、手袋、保護のため保護メガネ着用で作業中のホルムアルデヒド溶液を準備します。</li>
</ol>4. 流れフローサイトメトリー解析
<ol><li>最初の測定の前に無染色のネガティブ コントロールを使用 (FSC) 前方散乱、側方散乱 (SSC) を設定できます。関心のすべての人口は破片と生きた細胞の区別を行うことができます、FSC と SSC のグラフに表示されるよう、製造元の指示に従って流れの cytometer の電圧を調整します。</li>
	<li>次の製造元のプロトコル抗体キャプチャ ビーズ マルチ色補正解析を行います。</li>
	<li>抗体ミックスすることによってマイナス 1 つ (FMO) コントロール蛍光を準備がミックスから 1 つの抗体を除外します。すべての抗体は、FACS パネル 1、8 抗体ミックスと FACS パネル 2 の 6 の抗体のミックスを作成するこれを行います。これらの FMO の抗体の混合物はこのプロトコルで前述した SVF を染色に使用されます。</li>
	<li>FMO のすべてのコントロールを測定し、FMO コントロールに基づいてゲーティング戦略を設定します。FMO コントロールを使用して、セルの可能な自動蛍光を検出します。 注: ミックスの 1 つの抗体を外してこのチャンネルで検出された任意の蛍光レベル背景/蛍光信号です。したがって、異なる FMO を比較することによって FACS 結果を制御、ゲート、gatings 陽性細胞に基づく、自動蛍光に基づいていないこと、特定の集団に描画できます。</li>
	<li>渦、FACS チューブ流れの cytometer でそれらを配置して、測定開始前に 800 の rpm で。 注: 十分なセルがそれぞれの亜種から測定されますを確保するためには、最低 50,000 イベント ライブのゲートでの使用をお勧めします。</li>
</ol>

<ol>
	<li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+immunity,+and+metabolic+disease.">Macrophages, immunity, and metabolic disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li><li>Makki, K., Froguel, P., Wolowczuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+in+obesity-related+inflammation+and+insulin+resistance:+cells,+cytokines,+and+chemokines.">Adipose tissue in obesity-related inflammation and insulin resistance: cells, cytokines, and chemokines.</a> ISRN Inflamm. 2013, 139239 (2013).</li><li>DeFuria, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+promote+inflammation+in+obesity+and+type+2+diabetes+through+regulation+of+T-cell+function+and+an+inflammatory+cytokine+profile.">B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5133-5138 (2013).</li><li>Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+transiently+infiltrate+intra-abdominal+fat+early+in+the+course+of+high-fat+feeding.">Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding.</a> J Lipid Res. 49 (9), 1894-1903 (2008).</li><li>Han, J. 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著者は利益相反を宣言しません。

