Bu çalışma, NSF hibe MCB-0817827 tarafından desteklenen oldu.

Izotermal titrasyon kalorimetri (ITC) bir deneyde bağlayıcı bir etkileşim tüm termodinamik parametreler (yakınlık, entalpi ve stokiyometri) belirleyebilirsiniz iyi kurulmuş teknik, izotermal şartlar altında ikinci bir reaktanı bir reaktanı titre 1 ITC çalışır . Ölçülen sinyal iki reaktanları etkileşimi üzerine serbest (bağlama) veya emilen ısı. Bir dizi enjeksiyon yapılır ve ısı sinyali sınırlayıcı reaktanı doygun hale sıfır yaklaşım olacaktır. Izoterm Montaj termodinamik parametreleri verir. Bazı değerlendirmeleri enstrümantasyon yanı sıra veri toplama ve analiz matematik anlatan kullanılabilir. 2,3 diğer kalorimetreleri mevcut olmakla birlikte (en önemlisi küçük hacimleri ile ITC 200), biz burada genel bir protokol VP-ITC için imal tarif MicroCal tarafından (artık GE Healthcare parçası). 1. Hazırlanması Örnekleri <ol><li> Tampon makromolekül ve ligand hazırlamak için, bazı olası sorunları ele alınması gerekir. Doğru uyan makromolekül uygun konsantrasyonları, genellikle örnek ITC hücre ve ligand gider türleri, enjeksiyon şırınga tür gerektirir. Çünkü bazı proteinler enjeksiyon şırınga türler için gerekli olan yüksek konsantrasyonlarda agrega protein, çoğu zaman örnek hücre içine yüklenir. Optimal makromolekül konsantrasyon ITC kullanmadan önce ortogonal yöntemler kullanılarak tahmin edilebilir &quot;c&quot;, sistemin tahmin edilen benzeşim ürünü, ve toplam makromolekül konsantrasyonu belirlenir c = K a * [M]. C aralığı 10-1000, 1 Optimal değerler alt sınırının c değerleri ile belirli deneysel koşullar altında zayıf bağlama sistemleri için doğru veri elde etmek mümkün olsa Böylece 4 makromolekül konsantrasyonu bu aralığın ile tespit edilmelidir c akılda değerleri (yani, bir K 10 6 M -1, 10 1000 mcM makromolekül konsantrasyonlarda kullanılması gerekir). Afinitesi sistem hakkında önceden bilgi sahibi ITC deneyi daha iyi bir tasarım ile ITC için kullanılan protein en aza indirmeye yardımcı olabilir. Bu doygunluk titrasyon yarısı ilk üç içinde meydana gelir ligand konsantrasyonu (7-25 kat zayıf ligand bağlanma yeri için K d daha konsantre) kadar büyük olmalıdır. Verileri doğru uydurma da doygunluk sinyali gerektirir. Yüksek afinitesi olan sistemler için, daha düşük bir ligand konsantrasyonu yanlış uyan verecek, çok erken titrasyon doygunluğunu önlemek için kullanılmalıdır. Bir kez seyreltme kontrol ısı (yani tampon içine ligand titrasyon) titrasyon çıkarılır, doygunluk entalpi sıfır yaklaşım gerekir. </li><li> Küçük molekül kirleri ITC ölçümleri artefakt sinyaller ortaya çıkmasına neden olabilir, çünkü makromolekül ve ligand ince ayrıntısına kadar tampon karşı diyalize olması, mümkünse, en iyisidir. Alternatif olarak, kolon kromatografisi, dönüş sütun tuzsuzlaştırma, ya da tampon değişimi santrifüj filtreleri (örneğin, Centricons) makromolekül tampon değiştirmek için kullanılabilir. Ligand küçük bir molekül ise, makromolekül küçük moleküller için uygun (yani 100-500 Da Spectra / Por Float-A-Lyzer kesilecek Diyaliz membranları karşı diyaliz diyaliz veya edildikten sonra diyaliz tampon kullanılarak hazırlanmış olabilir .) Ligand ve macromolecule çözümler arasında tampon kompozisyonu farklılıklar örneklerde safsızlıkların seyreltme ısı eserler sinyal yol açabilir. Hazırlandıktan sonra, entalpi gölgeleri, tampon, makromolekül ve ligand maç pH (± 0.05 pH birimi) tampon protonasyon etkileri nedeniyle ortaya çıkabilir emin olmak için kontrol edin. 5 her tür yeterince hazırlamak için emin olun . Üç nüsha deney ve seyreltme kontrolü için gerekli malzeme miktarı, kullanılan ITC bağlıdır. Ancak, yaklaşık 2 ml hacimli numune hücreleri en ITC enstrümanlar için makromolekül çözüm en az 6-7 ml gereklidir olacak ve 15 ml şahin tüpleri uygun hazırlanmış olabilir. 