İletişim kuralı ve algoritma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG grant SFB1009 A09 ve EB177/13-1) tarafından finanse edilen bir proje içinde geliştirilmiştir. Yazar Barbara Schedding ve teknik destek için Felix Schmalbein ve Dr. eleştirel makale okumak için Niland teşekkürler.

1. stok çözümleri
<ol><li>10 x TBS 100 mL pH 7.4 çözüm hazırlamak için 6,06 g TRIS ve NaCl 8,77 g 90 mL deiyonize su içinde dağıtılması, pH %7,4 37 HCl çözüm için ayarlamak, birimin 100 ml deiyonize su ile doldurun ve çözüm filtre.</li>
	<li>100 mL 1 hazırlamak için M HEPES/NaOH, pH 7.4 çözüm, HEPES 23.83 g 90 mL deiyonize su içinde erimesi, pH 7.4 ile 1,5 M NaOH için ayarlamak, birimin 100 ml deiyonize su ile doldurun ve çözüm filtre.</li>
	<li>100 mL 5 M NaCl çözeltisi hazırlamak için NaCl 29.2 g 90 mL deiyonize su içinde çözülür. Birimin 100 ml deiyonize su ile doldurun ve çözüm filtre.</li>
	<li>100 mL 1 M MgCl2 çözeltisi hazırlamak için çözülür 20.33 g MgCl2 · 6H2O 90 mL deiyonize su içinde. Birimin 100 ml deiyonize su ile doldurun ve çözüm filtre.</li>
	<li>%5 ısı inaktive BSA su hazırlamak için BSA (kesir V, pH 7,0) 2.5 g 50 mL tüp içinde ağırlığında ve 45 mL deiyonize su geçiyoruz. Çözüm 50 ml deiyonize su ile doldurun ve 45 dk. bir buz banyosu içinde serin ve -20 ° C'de depolamak için bir su banyosu 68 ° C'de çözümde ısı</li>
	<li>Sulu % 25 oxazolidin çözüm hazırlamak. Dikkat: Oxazolidin zararlı olup olmadığını yuttu, toksik Solunduğunda ve burns neden olur. Koruyucu giysiler, eldiven, giyim ve göz/koruma yüz.</li>
	<li>Tavşan anti-serum yukarıda açıklanan19kaldırın. Anti-serum titresi standart protokolleri20göre belirlendi.</li>
	<li>Anti-tavşan immünglobulin-antikorlar ile alkalen fosfataz Birleşik keçi gelen hazır olun.</li>
	<li>100 mL 0.1 M glisin çözeltisi hazırlamak için glisin 90 ml deiyonize su, 0.75 g geçiyoruz. 1,5 M NaOH çözüm ile 10.4 için pH ayarlama, birimin 100 ml deiyonize su ile doldurun ve çözüm filtre.</li>
	<li>100 mL 0.5 M Zn (II) hazırlamak için-asetat çözüm, 10,98 g Zn (II) dağıtılması-asetat · 2H2O 90 mL deiyonize su içinde. Birimin 100 ml deiyonize su ile doldurun ve çözüm filtre.</li>
	<li>100 mL 1,5 M NaOH çözeltisi hazırlamak için 90 mL deiyonize su 6.0 g NaOH geçiyoruz. Birimin 100 ml deiyonize su ile doldurun ve çözüm filtre.</li>
</ol>2. arabellekleri hazırlayın ve çalışma çözümleri
<ol><li>5 deiyonize mL 10 x TBS pH 7.4, 45 mL ile su sulandırmak ve bir 1 M MgCl2 hisse senedi çözeltinin 100 µL ekleyin. Oda sıcaklığında tutmak. TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 çözüm için reseptör ve microtiter tabak yıkama immobilizasyon arasındadır.</li>
	<li>Isı inaktive BSA suda % 5 ve 10 x TBS, 5 mL pH 7.4 50 mL deiyonize su ile 10 mL seyreltik. 100 µL 1 M MgCl2 hisse senedi çözüm çözüm iyi ekleyip karıştırın. Buz üstünde tutmak ve -20 ° C'de daha fazla deneyler için saklayın Not % 1 BSA TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 içinde o 2.5 mL her titrasyon eğrisi için gereklidir.</li>
	<li>1 2.5 mL seyreltik M HEPES/NaOH, pH 7,4 ve 1.5 mL 5 M NaCl çözüm 50 ml deiyonize su ile 100 µL 1 M MgCl2 çözüm ekleyip karıştırın iyice 50 mL HBS, pH 7.4: 50 mM HEPES/NaOH hazırlamak için çözüm , 150 mM NaCl.</li>
	<li>1 M MgCl2 hisse senedi çözüm 5 µL ekleyip 2 µL 0,5 M Zn (II)-asetat hisse senedi çözüm 5 mL 0.1 M glisin çözüm, pH alkalen fosfataz (AP) arabellek (0.1 M glisin çözüm, pH 10.4, 1 mM MgCl2, 0.2 mM Zn(II)-acetate). hazırlamak için 10.4 için</li>
</ol>3. immobilizasyon bir Microtiter plakasına reseptör (Integrin α2A-etki alanı)
<ol><li>İntegrin α2A-etki alanında TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 5 µg/mL nihai bir konsantrasyon için hisse senedi çözüm sulandırmak. Not: 12 iyi satır yarım alan-microtiter plaka oluşan bir titrasyon eğrisi için 650 µL kaplama çözüm birimdir.</li>
	<li>Her şey yarım alan-microtiter tabakta bir satırın 50 µL/kuyu ile 5 µg/mL kaplama çözüm integrin α2A-etki alanı (vahşi-türü veya mutant) doldurun. Her titrasyon satır en az çoğaltmaları gerçekleştirin (Bu örnekte dördüz; olarak şekil 1' deki microtiter plaka yerleşimini bakın).</li>
	<li>Plaka folyo ile kapatın veya bir kapak ile kapatın. Plaka 4 ° C'de gece bırakın.</li>
</ol>4. yıkama Kuyu yapımı tabak iki kez TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 ile kaplı
<ol><li>Çözünür reseptör kaldırmak için plastik yüzey-değil var immobilize tarafından fiziksel adsorpsiyon, kaplama çözümü kaldırmak ve her doldurmak molekülleri MgCl2TBS, pH 7.4, 2 mM 50 µL ile iyi.</li>
	<li>Yıkama çözüm kaldırın. Kuyuları kuru olmazlar sağlamak. Bu nedenle, kalan sıvı kaldırmak için bir doku bez microtiter tabağa dokunun değil. Multistep bir pipet veya çok kanallı pipet kuyuları hızlı bir şekilde doldurmak için kullanın.</li>
	<li>Bir kez bu çamaşır tekrarlayın.</li>
</ol>5. nonspesifik bağlama sitelerini engelleme
<ol><li>TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 her şey için 50 µL % 1 BSA çözüm ekleyin.</li>
	<li>Wells folyo ile yeniden mühürlemek veya bir kapak ile kapatın.</li>
	<li>Wells, oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. Not: Bu protokol kuluçka adımlardan herhangi birini bir sallanan veya sallayarak platform üzerinde gerçekleştirilebilir. Ancak, bu gerekli değildir ve denemenin sonucu değiştirmez.</li>
</ol>6. Rhodocetin Ligand bir seri seyreltme satırı hazırlanması
<ol><li>Rhodocetin başlangıç konsantrasyonu ve seri seyreltme ligand konsantrasyonu uygun bir dizi elde etmek için ve bir minimum ve maksimum sinyal ile tam titrasyon eğrisi kaydetmek için seyreltme faktörü değişir. Bu deneyde, 243 nM rhodocetin bir başlangıç konsantrasyonu ve 2.3 bir seyreltme faktörü istihdam. Rhodocetin hisse senedi çözüm seri seyreltme satır en yüksek ligand konsantrasyonu sulandırmak. 2.3 bir seyreltme faktörü ile her titrasyon eğrisi için 243 nM (Yani, 15,2 µg/mL) rhodocetin çözüm %1 115 µL hazırlamak BSA/TBS, pH 7.4, deney tüpü #1 2 mM MgCl2 .</li>
	<li>65 µL % 1 BSA çözüm TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 #2-#11 etiketli 10 test tüpleri doldurun.</li>
	<li>#1 için tüp rhodocetin seyreltme 50 µL aktarmak tüp #2, her iki çözüm mix (Toplam birim: 115 µL; seyreltme faktörü: 1:2. 3) toz ve ardından test tube #3, vb bu karışım üzerinden transfer 50 µL
</li>
	<li>Bu seri seyreltme test tüpü #11 kadar devam edin. Not: 6.1 6.4 adımda verilen birimleri bir titrasyon eğrisi için yeterlidir. Bu birimler çoğaltır sayısı ile çarpın. Bu durumda, sekiz titrasyon eğrileri (iki α2A etki alanı form dördüz) gerçekleştirmek ve aşağıdaki birimler hazır olun: rhodocetin çözüm test tüpü #1; en yüksek konsantrasyon, 920 µL TBS, pH 7.4 her test tüpleri #2 #11 içinde doldurmak için 2 mM MgCl%2 1 BSA 520 µL; ve bir tüp transferi birimden diğerine 400 µL.</li>
</ol>7. bağlama Ligand (Rhodocetin) için farklı konsantrasyonlarda immobilize reseptör (Integrin α2A-etki alanı)
<ol><li>Engelleme çözüm microtiter plaka kuyulardan vakum bir çizgiyle kaldırın.</li>