これらのメソッドは、付加価値税からの SVF を分離する方法について説明し座って、これらの組織内にある免疫細胞の相対的な量を定量化します。さらに、メソッドは状態特定の細胞型のマーカーの発現を決定する方法です。
免疫細胞のフローサイトメトリーは、組織の免疫学的状態の表現型に強力な手法です。免疫細胞の定量化は、多くのアプリケーションを持つことができます。結果に従って、特定の免疫細胞 (例えば、肥満と無駄のない) の患者のグループの間の存在を比較することが可能です。さらに、またフローサイトメトリーを実行すると同じ患者の血液、循環細胞と細胞の間の関連を調べることができます。このアプリケーションでは、単球の循環の特定のサブセットをプロ炎症性 CD11C に関連付けられていることを確認することができました+脂肪組織マクロファージ16。
記述のプロトコルを調整多数入手可能な蛍光抗体作る cytometry 流れ非常に多彩な応用が広がります。異なった抗体とほぼすべての細胞の種類を区別できるし、多くのマーカーの発現を検出することができます。さらに、構造の蛍光抗体の細胞内結合を許可する細胞膜によって細胞内マーカーを染色することが可能です。これらの特性は、過度に簡略化された M1 と M2 マクロファージ サブタイプを超えて非常に多様な大食細胞集団の区別を許可します。表面マーカー式の測定のほか、細胞内マクロファージの機能に関する情報を提供を (すなわちサイトカイン) の蛋白質に汚すことができます。また、キ67 など増殖マーカーが増殖率を定量化する使用されます。前述のように、マクロファージと Dc の違いは DC マーカーの MFI のレベルに基づいていた。CD68 などの一般的なマクロファージ マーカーは、マクロファージ パネル (FACS パネル 1) に組み込むことができます。ただし、CD68 は望ましくないとプロトコルを拡張する細胞膜の細胞内に必要な透過を染色する必要があります。他の大食細胞のマーカーは、CD163 や CD206 CD11c、ここに提示マクロファージ パネルに統合されている後者など一部マーカーです。
私たちの FACS のパネルでライブと死んでいるセルを区別するためにマーカー含まれませんでした、FSC と SSC の使用よりも死んだ細胞のより正確な除外できるのでこれが望ましいでしょう。頻繁に使用されるが、DNA 染色性染料 propidium ヨウ化 (PI) または 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) と同様、遊離アミン反応染料ライブ/デッド修正死んだ細胞染色キットなど、別の色素の色で利用可能です。ただし、PI、DAPI は、セルを固定するときに使用できません。プロトコルに従って、LIVE/デッド修正赤死んだ細胞生存率の染色に統合できます両方のパネル全体 FACS の戦略をゲートに影響を与えずに。
さらに、データは、相対的なすべてのデータを意味生きているセルの割合として表されます。正確な入力、するだけに流れの cytometer 細胞数を知られていることは可能セル タイプごとの正確な数字を決定します。セルのおおよその数は、カウント箱を用いた SVF 分数でセルをカウント後に計算される可能性があります。この番号は生検組織、SVF を分離するために使用量を調整するだろうしかしで肥満に赤身を比較するとき、これは制限があります。満ちている脂質が大きく拡大した肥満の AT のような質量は、以下の脂肪細胞で構成されます。これは免疫細胞または脂肪細胞ごとでのグラム当たりの数として表示される場合免疫細胞数を過小評価する可能性があります。
人間の研究では、非常に重要な実験の手順の標準化を作る時間の長い期間にわたって患者の包含は通常行われます。流れ cytometry データ患者間の比較のためにいくつかのオプションがあります。このプロトコルに従って、細胞は同じ日にいくつかのサンプルの解析をできるように測定する前に修正できます。これは、すべてのサンプルの間で等しくなるようにプロシージャを汚すことができますそれらを染色には、細胞の生存率が影響を受ける前に、SVF を凍結によっても達成することができます。最後に、本研究で採用も、補正レベルをインストールする蛍光ビーズ、cytometer 追跡ビーズは、cytometer の日々 の測定を標準化する隔週を使用されました。この最後のオプションは、最も効率的な時間の長い期間に渡る研究からのサンプルの測定を行う場合。
フローサイトメトリー用の制限要因は、一般に蛍光性の使用です。同時に検出できる蛍光ラベルの数による発光スペクトルの重複制限されます。ただし、スマート FACS パネル開発と付加価値税または土サンプルごとのいくつかの抗体カクテルの使用は、このプロトコルで説明されているようこの問題を克服することができます。FACS パネル開発の重要な側面は、FMO のコントロールです。1 つを除いてパネルの全ての抗体を使用して、潜在的な自発レベルがフル パネルに FMO を比較するとき、それが理解できます。これにより、人口の正確なゲートと新しい FACS パネルを設定するときにこれらの手順を実行する必要があります。さらに、新世代の FACS デバイスはセルごとの多くの特徴の同時検出を許可する最大 50 パラメーターを検出できます。蛍光面に関連する別の問題は、特にマクロファージ細胞の蛍光です。FACS レーザによる細胞 (主に 488 nm 波長励起)、励起後これらの細胞は、蛍光シグナルを出す (主に < 640 nm) をことができる抗体の発光スペクトルと重複ラベル17,18。この点を考慮するには、無染色の細胞は各チャンネルで蛍光を決定する測定べきであります。この知識があれば、螢光色素は蛍光信号を超えると信号強度を表示するを選択してください。人口のゲーティングの戦略を決定するとき、この蛍光バック グラウンド信号考慮に入れする必要があります。したがって、このプロトコルとインテリジェント FACS パネル デザインのアプリケーションによって深度表現型マクロファージ サブタイプにすることが可能です。新しい個別でマクロファージとその機能を特徴づけることができます。