300 mcL enjeksiyon şırınga için, 1-2 ml çözüm yeterli olmalı ve şahin tüpler veya mikrosantrifüj tüpleri ya da hazırlanmış olabilir. </li><li> Toz ve diğer partiküller, ITC değeri şekilden temel eserler neden olabilir. Bu deney çalıştırmadan önce çıkarılmasını zorunludur. Örnek stok çözümleri ön hazırlıktan sonra, numuneler, 8000 çözüm pelet parçacıklar 14.000 RPM için beş dakika mikrosantrifüj tüpler santrifüj edilmelidir. Süpernatantı pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak ve yeni bir Şahin / mikrosantrifüj tüp içine koyun. Reductants azaltılmış cysteines korumak için gerekli ise, β-Merca düşük konsantrasyonlarda ve taze stokları kullanınptoethanol, TCEP (tris (2-karboksil) fosfin) veya dithiothreitol indirgeyici oksidasyon nedeniyle herhangi bir eser en aza indirmek için. Ayrıca, organik çözücüler (çözünür için metanol veya DMSO gerekebilir bazı küçük molekül ligandlar için ortak) varlığı tampon sinyali eserler neden olabilir. Eğer organik çözücüler ligand için gerekli olan, daha sonra makromolekül çözüm organik çözücü seyreltme sıcaktan kaynaklanan herhangi bir sinyal önlemek için de aynı konsantrasyonu içermelidir. Ligand cosolvents nedeniyle makromolekül arasındaki tampon bileşimi hafif farklılıklar, tuz veya pH örneklerinin hazırlanması sırasında mümkündür. Makromolekül içine örnek tampon veya numune tamponu içine tampon içerik farklılıklardan kaynaklanan ısı sinyalleri sadece kalıntılarından kaynaklanan veri neden olmamasını sağlamak için seyreltme ligand kontrol etmek en iyisidir. </li><li> Dikkatlice tam konsantrasyonları kayıt sistemine uygun teknikleri (absorbans ölçümleri, HPLC, kolorimetrik testleri, proteinler için BCA testleri, vb gibi) kullanarak makromolekül ve ligand konsantrasyonları kontrol edin. Izoterm sığdırmak için kullanılan gerçek konsantrasyon ve konsantrasyonu farklılıklar stokiyometri, entalpi ve deney belirlenen afinitesi hatalarına neden olur. Bu, özellikle yüksek sıcaklıklarda hava kabarcıkları veya titrasyon sırasında çözünmüş gazları salınımı nedeniyle sinyal eserler, önlemek için gazını örnekleri yaygındır. </li></ol> 2. Deney ayarlama <ol><li> Örnek hücre ve enjeksiyon şırınga makromolekül ve ligand yükleme önce üretici firmanın protokolüne göre temizlenir emin olun. Örnek hücresi, iki veya üç kez 1.8 ml distile su Hamilton şırınga (varil kolayca kırık olarak Hamilton şırınga veya iğne bükük ile dikkatli) kullanarak ile durulayın. Sonraki tampon 1.8 ml örnek hücre birkaç kez yıkayın. Kabarcık oluşumunu önlemek için dikkatli olmak, macromolecule çözüm 1.8 ml örnek hücre yükleyin. </li><li> Referans hücre saf su ile doldurun. En tamponlar için, distile su referans çözüm olarak kullanmak için iyidir. Ancak, özellikle yüksek iyonik güçlü veya osmolalitesi tamponlar, tampon bir referans olarak kullanmak daha iyidir. </li><li> Hamilton şırınga yardımıyla referans ve örnek hücreleri hava kabarcıklarını çıkarın. Şırınga, iğne, hücrenin altındaki ve hücrenin en iyi ekli herhangi bir kabarcıkları vurma hücre kenarları yukarı ve aşağı yavaşça hareket. Örnek ve referans hücreler herhangi bir aşırı ses çıkarın. </li><li> Plastik bir enjektör boru kullanarak enjeksiyon şırınga doldurma bağlantı noktasına takın. Enjeksiyon şırınga saf su ile durulayın. Durulama tarafından bir tampon uygulayın. Enjeksiyon şırınga sistemi aracılığıyla hava çekerek tamamen boşaltılmış olduğundan emin olun. Tüm şırınga dolana kadar ligand çözüm içine enjeksiyon şırınga iğnesi enjeksiyon enjektör içine yerleştirin ve ligand çözümü çizmek. Liman ve ekli boru içine biraz fazla hacmi (yaklaşık 50 ul veya daha fazla) çizmeye devam. Hemen şırınga doldurma portu kapatmak ve boru ve plastik şırınga ayırmak. Şırınga herhangi bir kabarcıkları kaldırmak için Temizle ve dolum enjeksiyon şırınga iki kez daha. Ligand çözüm şırınga çıkarın ve bu şırınga ses çıkarabilir kimwipe şırınga ucu dokunmamaya dikkat