	<li>Hemen rhodocetin çözüm %1 50 µL eklemek BSA/TBS, pH 7.4/MgCl2 çözüm test tüpüne wells sütun 1, deney tüpü #2 sütun 2,vb ekle 50 µL TBS, pH %7,4 1 BSA, kuyu için çözüm #1 , 2 mM MgCl2 (arabellek engelleme ve seyreltme) ligand-Alerjik denetimi olarak sütun (bkz: microtiter plaka, şekil 1yerleşimini) 12 kuyu için.</li>
	<li>Wells folyo ile yeniden mühürlemek veya bir kapak ile kapatın.</li>
	<li>Wells, oda sıcaklığında (20-22 ° C civarında) 1,5 saat için kuluçkaya.</li>
</ol>8. yıkama Wells, plaka iki kez HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 ile
<ol><li>Bağlı olmayan ligand molekülleri kaldırmak için bağlama çözüm kaldırın ve her doldurmak HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl250 µL ile iyi. Sonra yıkama çözüm kaldırın.</li>
	<li>Kendine iyi bak kuyuları kuru olmazlar. Bu nedenle, kalan sıvı kaldırmak için bir doku bez microtiter tabağa dokunun değil. Multistep bir pipet veya çok kanallı pipet kuyuları hızlı bir şekilde doldurmak için kullanın.</li>
	<li>Bir kez bu çamaşır tekrarlayın.</li>
</ol>9. reseptör bağlı Ligand %2.5 ile düzeltmek HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 oxazolidin
<ol><li>Bir taze % 2.5 oxazolidin çözüm %1 25 oxazolidin çözümün parçası ve HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl29 bölümlerini karıştırarak hazırlayın.</li>
	<li>Her şey microtiter plaka HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl%22.5 oxazolidin çözümünde 50 µL ile doldurun. Oda sıcaklığında 10 dk microtiter plaka kuluçkaya.</li>
</ol>10. plaka üç kez yıkama Wells'le TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 50 µL/kuyu
<ol><li>-E doğru çıkarmak ve aşırı oxazolidin devre dışı bırakabilirsiniz, fiksasyon çözümü kaldırmak ve her doldurmak TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl250 µL ile iyi. Yıkama çözüm kaldır. Not: microtiter plaka oxazolidin içeren fiksasyon çözüm bir tabak içine dökün ve sonra bu TBS, pH 7.4 eşit bir birimi tarafından inaktive fiksasyon çözüm atın.</li>
	<li>Kendine iyi bak kuyuları kuru olmazlar. Bu nedenle, kalan sıvı kaldırmak için bir doku bez microtiter tabağa dokunun değil. Multistep bir pipet veya çok kanallı pipet kuyuları hızlı bir şekilde doldurmak için kullanın.</li>
	<li>İki kez bu çamaşır tekrarlayın.</li>
</ol>11. reseptör bağlı Ligand tarafından ELISA miktar
<ol><li>TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl%21 BSA 50 µL/iyi birincil antikor çözüm ekleyin. Birincil antikor bir tavşan anti-serum rhodocetin19karşı kaldırdı, 1:2,000 TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl%21 BSA içinde seyreltilmiş çözümdür.</li>
	<li>75-90 dk oda sıcaklığında plaka kuluçkaya. Plaka bütün wells üç kez TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl250 µL/kuyu ile yıkayın. Adımları yıkama, microtiter plaka üzerine bir doku dokunarak üç sırasında bez gerekli değildir.</li>
	<li>TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl%21 BSA 50 µL/iyi ikincil antikor çözüm ekleyin. Bu amaçla, ikincil antikor, keçi antikorlar immünglobulin hedefleme tavşan TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl%21 BSA içinde 1:2,000 için alkalen fosfataz ile Birleşik oranında seyreltin. 75-90 dk oda sıcaklığında plaka kuluçkaya.</li>
	<li>4-nitrophenyl fosfat disodyum tuzu hekzahidrat (fosfataz substrat) AP arabellek (0.1 M glisin çözüm, 1 mM MgCl2 ve 0.2 mM Zn(II)-acetate) içeren pH 10.4,. 5 ml içeren bir 5 mg tablet çözülerek AP tespit edici çözüm hazırlamak</li>
	<li>Plaka bütün wells üç kez TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2, hemen sonraki adım gerçekleştirmeden önce 50 µL/kuyu ile yıkayın. Bir doku bez microtiter tabağa son yıkama adımdan sonra sıvı tüm izlerini kaldırmak için dokunun.</li>
	<li>50 µL/iyi AP tespit edici çözüm microtiter plaka wells için ekleyin. AP tespit edici çözüm derhal mümkün olduğunca aynı anda enzimatik dönüşüm başlatmak için bütün wells ekleyin. Bu nedenle, bir çok kanallı pipet kullanın.</li>
	<li>En yüksek ligand konsantrasyonu Wells'le çözümde çevirmek kadar sarı oda sıcaklığında plaka kuluçkaya. Not: Kuluçka süresi 5 min ve sinyal şiddeti bağlı olarak 1 saat arasında değişebilir.</li>
	<li>Fosfataz substrat çevrimi 50 µL/iyi 1.5 M NaOH çözüm ekleyerek durdurmak. Her iki çözüm de çizgi-Alerjik karıştırma sağlamak birkaç dakika için plaka ayakta bırakın. Aynı kuluçka dönemi bütün wells emri için bir çok kanallı pipet kullanın ve kuyu Bu adımda 11,8 AP tespit edici substrat olarak eklenen aynı sırada 1.5 M NaOH ekleyin.</li>
	<li>Optik yoğunluk (OD) ölçmek 405 nm her iyi bir ELISA okuyucu tarafından.</li>
</ol>12. titrasyon sinyalleri değerlendirilmesi
<ol><li>Ham veri, OD405nm değerleri tablo Excel ile açın. Titrasyon eğrileri bu sinyal değerleri satırları okurken, değerleri bir sütun ve başka bir sütun eklenen ligand konsantrasyonları ile etiket işlemi tersine çevir.</li>
	<li>Graphpad prizma 5 (sürüm 5.0) açın. Ana menüde yeni bir proje dosyasını açın. Yeni veri ve grafikaltında XY biçimini seçin. Y ekseni için Enter ve arsa her değer için tek bir noktadan seçeneğini seçin.</li>
	<li>İki sütun, eklenen ligand konsantrasyonu kopyalayın ve değerleri (OD405nm ) Excel dosyası ve GraphPad prizma veri sayfası yapıştırın sinyal X ve Y değerleri, sırasıyla.</li>
	<li>GraphPad prizma 5 analiz alt programı açın ve Non-linear regresyon XY-analizaltında seçeneğini seçin. Kullanıcı tanımlı denklemi seçin ve yeni bir denklemi oluşturmak için Yeni düğmesine basın.</li>
	<li>Titrasyon eğrisi denklem şeklinde yazın: Y =(Smax-Smin)*((X+R+K)-sqrt((X+R+K)^2-4*R*X)) /(2*R) + Smin + B * X Y S, sinyal değeri eklenen ligand L konsantrasyonu varlık ile yeni açılan şablon sayfasına , Konsantrasyonu olmak R immobilize reseptör, ayrışma sabiti olan K ve B arka olmak inişli. K gibi uygun kısıtlamaları tanımlamak > 0 ve R > 0. Not: Bu denklem Denklem 9 farklı bir formu aynı denklemdir.</li>
	<li>Veri sayfasının değerleri yeni oluşturulan kullanıcı tanımlı denklem seçerek analiz. Tablo hesaplanan yaklaşım değerleri ile açın (K, Rt, Smax, Sminve B) hangi yazılım ekranın sol tarafında sonuç bölümü altında gösterilir. Not: Yazılım titrasyon eğrisi en az 5 veri noktalarından oluşuyorsa yinelemeli doğrusal olmayan regresyon yaklaştırarak 5 parametreleri belirler.</li>