肥満の特徴は、低悪性度の AT を炎症1と (vAT、土) で内臓や皮下の炎症性免疫細胞の浸潤。付加価値税のプロ炎症性免疫細胞の蓄積はタイプ 2 の糖尿病2を開発するための主な危険因子であるインスリン抵抗性に します。CD4 肥満で、マクロファージ、肥満細胞、好中球などの自然免疫と適応免疫システムの両方の免疫細胞がある+および CD8+の T 細胞および B 細胞3,4,5,6 ,7。これらの免疫細胞、内皮細胞、間質細胞や脂肪前駆細胞、線維芽細胞、周と共に SVF8を構成するもので、AT9プロ炎症性物質の主な情報源。
西部のしみ10、qPCR11、免疫組織化学11などのテクニックで AT の炎症状態を調べた一般的.しかし、これらの技術、全体で、脂肪細胞、SVF を使用する場合、使用されます。量と免疫細胞で現在のサブセットを決定するは困難します。免疫細胞マクロファージなどに分類し、定義してさまざまな細胞のマーカーがあります。マクロファージは、機能や細胞表面マーカー式12で重要な不均一性を示します。したがって、しばしば 2 つの大食細胞集団に分けられる: M1 と M2。M2 マクロファージは通常また活性化マクロファージ12,13と呼ばれ、無駄のない代謝正常人間14AT 内に存在します。ただし、肥満の間に、M1 マクロファージに、表現型スイッチは M2 マクロファージから発生します。これらは古典的な M1 マクロファージ エクスプレス CD11C12と13クラウンのような構造を形成する死んだ脂肪細胞の周りに蓄積を活性化。それは示されているその CD11C+で、マクロファージはインスリン作用を損なうし、肥満人間15のインスリン抵抗性に関連付けられています。M1 と M2 の大食細胞を識別するために免疫組織化学はオプションです。このテクニックは、組織におけるマクロファージの場所に関する情報を与えます。ただし、1 つの染色で使用できるマーカーの数が制限されます。また、定量化することは困難ですも。そこで、vAT および土の沈殿物の異なる免疫細胞サブセットを調べるためには、流れの cytometry アプローチを開発しました。このアプローチは私たちの細胞のサブセットを定義し、各サブセットで預金の存在の数をカウントする 1 つのフローのフローサイトメトリー解析と細胞 1 個あたり複数のマーカーを使用する機会を与えます。

<table><tbody><tr><td>Centrifuge</td><td>Hettich Rotanta 460R</td><td>5660</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)-Ham&amp;rsquo;s F12</td><td>Gibco ThermoFisher</td><td>31330-095</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7657-1g</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130-1g</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I from bovine pancreas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Merck</td><td>1.01145.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503-100</td><td></td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>1.06688.0100</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;M syringe Filcons</td><td>BD Biosciences</td><td>340613</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;M filter</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>Fc block / human IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14506</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Merck</td><td>1.04003.2500</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BV421</td><td>Biolegend</td><td>301324</td><td></td></tr><tr><td>CD19-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>555412</td><td></td></tr><tr><td>CD3-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>561807</td><td></td></tr><tr><td>CD66b-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>555724</td><td></td></tr><tr><td>CD56-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>562794</td><td></td></tr><tr><td>CD11c-APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>337218</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>CD19-BV421</td><td>Biolegend</td><td>302234</td><td></td></tr><tr><td>CD3-V500</td><td>BD Biosciences</td><td>561416</td><td></td></tr><tr><td>CD56-APC</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td></td></tr><tr><td>CD4-PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300528</td><td></td></tr><tr><td>CD8-APC-H7</td><td>BD Biosciences</td><td>641400</td><td></td></tr><tr><td>CD303-PE</td><td>Biolegend</td><td>354204</td><td></td></tr><tr><td>CD141-APC</td><td>Biolegend</td><td>344106</td><td></td></tr><tr><td>FACS-Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 v-shape well plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651101</td><td></td></tr><tr><td>PBS PH 7.4</td><td>Gibco ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube</td><td>Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>IgG from human serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I4506</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rat Ig, &amp;kappa;/Negative Control Compensation Particles Set</td><td>BD Biosciences</td><td>552844</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ig, &amp;kappa;/Negative Control Compensation Particles Set</td><td>BD Biosciences</td><td>552843</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>L23102</td><td></td></tr><tr><td>IKA&amp;nbsp;MS 3 basic shaker</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z645028-1EA</td><td></td></tr></tbody></table>

characterization of immune cells in human adipose tissue by using flow cytometry

(に) 預金皮下脂肪および内臓脂肪組織での免疫細胞の浸潤は、2 型糖尿病などの肥満関連の合併症の開発に貢献する低悪性度の炎症につながります。定量的および定性的調査預金でヒトの免疫細胞のサブセットを流れの cytometry アプローチを開発しました。免疫細胞を含む間質血管分数 (SVF) は、コラゲナーゼの消化力によって皮下脂肪および生検で内臓から分離されます。脂肪細胞は、遠心分離後に削除されます。SVF 細胞は免疫細胞のサブセットの間で区別するために選択し、フローサイトメトリーを用いて複数の膜結合型マーカーのステンド グラスします。このアプローチは、プロおよび抗炎症の大食細胞サブセットの結果として樹状細胞 (Dc)、B 細胞、CD4+および CD8+の T 細胞、NK 細胞を検出および定量化することができます。このメソッドは、免疫細胞とそれぞれの特定のサブセットの量に関する詳細情報を提供します。利用できる多数の蛍光抗体があるので流れ cytometry 取り組みは興味の様々 なの他の細胞および細胞内マーカーを測定する調整できます。

土および付加価値税から分離された SVF は、フローサイトメトリーを用いて測定しました。流れの cytometry の測定は、細胞マーカー (図 1 aと1 b) に基づいて異なる細胞集団を示すプロットを生成します。まず、プロットすることによって転送幅 (FSC W) を散布前後散布面積 (FSC-A)、セルの集計は、低 FSC w. として単一のセルをゲートでさらに分析から除去できます。次に、ライブのセルが選択されていると細胞の残骸がゲーティング セル、正しいサイズと FSC を使用して複雑さによって除外されて- と側散布領域 (SSC-A)、それぞれ。死んだ細胞が小さく、したがって異なる人口として目に見える小さな FSC A.次に、免疫細胞は、汎白血球マーカー CD45 の使用 (パネル 1 と 2、図 1 a) が選ばれました。T 細胞サブセット (CD3) B 細胞 (CD19)、好中球など他の免疫細胞のマクロファージを分析する (CD66b+ CD11b+)、これらの細胞をターゲットと異なる抗体を用いたが、同じ NK 細胞 (CD56) がさらなる分析から除外されたと螢光色素。残りのセルのさらなる細分化は CD11b と CD11c 表現に基づいていた。これ次の人口で起因した: CD11b+ CD11c+マクロファージ、CD11b+ CD11c-マクロファージと CD11b低/- CD11c+ Dc (FACS パネル 1、図 1 b)。平均蛍光強度 (MFI) の測定を許可 CD303 の式の定量化 (形質細胞様 DC マーカー) と CD141 (DC マーカー)、CD11b の+ CD11c+マクロファージと CD11b低/- CD11c+ Dc。両方のこれらのマーカーの発現が高かった CD11b低/- CD11c+を確認する細胞その CD11b低/- CD11c+セルされた DCs (図 1)。
CD45+細胞 (図 1 a) は、T 細胞と B 細胞に分けられた CD3 と CD19、それぞれ使用しています。T 細胞は、ヘルパー T 細胞に細分された (CD4+) と細胞傷害性 T 細胞 (CD8+)。最後に、CD3-CD19-セルされた NK 細胞マーカー CD56 を使用して定量化するプロット (FACS パネル 2,図 1)。各ゲート内のセルの数は定量化され、すべての生きているセル (表 3) のこの型のセルの割合を計算する使用ことができます。
すべての平均の計算を許可する各教科科目のグループでたとえば、特定免疫細胞、すなわち、プロ炎症性の CD11b の豊かさを表示する無駄のないまたは肥満の男性の生活細胞の割合を計算できます+CD11c+内臓のマクロファージ (図 2)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig1.jpg"> 図 1。内臓脂肪組織の戦略をゲート FACS 。FSC A と側面の散布領域強度に基づいて前方散乱幅強度 (FSC W) と (FSC A) を含むのみ単一のセル選択 (赤) FACS プロットに続いてゲート前方散乱領域強度のすべてのイベント (黒) の (A) FACS プロット (SSC-A)生きているセル (ライト グリーン) を選択するゲートを含みます。次に SSC a プロット CD45 蛍光強度を含む選択すべて CD45 ゲートと+ (免疫) 細胞 (青)。(B) FACS CD11b 蛍光強度とゲート CD19、CD3、CD66b、CD56 陰性、すべてのセルを選択する (ブラウン) さらに集団に分割の CD19、CD3 や CD66b、CD56 の蛍光強度のプロット。CD11b と CD11c の蛍光強度に基づいて次のプロットにさらに細分化。CD11b を含むゲートが表示されます+ CD11c+マクロファージ (ダーク グリーン)、CD11b+ CD11c-マクロファージ (紫) と CD11b低/- CD11c+樹状細胞 (青)。(C) CD11b 量+、CD11c+または CD11b低/- CD11c+ CD303 と CD141、及び平均対応する定量化の蛍光強度 (x 軸) のレベルを表示するセル (y 軸)蛍光強度 (MFI)。以前 CD45 を表示する (D) FACS プロット+ゲートの両方 CD3 (マゼンタ) の T 細胞、B 細胞 (ダーク グリーン) と非蛍光細胞 (グリーン) 負の選択を含む CD19、CD3 の蛍光強度に基づいて人口 (ブルー)CD19。次のプロットは CD4 を選択するゲートの CD4 および CD8 の蛍光に基づいて+ (ライト グリーン) および CD8+ (マゼンタ) T 細胞。同一ゲート戦略は、皮下脂肪組織に使用されます。同一ゲート戦略は、皮下脂肪組織に使用されます。この図は、参加らから変更されています。16<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57319/57319fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig2.jpg"> 図 2。肥満の付加価値税を含むより多くのプロ炎症性マクロファージ。CD11b 量+ CD11c+リーン、肥満の男性の付加価値税のすべての生きているセルの割合として提示マクロファージ。すべてのデータは、平均 ± SEM;n = 20 リーンと n = 31 の肥満。リーン対p ≤ 0.01。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57319/57319fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ターゲット</td>