	<li>Parametreleri K, Rt, Smax, Sminve B titrasyon eğrileri her grup için istatistiksel olarak değerlendirmek ve parametreleri (mutasyona uğramış veya kimyasal olarak değişikliğin ligand veya reseptör) grup belirli özelliği ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Klotz, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+law+of+mass+action+to+binding+by+proteins;+interactions+with+calcium.">The application of the law of mass action to binding by proteins; interactions with calcium.</a> Arch Biochem. 9, 109-117 (1946).</li><li>Klotz, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-receptor+complexes:+origin+and+development+of+the+concept.">Ligand-receptor complexes: origin and development of the concept.</a> J Biol Chem. 279 (1), 1-12 (2004).</li><li>Bisswanger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+1:+Multiple+Equilibria,+Principles+and+Derivations.">Ch. 1: Multiple Equilibria, Principles and Derivations.</a> Enzyme Kinetics: Principles and Methods. , 1-26 (2017).</li><li>Shimura, K., Kasai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+gel+titration:+quantitative+analysis+of+the+binding+equilibrium+between+immobilized+protein+and+free+ligand+by+a+continuous+titration+procedure.">Affinity gel titration: quantitative analysis of the binding equilibrium between immobilized protein and free ligand by a continuous titration procedure.</a> Anal Biochem. 149 (2), 369-378 (1985).</li><li>Gong, M., Nikcevic, I., Wehmeyer, K. R., Limbach, P. A., Heineman, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-aptamer+binding+studies+using+microchip+affinity+capillary+electrophoresis.">Protein-aptamer binding studies using microchip affinity capillary electrophoresis.</a> Electrophoresis. 29 (7), 1415-1422 (2008).</li><li>Hanes, M. S., Ratcliff, K., Marqusee, S., Handel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+binding+affinities+by+pulse+proteolysis:+application+to+TEM-1/BLIP+protein+complexes.">Protein-protein binding affinities by pulse proteolysis: application to TEM-1/BLIP protein complexes.</a> Protein Sci. 19 (10), 1996-2000 (2010).</li><li>Latour, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Langmuir+isotherm:+a+commonly+applied+but+misleading+approach+for+the+analysis+of+protein+adsorption+behavior.">The Langmuir isotherm: a commonly applied but misleading approach for the analysis of protein adsorption behavior.</a> J Biomed Mater Res A. 103 (3), 949-958 (2015).</li><li>Stockell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+binding+of+diphosphopyridine+nucleotide+by+yeast+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase.">The binding of diphosphopyridine nucleotide by yeast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.</a> J Biol Chem. 234 (5), 1286-1292 (1959).</li><li>Heyn, M. P., Weischet, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+dichroism+and+fluorescence+studies+on+the+binding+of+ligands+to+the+&#945;+subunit+of+tryptophan+synthase.">Circular dichroism and fluorescence studies on the binding of ligands to the &#945; subunit of tryptophan synthase.</a> Biochem. 14 (13), 2962-2968 (1975).</li><li>Campbell, I. D., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+structure,+activation,+and+interactions.">Integrin structure, activation, and interactions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (3), (2011).</li><li>Zeltz, C., Gullberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+integrin-collagen+connection--a+glue+for+tissue+repair?.">The integrin-collagen connection--a glue for tissue repair?.</a> J Cell Sci. 129 (4), 653-664 (2016).</li><li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions.">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nature. 468 (7323), 580-584 (2010).</li><li>Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+integrin+regulation+and+signaling.">Structural basis of integrin regulation and signaling.</a> Annu Rev Immunol. 25, 619-647 (2007).</li><li>Luo, B. H., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+structures+and+conformational+signaling.">Integrin structures and conformational signaling.</a> Curr Opin Cell Biol. 18 (5), 579-586 (2006).</li><li>Ricard-Blum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+collagen+family.">The collagen family.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a004978 (2011).</li><li>Eble, J. A., Tuckwell, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;2&#946;1+integrin+inhibitor+rhodocetin+binds+to+the+A-domain+of+the+integrin+&#945;2+subunit+proximal+to+the+collagen-binding+site.">The &#945;2&#946;1 integrin inhibitor rhodocetin binds to the A-domain of the integrin &#945;2 subunit proximal to the collagen-binding site.</a> Biochem J. 376 (Pt 1), 77-85 (2003).</li><li>Eble, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;2&#946;1+integrin-specific+antagonist+rhodocetin+is+a+cruciform,+heterotetrameric+molecule.">The &#945;2&#946;1 integrin-specific antagonist rhodocetin is a cruciform, heterotetrameric molecule.</a> FASEB J. 23 (9), 2917-2927 (2009).</li><li>Eble, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+and+concerted+conformational+changes+enable+rhodocetin+to+block+&#945;2&#946;1+integrin+selectively.">Dramatic and concerted conformational changes enable rhodocetin to block &#945;2&#946;1 integrin selectively.</a> PLoS Biol. 15 (7), e2001492 (2017).</li><li>Bracht, T., Figueiredo de Rezende, F., Stetefeld, J., Sorokin, L. M., Eble, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+reveal+the+alteration+of+the+rhodocetin+structure+upon+&#945;2&#946;1+integrin+binding.">Monoclonal antibodies reveal the alteration of the rhodocetin structure upon &#945;2&#946;1 integrin binding.</a> Biochem J. 440 (1), 1-11 (2011).</li><li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Immunizations.">Chapter 5: Immunizations.</a> Antibodies, a laboratory manual. 5, 53-138 (1988).</li><li>Lu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+interactions+between+SSB+and+proteins+by+the+use+of+fluorescence+anisotropy.">Analyzing interactions between SSB and proteins by the use of fluorescence anisotropy.</a> Methods Mol Biol. 922, 155-159 (2012).</li><li>Fielding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+methods+for+the+determination+of+protein-ligand+dissociation+constants.">NMR methods for the determination of protein-ligand dissociation constants.</a> Curr Top Med Chem. 3 (1), 39-53 (2003).</li><li>Leavitt, S., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+protein+binding+energetics+by+isothermal+titration+calorimetry.">Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry.</a> Curr Opin Struct Biol. 11 (5), 560-566 (2001).</li><li>McDonnell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance:+towards+an+understanding+of+the+mechanisms+of+biological+molecular+recognition.">Surface plasmon resonance: towards an understanding of the mechanisms of biological molecular recognition.</a> Curr Opin Chem Biol. 5 (5), 572-577 (2001).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+surface+plasmon+resonance+biosensor+analysis.">Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 11 (1), 54-61 (2000).</li><li>Pesquero, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+and+kinetic+parameter+estimation+of+the+affinity+interaction+of+jArtinM+and+rArtinM+with+peroxidase+glycoprotein+by+the+electrogravimetric+technique.">Real-time monitoring and kinetic parameter estimation of the affinity interaction of jArtinM and rArtinM with peroxidase glycoprotein by the electrogravimetric technique.</a> Biosens Bioelectron. 26 (1), 36-42 (2010).</li><li>Scheuermann, T. H., Padrick, S. B., Gardner, K. H., Brautigam, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+acquisition+and+analysis+of+microscale+thermophoresis+data.">On the acquisition and analysis of microscale thermophoresis data.</a> Anal Biochem. 496, 79-93 (2016).</li></ol>

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Titrasyon ELISA Reseptör-ligand etkileşim ayrılma belirlemek için bir çok yönlü test sistemidir. Titrasyon ELISA ücretsiz ve ilişkili ligandlar etkili bir şekilde ayırmak için ve onların konsantrasyonları nicelik, çözümlemek için önemli ölçüde daha fazla çalışmalar zorunluluk kaçınmanızı sağlar ve yayınlar titrasyon ELISAs bağlama eğrileri kayıt yerine istihdam . Ayrıca, titrasyon ELISAs gerçekleştirmek ve reseptör ve ligand oldukça düşük miktarda gerektirir kolaydır. Ayrılma s...

Ayrışma sabiti K bir reseptör (R) benzeşim onun ligand (L) açıklamak için önemli bir parametredir. Kitlesel eylem hukuk üzerinde bağlı olarak, K içinde Reseptör-ligand karmaşık RL R reseptörü ve ligand L: ayrışıp denge için tanımlanan
<img alt="Equation 1 " src="/files/ftp_upload/57334/57334eq1.jpg">            Denklem 1
reseptör ve ligand ücretsiz/ilişkisiz durumunu gösteren endeksi f ile. Reseptör-ligand kompleks RL, konsantrasyon reseptör bağlı ligand Lbkonsantrasyon için aynıdır. Reseptör Rt toplam konsantrasyonu ücretsiz reseptör Rf ve ligand bağlı reseptör Rb toplamı olarak = Lb, ayrışma sabiti olarak da yazılabilir:
<img alt="Equation 2 " src="/files/ftp_upload/57334/57334eq2.jpg">        Denklem 2
Bu nedenle, doygunluk ilişkili ligand Lb reseptör Rttoplam konsantrasyonu ilişkisi kesir olarak tanımlanmış Y, verim,
<img alt="Equation 3 " src="/files/ftp_upload/57334/57334eq3.jpg">        Denklem 3
Ücretsiz ligand Lfkonsantrasyon üzerinde bağlıdır:
<img alt="Equation 4 " src="/files/ftp_upload/57334/57334eq4.jpg">        Denklem 4
Hiperbolik bu ilişki bir Reseptör-ligand etkileşim bağlama eğriyi tanımlayan ve onun arsa ilişkili ligand Lb toplama ücretsiz ligand Lfkonsantrasyonu bir fonksiyonu olarak gösterir. Bağlama eğrisi ayrışma sabiti K, yarı-azami doygunluk verim ücretsiz ligand konsantrasyonu olarak elde edilebilir. Ayrıca, bağlama eğrileri linearize farklı algoritmaları, gibi çift karşılıklı arsa Klotz1,2veya Scatchard veya Hanes (Bisswanger3tarafından gözden) göre dönüşümleri tarafından kurulmuştur. Ancak, tüm algoritmaları asimptotik ücretsiz ligand bağlayıcı eğri yüksek konsantrasyonlarda yaklaştı doygunluk verim maksimum değeri bir grafik öncesi değerlendirilmesinde tahmin edilecek sahip ve bu nedenle sorunu muzdarip hataya.
Buna ek olarak, bir bağlama eğrisi belirlenmesi ücretsiz ve ilişkili ligand miktar sırasında bağlama denge gerektirir. Bu amaçla, ücretsiz ligand reseptör bağlı ligand ayrılmış ve sayısal gerekiyor. Bu nedenle, ligand ve reseptör protein ligand olarak karşı bir protein reseptörü gibi özellikleri, farklı gerekir. Her iki bağlama ortak proteinler ise, kendi boyutları, ücret veya diğer moleküler özellikleri ayırt olmak zorundalar. Yine de, küçük ölçekli bağlama yaklaşımlar konsantrasyonlarda ligand miktar zor bir iştir. Özellikle reseptörleri önemli miktarda kullanılabilir veya uygun olmasa radyoaktif ligand etiketleme genellikle ilişkili ligand, düşük yoğunlukta algılamak gerekli oldu. Ayrıca, reseptör bağlı ligand-ihmal edilebilir bir şekilde sırasında ve sonrasında yalıtım ayırmak. Bu nedenle, denge jel filtrasyon4, Kapiler Elektroforez5ve nabız proteolizis6, gibi karmaşık yöntemler reseptör bağlı ligand ölçmek ve ücretsiz ligand ayırmak için gereklidir.
Bu bağlama deneyleri aksine titrasyon deneyler ilişkili ve ücretsiz ligand nicel ayrılması gerek yoktur. Bu amaçla, bir reseptör sabit bir konsantrasyon, eklenen ligand farklı konsantrasyonları ile titre. Reseptör için bağlama tarafından ilişkili ligand ücretsiz ligand ayıran ve örneğin, fotometri, fluorometry veya antikor algılama, ölçülebilir biyofiziksel bir özelliğe sahiptir. Böylece, bir sinyal ile doygunluğu ile doğru orantılıdır S Y verim ve sonuç olarak da reseptör bağlı ligand (Lb) konsantrasyon için eklenen ligand (Lt) toplam konsantrasyonu bir fonksiyonu olarak algılanır. Parametreleri, sinyal S ve eklenen ligand toplam konsantrasyonu ilişkili ve ücretsiz ligand konsantrasyonu daha doğrudan ve kolay bir şekilde sayılabilir. Özellikle, reseptör bağlı ligand enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) tarafından algılanmasını 100 µL aşağıda örnek birimlere azaltılması yanı sıra birkaç ligand konsantrasyonu paralel ölçümleri çok iyi microtiter levha izin. Bir titrasyon ELISA, bir reseptör fiziksel olarak aynı toplama bir microtiter plaka adsorbe ve çözünür ligand ile titre. Reseptör plastik yüzeye aslında hidrofobik adsorpsiyon tarafından immobilize. İmmobilize reseptör ilişkilendirir yüzey konsantrasyon reseptör Langmuir´s adsorpsiyon izoterm7göre muhtemel bir doğrusal olmayan ilişkide kaplama konsantrasyonu ile. Genel adsorbe reseptör molekülleri ek olarak, etkinlik durumlarına titrasyon deneyleri için başka bir önemli parametre sayısıdır. Sadece hangi ligand bağlayıcı faaliyet korunur, titrasyon tahlil için uygundur ve sonunda etkin reseptörleri Rt doğrudan belirlenemez titrasyon testin toplam konsantrasyonu katkıda reseptörleri immobilize.
İmmobilize reseptör tarafından kapsanmayan siteleri plastik yüzeyi ligand gibi diğer proteinler absorbe yatkındır. Tür plastik yüzey sitelerde ligand fiziksel adsorpsiyon reseptör bağlı ligand olarak benzer bir sinyal, henüz belirsiz bir şekilde sonuçlanır. Bu nonspesifik sinyal plastik yüzey siteleri hangi protein ile kaplı değil henüz sığır serum albumin (BSA)-ecek var olmak kütük parçası microtiter plakaların azaltmak için. Ancak, bazı Reseptör-ligand titrasyon deneyleri için spesifik olmayan arka plan sinyalleri gözlenen. O zaman, engelleme diğer ajanlar gibi bir çözüm % 0,2 jelatin veya %0,04 ara 20, önerilir.