			<td>ターゲットの定義</td>
			<td>上に存在します。</td>
			<td>螢光色素</td>
			<td>数量</td>
			<td>クローン</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11B</td>
			<td>骨髄性インテグリン マーカー</td>
			<td>顆粒球、単球/マクロファージ、樹状細胞低ナチュラル キラー細胞</td>
			<td>BV421</td>
			<td>2.5 Μ L</td>
			<td>ICRF44</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>一般的な B 細胞抗原</td>
			<td>海つぼみ B 細胞と B 細胞にプロ B 細胞からの b 細胞の開発</td>
			<td>Fitc</td>
			<td>3 Μ L</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>一般的な T 細胞抗原</td>
			<td>T リンパ球、ナチュラル キラー T 細胞および胸腺細胞</td>
			<td>Fitc</td>
			<td>3 Μ L</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD66B</td>
			<td>癌胎児性抗原 (CEA) のメンバー-糖蛋白質家族のように</td>
			<td>顆粒球</td>
			<td>Fitc</td>
			<td>5 Μ L</td>
			<td>G10F5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>大きくグリコ接着タンパク質</td>
			<td>ナチュラル キラー細胞、ナチュラル キラー T 細胞</td>
			<td>Fitc</td>
			<td>5 Μ L</td>
			<td>B159</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD303</td>
			<td>タイプ II 膜貫通型糖タンパク質</td>
			<td>形質細胞様樹状細胞</td>
			<td>PE</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td>201A</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD141</td>
			<td>トロンボモジュリン</td>
			<td>単球/マクロファージ低、樹状細胞の亜集団</td>
			<td>APC</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td>M80</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C</td>
			<td>タイプ I の膜貫通型糖タンパク質。インテグリン αx</td>
			<td>単球/マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、ナチュラル キラー細胞、B および T 細胞のサブセット</td>
			<td>APC Cy7</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
			<td>Bu15</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>一般的な白血球抗原</td>
			<td>リンパ球、単球、顆粒球、好酸球、および胸腺を含むすべての人間の白血球</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>FACS バッファー</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>7.5 μ l</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 1。抗体のカクテル FACS panel サブセット マクロファージと樹状細胞集団を識別する 1.記載されている抗体の量は 1 つのサンプルの分析のためです。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ターゲット</td>
			<td>ターゲットの定義</td>
			<td>上に存在します。</td>
			<td>螢光色素</td>
			<td>数量</td>
			<td>クローン</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>一般的な B 細胞抗原</td>
			<td>海つぼみ B 細胞と B 細胞にプロ B 細胞からの b 細胞の開発</td>
			<td>BV421</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>一般的な T 細胞抗原</td>
			<td>T リンパ球、ナチュラル キラー T 細胞および胸腺細胞</td>