Reseptör için bağlama sonra ücretsiz ligand tarafından iki çamaşır adımı kaldırılır. Microtiter iyi plastik yüzeye immobilize ve isteğe bağlı olarak kimyasal fiksasyonu tarafından güçlendirilmiş reseptör ile ilişkili ligand kalır. Sonraki kovalent çapraz-bağlantı için ilişkili ligand ve oxazolidin ile immobilize reseptör arabellek madde TRIS ligand bağlayıcı herhangi bir değişiklik olmadan HEPES için değiştirilir. TRIS, aksine HEPES oxazolidin devre dışı değil. Oxazolidin ile kovalent çapraz bağlantı ile onun reseptör ilişkili ligand giderir ve onun ayrılma sonraki çamaşır ve kuluçka adımları sırasında engeller. Böylece, Reseptör-ligand etkileşimi kimyasal dondurulur ve çamaşır ve kuluçka sonraki adımlarla etkilenmez bir titrasyon eğrisi garanti eder. Ancak, oxazolidin fiksasyon kimyasal olarak ligand ve reseptör etkileşimlerini azaltılmış veya kaldırılmış şekilde değiştirebilir. Ayrıca, özellikle Monoklonal antikor ilişkili ligand ölçmek için kullanılıyorsa epitopları ligand içinde değişiklik algılama antikor bağlama benzeşme değişebilir. Oxazolidin fiksasyon bu olumsuz etkilerin ikisi de bu titrasyon ELISA oluşmakla birlikte, test oxazolidin karşı duyarlılığını titrasyon deney öncesinde her Reseptör-ligand etkileşim için test edilmelidir. Fiksasyon sonra aşırı oxazolidin TRIS içeren bir arabellek ile üç yıkama adımda kaldırılır. TRIS nonspecifically antikorlar sonraki adımda algılama ile tepki kalan aldehit gruplarını inaktive.
Fotometrik ELISA sinyal S. sağlayan enzim bağlı antikorlar ile ilişkili ligand miktarını sayısal Bu eklenen toplam ligand konsantrasyonu Lt karşı çizilir her şey için. Onun daha kolay satın alma rağmen titrasyon eğrisi hiperbolik işlevi bağlama eğrisi aksine değil. Ayrıca, nasıl bir titrasyon eğrisi üzerinden ayrışma sabiti K hesaplamak için belli olmuştur. Algoritmalar spectroscopically Edinsel titrasyon eğrileri linearize bağımsız olarak Stockell8 ve Hey ve Weischet9tarafından bildirilmiştir rağmen yüksek sinyal tahmin onların belirsizlik nedeniyle yetersiz kalmışlar değeri doygunluk verim eklenen ligand yüksek konsantrasyonları yaklaşıyor.
Burada, bir titrasyon ELISA ve doğrusal regresyon algoritması titrasyon eğrisi Reseptör ligand müdahalesini ayrışma sabiti K türetmek açıklanmıştır. Bu protokol ile bir yılan zehri elde edilen inhibitörü kollajen bağlayıcı A-etki integrin α2β1, etkileşim için örneklenir. İntegrinler hücrelerin etrafındaki hücre dışı matriks veya temel membran10,11anchorage aracılık hücre adezyon molekülleri vardır. Ayrıca, ek moleküller sinyal ve yeni hücre organelleri, adhesomes, hücre-matris etkileşim12,13, üzerine şekillendirme işe integrinler hücreleri ve hücre dışı matriks arasında önemli sinyalleri iletmek 14. kollajen, α2β1 Integra, ligand insan vücudunun en bol protein ve bağ dokusu15önemli iskele bileşenidir. Α2β1 integrin ve kollajen arasındaki etkileşimi bir integrin α2 alt birimi A etki tarafından aracılık ettiği. İntegrin α2A-etki alanı, kollajen bağlama için gereklidir ve yapısını stabilize bir divalent ba * içerir. Mutantlar hangi biri gibi yüzey maruz kalan Y216 glycine için yerine α2A etki alanının yanı sıra yaban türü formlar kolayca recombinantly bir bakteriyel ifade sisteminde üretilen ve onların oligo-His-etiketleri ile bir NiNTA ile izole bir sonraki diyaliz TRIS arabelleğe alınmış serum (TBS; 50 mM TRIS/HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl) içeren 2 mM MgCl216karşı montaj sütun. Bicinchoninic asit tahlil (BCA) ile onların konsantrasyonları belirlenmiştir ve onların eroine geleneksel SDS-PAGE tarafından test edilmiş ve Coomassie-parlak mavi R250 ile lekeli.
Α2β1 integrin ve kollajen arasındaki etkileşimi bağlama yılan zehri bileşeninin Malaya çukur engerek (Calloselasma rhodostoma)16,17rhodocetin tarafından engellendi. Bu titrasyon ELISA içinde çözünür bir ligand olarak kullanılan, rhodocetin ham saflaştırıldı16daha önce açıklandığı gibi zehir. HEPES arabelleğe alınmış serum (HBS; 10 mM HEPES/NaOH, pH 7.4, 150 mM NaCl) içinde çözünmüş ve -20 ° C'de dondurulmuş depolanır Onun konsantrasyonu BCA tarafından tespit edildi ve saflığı SDS-PAGE tarafından kanıtlanmış oldu. Bir antagonisti rhodocetin sadece kollajen için integrin bağlama engeller α2β1 A etki alanı, ama aynı zamanda böylece herhangi bir kollajen hücreleri ya da trombosit18sinyal önleme integrin etkin olmayan biçimi stabilize. Rhodocetin reseptör hedefine ile ayrışma sabiti belirlemek ve böylece onun moleküler mekanizması ve ilaç potansiyel örneğin, antitrombotik bir ajan olarak çözmek Biyomedikal büyük önem taşımaktadır. Bu amaçla, ELISA onun değerlendirme de dahil olmak üzere anlatılan bir titrasyon hangi bir 1:1 etkileşim stoichiometry ile hemen hemen her Reseptör-ligand etkileşim için geçerlidir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>neoFrox</td>
			<td>1125KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>1,316,591,214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>172571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>integrin a2A, wild-type and mutant, recombinant</td>
			<td></td>
			<td>isolated in author&#39;s lab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiNTA superflow column&#160;</td>
			<td>Qiagen, Germany</td>
			<td>30821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie-Brilliant Blue R250</td>
			<td>Serva</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bicinchoninic acid assay (BCA), protein concentration determination kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumine (BSA), fraction V</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 % solution of glutaraldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>354400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit immunglobulin-antibodies from goat, conjugated with alkaline phosphatase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn(II)-acetate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase substrate tablet (5 mg)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar half-area microtiter plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Corning 3690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro reaction tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate ELISA reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

titration elisa as a method to determine the dissociation constant of receptor ligand interaction

Ayrışma sabiti bağlama denge iki ortağı arasındaki etkileşim açıklar ve onların ilgi bir ölçüsüdür. Farklı ligandlar, örneğin, rekabetçi inhibitörleri, protein izoformlarının ve mutantlar için bağlama güçlerini bağlama ortağa karşılaştırmak için çok önemli bir parametredir. Ayrılma sabitler ilişkili karşı ücretsiz ligand konsantrasyonu olarak bağlama eğrileri komplo tarafından belirlenir. Buna ek olarak, ilişkili ligand konsantrasyonu orantılı bir sinyal eklenen ligand, toplam konsantrasyonu karşı çizilen titrasyon eğrileri kaydetmek çok daha kolaydır. Sinyal spectroscopically ve enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) tarafından tespit edilebilir. Bu bir titrasyon yılan zehri elde edilen rhodocetin α2β1 Integra, onun immobilize hedef etki alanına bağlama ölçer ELISA için bir protokol içinde örneklenir. Titrasyon ELISAs çok yönlü ve geniş kullanılmış. Herhangi bir çiftini etkileşen proteinlerin immobilize reseptörü ve çözünür ligand her iki protein saf ve onların konsantrasyonları bilinen koşuluyla kullanılabilir. Zorluk defa ayrışma sabiti titrasyon eğrisi üzerinden belirlemek olmuştur. Bu çalışmada, titrasyon eğrileri altta yatan bir matematiksel işlev giriliyor. Bir doygunluk verim herhangi bir hataya grafik tahmini, bu algoritma doğrusal olmayan regresyon ile matematiksel değerlendirme tarafından doğrudan ham veri (sinyal kırmızının koyulukları eklenen ligand farklı konsantrasyonlarda) işleme izin verir. Böylece, birkaç titrasyon eğrileri aynı anda kaydedildi ve aralarında ayrışma sabiti ve bağlama-aktif reseptör, konsantrasyon karakteristik parametreleri kümesini haline dönüştürdü ve istatistiksel olarak değerlendirilebilir. Bu algoritma ile birleştirildiğinde, titrasyon ELISAs doğrudan ayrışma sabiti sunma avantajı kazanmak. Bu nedenle, onlar daha verimli bir şekilde gelecekte kullanılabilir.