			<td>V500</td>
			<td>3 Μ L</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>大きくグリコ接着タンパク質</td>
			<td>ナチュラル キラー細胞、ナチュラル キラー T 細胞</td>
			<td>APC</td>
			<td>5 Μ L</td>
			<td>HCD56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>免疫グロブリンスーパーファミリー型膜貫通型糖タンパク質</td>
			<td>ヘルパー T 細胞、胸腺細胞、単球/マクロファージ、タイプ II 自然なキラー T 細胞</td>
			<td>PerCP Cy5.5</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td>RPA T4</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>ジスルフィド分子複合体の α サブユニット</td>
			<td>細胞傷害性 T 細胞、胸腺細胞、ナチュラル キラー細胞のサブセット</td>
			<td>APC H7</td>
			<td>2 Μ L</td>
			<td>SK1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>一般的な白血球抗原</td>
			<td>リンパ球、単球、顆粒球、好酸球、および胸腺を含むすべての人間の白血球</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>1 Μ L</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>FACS バッファー</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10 μ l</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2。抗体のカクテル FACS パネル 2T および B 細胞の人口を識別する。記載されている抗体の量は 1 つのサンプルの分析のためです。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>マクロファージ パネル</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ゲート名</td>
			<td># セル</td>
			<td>ライブの %</td>
		</tr>
<tr>
<td>単一のセル</td>
			<td>183054</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ライブ</td>
			<td>10477</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>4100</td>
			<td>39.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>ダンプ-
</td>
			<td>771</td>
			<td>7.36</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C- CD11B+
</td>
			<td>430</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11B+
</td>
			<td>104</td>
			<td>0.99</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11B低/-
</td>
			<td>15</td>
			<td>0.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>T 細胞、B 細胞、NK 細胞パネル</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ゲート名</td>
			<td>#Cells</td>
			<td>ライブの %</td>
		</tr>
<tr>
<td>単一のセル</td>
			<td>34616</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ライブ</td>
			<td>3728</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45+
</td>
			<td>1589</td>
			<td>42.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>NK 細胞</td>
			<td>29</td>
			<td>0.78</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3+
</td>
			<td>953</td>
			<td>25.56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4+
</td>
			<td>601</td>
			<td>16.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8+
</td>
			<td>328</td>
			<td>8.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19+
</td>
			<td>20</td>
			<td>0.54</td>
		</tr>
</tbody></table>表 3。付加価値税の異なる細胞型の免疫細胞豊富。生きた細胞の総量に基づいて各ゲート内のセルの数と異なった細胞のタイプの割合。

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Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

この記事では、脂肪組織とフローサイトメトリーを使用して後続の解析から免疫細胞の分離による脂肪組織の免疫細胞の内容を分析する方法について説明します。

フローサイトメトリーを用いたひと脂肪組織での免疫細胞のキャラクタリゼーション

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

characterization-immune-cells-human-adipose-tissue-using-flow

Research

JoVE Journal

Medicine

17.4K ビュー.  MUMC. この記事では、脂肪組織とフローサイトメトリーを使用して後続の解析から免疫細胞の分離による脂肪組織の免疫細胞の内容を分析する方法について説明します。

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Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

脂肪組織の免疫細胞の単離

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

免疫・感染学

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

顆粒球機能の変化を評価するために、イメージベースのフローサイトメトリー技術<em&gt;インビトロ</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

イメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け：二つの単球の分離プロトコルの比較

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

全血によって人間の Monocyte のサブセットの解析フローのフローサイトメトリー解析

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.

解剖されたインプラント組織の免疫機能解析のための高次元フローサイトメトリー

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

生物工学

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, such as type 2 diabetes and nonalcoholic steatohepatitis (NASH). Recent research has established that pro-inflammatory immune cells infiltrate obese hypertrophic adipose tissue and liver. Given the emerging importance of immune cells in the context of metabolic homeostasis, there is a critical need to quantify and characterize their modification during the development of type 2 diabetes and NASH. However, animal models that induce pathophysiological features typical of human NASH are sparse.
In this article, we provide a detailed protocol to identify immune cell subsets isolated from liver and adipose tissue in a reliable mouse model of NASH, established by housing high-fat diet (HFD) mice under non-specific pathogen-free (SPF) conditions without a barrier for at least seven weeks. We demonstrate the handling of mice in non-SPF conditions, digestion of the tissues and identification of macrophages, natural killer (NK) cells, dendritic cells, B and T cell subsets by flow cytometry. Representative flow cytometry plots from SPF HFD mice and non-SPF mice are provided. To obtain reliable and interpretable data, the use of antibodies, accurate and precise methods for tissue digestion and proper gating in flow cytometry experiments are critical elements.
The intervention to restore physiological antigen exposure in mice by housing them in non-SPF conditions and unspecific exposure to microbial antigens could provide a relevant tool for investigating the link between immunological alterations, diet-induced obesity and related long term complications.

A simple and reliable diet-induced rodent animal model for nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is described, achieved through non-SPF housing of the animals and administration of a specific high-fat diet. We describe identification of hepatic and adipose immune cell subsets to recapitulate human immunological conditions by exposing mice to environmental germs.

2型糖尿病と関連した非アルコール性脂肪性肝炎のための高度なマウスモデル

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute functionally to the expansion and remodeling of WAT in adulthood. A tremendous barrier to studying the implications of this cellular heterogeneity is the inability to readily isolate functionally distinct cell subpopulations from WAT SVF for in vitro and in vivo analyses. Single-cell sequencing technology has recently identified functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic PDGFR&#946;+ perivascular cell subpopulations in intra-abdominal WAT depots of adult mice. Fibro-inflammatory progenitors (termed, &#8220;FIPs&#8221;) are non-adipogenic collagen producing cells that can exert a pro-inflammatory phenotype. PDGFR&#946;+ adipocyte precursor cells (APCs) are highly adipogenic both in vitro and in vivo upon cell transplantation. Here, we describe multiple methods for the isolation of these stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal WAT depots. FIPs and APCs can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) or by taking advantage of biotinylated antibody-based immunomagnetic bead technology. Isolated cells can be used for molecular and functional analysis. Studying the functional properties of stromal cell subpopulation in isolation will expand our current knowledge of adipose tissue remodeling under physiological or pathological conditions on the cellular level.

This protocol describes the technical approach to isolate adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal white adipose tissue (WAT) depots by fluorescence-activated cell sorting or immunomagnetic bead separation.