ELISA sonra geliştirilmiştir, dönüştürülmüş alkalen fosfataz substrat, para- nitrophenolate sarı rengini, ilişkili rhodocetin ligand tutarı eklenen rhodocetin konsantrasyonları azaltılarak azalır gösterir sütun 1-11 (şekil 1). Sütun 12 rhodocetin-Alerjik Wells renksiz wells bir düşük arka plan sinyal göster.
Fotometrik miktar itibariyle 405 nm doğrudan bir analiz yaz...

Watch this Scientific Journal Video about Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction at JoVE.com

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titrasyon ELISA gerçekleştirmek için detaylı bir protokol açıklanmıştır. Ayrıca, yeni bir algoritma titrasyon ELISAs değerlendirmek için ve plaka immobilize microtiter reseptör için çözünür bir ligand bağlayıcı bir ayrışma sabiti edinmek için sunulmaktadır.

Titrasyon ELISA reseptör Ligand etkileşim ayrışma sabiti belirlemek için bir yöntem olarak

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

titration-elisa-as-method-to-determine-dissociation-constant-receptor

Research

JoVE Journal

Biochemistry

19.6K Görüntüleme.  University of Münster. Titrasyon ELISA gerçekleştirmek için detaylı bir protokol açıklanmıştır. Ayrıca, yeni bir algoritma titrasyon ELISAs değerlendirmek için ve plaka immobilize microtiter reseptör için çözünür bir ligand bağlayıcı bir ayrışma sabiti edinmek için sunulmaktadır.

Video: Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Biyokimya

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content is rather low in all organisms, amounting in plants to about 0.009% of dry weight. To date, one of the most accurate methods for measuring iron concentration in plant tissues is flame absorption atomic spectroscopy. However, this approach is time-consuming and expensive and requires specific equipment not commonly found in plant laboratories. Therefore, a simpler, yet accurate method that can be routinely used is needed. The colorimetric Prussian Blue method is regularly used for qualitative iron staining in animal and plant histological sections. In this study, we adapted the Prussian Blue method for quantitative measurements of iron in tobacco leaves. We validated the accuracy of this method using both atomic spectroscopy and Prussian Blue staining to measure iron content in the same samples and found a linear regression (R2 = 0.988) between the two procedures. We conclude that the Prussian Blue method for quantitative iron measurement in plant tissues is precise, simple, and inexpensive. However, the linear regression presented here may not be appropriate for other plant species, due to potential interactions between the sample and the reagent. Establishment of a regression curve is thus needed for different plant species.

We present a simple and reliable protocol for measuring iron content in plant tissues using the colorimetric Prussian Blue method.

Demir içeriği tesislerinde ölçme kolorimetrik yöntemi

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the structure-function relationship of these receptors in situ, we need to visualize and track them on the live cell surface with enough spatiotemporal resolution. Here we show how to use recently developed Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) to image T-cell receptors (TCRs) four-dimensionally (4D, space and time) at the live cell membrane. T cells are one of the main effector cells of the adaptive immune system, and here we used T cells as an example to show that the signaling and function of these cells are driven by the dynamics and interactions of the TCRs. LLSM allows for 4D imaging with unprecedented spatiotemporal resolution. This microscopy technique therefore can be generally applied to a wide array of surface or intracellular molecules of different cells in biology.

The goal of this protocol is to show how to use Lattice Light-Sheet Microscopy to four-dimensionally visualize surface receptor dynamics in live cells. Here T cell receptors on CD4+ primary T cells are shown.

Yüzey T-Hücre Reseptör Dinamiklerini Dört Boyutlu Olarak Kafes Işık Sayfası Mikroskobu Kullanarak Görselleştirme

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and withdrawal properties of natural products is described. Experimental assays benefitting from unique aspects of planarian physiology have been applied to studies on wound healing, regeneration, and tumorigenesis. In addition, because planarians exhibit sensitivity to a variety of environmental stimuli and are capable of learning and developing conditioned responses, they can be used in behavioral studies examining learning and memory. Planarians possess a basic bilateral symmetry and a central nervous system that uses neurotransmitter systems amenable to studies examining the effects of neuromuscular biomodulators. Consequently, experimental systems monitoring planarian movement and motility have been developed to examine substance addiction and withdrawal. Because planarian motility offers the potential for a sensitive, easily standardized motility assay system to monitor the effect of stimuli, the planarian locomotor velocity (pLmV) test was adapted to monitor both stimulation and withdrawal behaviors by planarians through the determination of the number of grid lines crossed by the animals with time. Here, the technique and its application are demonstrated and explained.

Planarian motility is used to gauge the stimulant and withdrawal properties of natural products when compared to the movement of the animals in spring water alone.

Doğal Ürünlerin Biyomodülasyon Özelliklerini Ölçmek için Bir Planarian Motilite Tsay

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins of several nucleotide-derived secondary messengers (NSMs) have been systematically identified and studied in model organisms. These achievements are mainly due to the development of several new techniques including the capture compound technique and the differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA), which were used to systematically identify target proteins of these small molecules. This paper describes the use of the NSMs, guanosine penta- and tetraphosphates (p)ppGpp, as an example and video demonstration of the DRaCALA technique. Using DRaCALA, 9 out of 20 known and 12 new target proteins of (p)ppGpp were identified in the model organism, Escherichia coli K-12, demonstrating the power of this assay. In principle, DRaCALA could be used for studying small ligands that can be labeled by radioactive isotopes or fluorescent dyes. The critical steps, pros, and cons of DRaCALA are discussed here for further application of this technique.

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

The Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA) can be used to identify small ligand binding proteins of an organism by using an ORFeome library.

Ligand Tahlilinin Diferansiyel Radyal Kılcal Etkisi ile Küçük Ligandların Bağlayıcı Proteinlerinin Tanımlanması (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this enzyme can hydrolyze dNTPs into their corresponding nucleosides and inorganic triphosphates. Due to its critical role in nucleotide metabolism, its association to several pathologies, and its role in therapy resistance, intense research is currently being carried out for a better understanding of both the regulation and cellular function of this enzyme. For this reason, development of simple and inexpensive high-throughput amenable methods to probe small molecule interaction with SAMHD1, such as allosteric regulators, substrates, or inhibitors, is vital. To this purpose, the enzyme-coupled malachite green assay is a simple and robust colorimetric assay that can be deployed in a 384-microwell plate format allowing the indirect measurement of SAMHD1 activity. As SAMHD1 releases the triphosphate group from nucleotide substrates, we can couple a pyrophosphatase activity to this reaction, thereby producing inorganic phosphate, which can be quantified by the malachite green reagent through the formation of a phosphomolybdate malachite green complex. Here, we show the application of this methodology to characterize known inhibitors of SAMHD1 and to decipher the mechanisms involved in SAMHD1 catalysis of non-canonical substrates and regulation by allosteric activators, exemplified by nucleoside-based anticancer drugs. Thus, the enzyme-coupled malachite green assay is a powerful tool to study SAMHD1, and furthermore, could also be utilized in the study of several enzymes which release phosphate species.

SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase with critical roles in human health and disease. Here we present a versatile enzyme-coupled SAMHD1 activity assay, deployed in a 384-well microplate format, that allows for the evaluation of small molecules and nucleotide analogues as SAMHD1 substrates, activators, and inhibitors.

dNTPase SAMHD1 ile Küçük Molekül Etkileşimini Araştırmak için Yüksek Verimli Enzime Bağlı Aktivite Testi

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, penicillin, paclitaxel, rapamycin, or artemisinin, commonly used in medical practice, have been first identified and isolated from natural products. However, the identification and isolation of biologically active specialized metabolites from natural sources is a challenging and time-consuming process. Traditionally, individual metabolites are isolated and purified from complex mixtures, following the extraction of biomass. Subsequently, the isolated molecules are tested in functional assays to verify their biological activity. Here we present the use of cellular membrane affinity chromatography (CMAC) columns to identify biologically active compounds directly from complex mixtures. CMAC columns allow for the identification of compounds interacting with immobilized functional transmembrane proteins (TMPs) embedded in their native phospholipid bilayer environment. This is a targeted approach, which requires knowing the TMP whose activity one intends to modulate with the newly identified small molecule drug candidate. In this protocol, we present an approach to prepare CMAC columns with immobilized tropomyosin kinase receptor B (TrkB), which has emerged as a viable target for drug discovery for numerous nervous system disorders. In this article, we provide a detailed protocol to assemble the CMAC column with immobilized TrkB receptors using neuroblastoma cell lines overexpressing TrkB receptors. We further present the approach to investigate the functionality of the column and its use in the identification of specialized plant metabolites interacting with TrkB receptors.

The protocol describes the preparation of cell membrane affinity chromatography (CMAC) columns with immobilized cell membrane fragments containing functional transmembrane tropomyosin kinase receptor B proteins. The use of CMAC columns in the identification of specialized plant metabolites interacting with these receptors and present in complex natural mixtures is also explained.

İmmobilize Tropomiyozin Kinaz Reseptörü B ile Etkileşime Giren Özel Bitki Metabolitlerini Tanımlamak için Hücresel Membran Afinite Kromatografisi Sütunları

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...