マウス腹腔内脂肪貯蔵所からの脂肪形成性および線維炎症性間質細胞亜集団の単離

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while suppressing unwanted reactions to environmental antigens. Lungs host several populations of innate and adaptive immune cells that provide immune surveillance but also mediate protective immune responses. These cells, which keep the healthy pulmonary immune system in balance, also participate in several pathological conditions such as asthma, infections, autoimmune diseases, and cancer. Selective expression of surface and intracellular proteins provides unique immunophenotypic properties to the immune cells of the lung. Consequently, flow cytometry has an instrumental role in the identification of such cell populations during steady-state and pathological conditions. This paper presents a protocol that describes a consistent and reproducible method to identify the immune cells that reside in the lungs of healthy mice under steady-state conditions. However, this protocol can also be used to identify changes in these cell populations in various disease models to help identify disease-specific changes in the lung immune landscape.

In this study, we present an effective and reproducible protocol to isolate the immune populations of the murine respiratory system. We also provide a method for the identification of all innate and adaptive immune cells that reside in the lungs of healthy mice, using a 9-color-based flow cytometry panel.

マウス肺の自然免疫細胞および適応免疫細胞の同定のためのフローサイトメトリー分析

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release different bioactive molecules that control metabolic, hormonal, and immune processes; currently, it is unclear how these processes are regulated within the adipose tissue. Therefore, the development of methods evaluating the contribution of each cell population to the pathophysiology of adipose tissue is crucial. This protocol describes the isolation steps and provides the necessary troubleshooting guidelines for efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF from human VAT biopsies in a single process, using a collagenase enzymatic digestion technique. Moreover, the protocol is also optimized to identify macrophage subsets and perform mature adipocyte RNA isolation for gene expression studies, which allows performing studies dissecting the interaction between these cell populations. Briefly, VAT biopsies are washed, minced mechanically, and digested to generate a single-cell suspension. After centrifugation, mature adipocytes are isolated by flotation from the SVF pellet. The RNA extraction protocol ensures a high yield of total RNA (including miRNAs) from adipocytes for downstream expression assays. Simultaneously, SVF cells are used to characterize macrophage subsets (pro- and anti-inflammatory phenotype) through flow cytometry analysis.

This protocol provides an efficient collagenase digestion method for isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction-SVF cells from human visceral fat in a single process, including methodology to obtain high-quality RNA from adipocytes and phenotypification of SVF-macrophages through staining of multiple membrane-bound markers for analysis by flow cytometry.

RNA解析およびマクロファージ表現型解析に適したヒト内臓脂肪組織からの生存脂肪細胞および間質血管画分の単離

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

医学

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. Accordingly, techniques for harvesting and processing human adipose tissue have evolved in order to quickly and efficiently obtain large amounts of tissue. Among these, the closed system technology represents an innovative and easy-to-use system to harvest, process, and re-inject refined fat tissue in a short time and in the same intervention (intra-operatively). Adipose tissue is collected by liposuction, washed, emulsified, rinsed and minced mechanically into cell clusters of 0.3 to 0.8 mm. Autologous transplantation of mechanically fragmented adipose tissue has shown remarkable efficacy in different therapeutic indications such as aesthetic medicine and surgery, orthopedic and general surgery. Characterization of micro-fragmented adipose tissue revealed the presence of intact small vessels within the adipocyte clusters; hence, the perivascular niche is left unperturbed. These clusters are enriched in perivascular cells (i.e., mesenchymal stem cell (MSC) ancestors) and in vitro analysis showed an increased release of growth factors and cytokines involved in tissue repair and regeneration, compared to enzymatically derived MSCs. This suggests that the superior therapeutic potential of microfragmented adipose tissue is explained by a higher frequency of presumptive MSCs and enhanced secretory activity. Whether these added pericytes directly contribute to higher growth factor and cytokine production is not known. This clinically approved procedure allows the transplantation of presumptive MSCs without the need for expansion and/or enzymatic treatment, thus bypassing the requirements of GMP guidelines, and reducing the costs for cell-based therapies.

Here, we present human adipose tissue enzyme-free micro-fragmentation using a closed system device. This new method allows the obtainment of sub-millimeter clusters of adipose tissue suitable for in vivo transplantation, in vitro culture, and further cell isolation and characterization.

細胞表現型と分泌性特性化のためのヒト脂肪組織微細断片化

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...