ederek, kimwipe herhangi bir damla kaldırmak için bir yan silin. Ayrıca, bu da şırınga ucu hacim kaybına neden olabilir şırınga vurmayın veya kavanoza dikkatli olun. Örnek hücre içine enjeksiyon şırınga yerleştirin. </li><li> ITC çalıştırmak için parametreleri ayarlayın. Güçlü ısı sinyalleri ile bağlayıcı sistemler için, düşük hacimli enjeksiyonlar çok sayıda montaj için daha fazla veri noktaları (örneğin 3 ul 75 enjeksiyon) verecektir. Zayıf ısı sinyallerini sahip sistemler için, az sayıda büyük hacimli enjeksiyonlar (8 ul örneğin 33 enjeksiyon) tercih. En sık olarak, yüksek enjeksiyon hacimleri ile daha az enjeksiyonlar kullanılır. Bu sizin sisteminiz için en iyi koşulları optimize etmek için birkaç titrasyonları sürebilir. Bağlayıcı entalpi çalışılan sisteme bağlı olarak, ekzotermik yada endotermik olduğunu not etmek önemlidir. Ne yazık ki, bazı sistemler, ısı tepki belirlemek zor hale, düşük ısı sinyalleri var. Potansiyel olarak bu tür sistemleri ile ilgili problemler, makromolekül konsantrasyonu artırarak, değişen sıcaklık deneyi (bağlama sistemi ısı kapasitesine bağlı olarak), ve / veya pH değerini değiştirerek veya tamponun iyonik gücü tarafından aşılabilir. </li><li> Ayrıca her enjeksiyon arasındaki zaman aralığı göz önünde bulundurun. Ligand, her enjeksiyondan sonra, sistem denge sağlaması için süre verilir şarttır ve sonraki enjeksiyon meydana gelmeden önce ısı sinyali başlangıca döner. Çoğu sistemde, 3-5 minutes yeterli olmalıdır. Enjeksiyonlar arasındaki süre, dengeleme beş dakika içinde oluşmaz sistemleri için artırılması gerekmektedir. </li><li> Örnek hücre içine eklenir kez enjeksiyon şırınga makromolekül ve ligand çözümleri arasında biraz da karışıklık olacağı için, ilk enjeksiyon sahte sonuçlar verecektir. Bu ilk bir veya iki enjeksiyon (bu yüzden daha sonra iptal edilebilir) için küçük hacimli (örneğin 2 ul) ve istediğiniz değerleri sonraki enjeksiyonlar tutmak en iyisidir. </li><li> Deney sıcaklığı (25 ° C arasındaki sıcaklıklarda 2 ile 80 ° C kullanılabilmesine rağmen, en yaygın olarak). Seçin Ligand makromolekül sistemi üzerinde yapılan diğer deneylerin (bağlama, kinetiği, vb.) Eşleşen bir sıcaklık seçmek için en iyisidir. ITC deney sıcaklığı farklı bir sıcaklıkta dengeye kurulabilir. Deney fazla 10 ° C uzakta oda sıcaklığında bir sıcaklıkta olacak ise, o zaman 5 ° C deneysel sıcaklık içinde araç dengeleme sıcaklığını ayarlamak için iyi. Bu cihaz deney sıcaklığına ulaşmak için alacaktır zaman azalacaktır. Şırınga karıştırma hızı da göz önüne alınması gerekiyor. Karıştırma titrasyon sırasında ligand ve makromolekül yeterli karıştırma için gerekli, ancak bazı proteinler hızlı karıştırarak istikrarsızlaştırdı. Bu gibi durumlar için, karıştırma hızı nispeten düşük bir oranda ayarlanmış olmalıdır. Bir kez tüm deneysel parametreleri, daha sonra deney başlamış olabilir kurmak olmuştur. </li><li> Deney bittikten sonra, ITC, üretici firmanın protokolüne göre temizlenir. Makromolekül-ligand kompleks karışımı ilave deneyler istendiğinde, deney sonunda örnek hücre çözüm tutulabilir. </li><li> Titrasyonları tekrarlanabilir verileri almak için en az bir ya da iki kez daha tekrarlayın. Ligand ligand için seyreltme ısı belirlemek için örnek hücre içine tampon titre edilir bir kontrol çalıştırın. Bazı sistemler için bağlayıcı süreci hakkında kooperatif bağlama, ek bilgi yoktur makromolekül ligand içine enjekte edilerek elde edilebilir. Farklı enjeksiyon yönelimleri küresel montaj için yararlı olabilir ek bilgi verebilir. 6 </li></ol> 3. Veri analizi <ol><li> Veri Montaj kolayca herhangi bir veri montaj programı (genellikle cihaz ile birlikte üretici tarafından sağlanan) makrolar kullanılarak yapılabilir. Ilk veri dosyası yükleyin. Herhangi bir işaret sinyal hava kabarcıkları veya diğer eserler için ham değeri şekilden kontrol edin. (O zaman noktasında herhangi bir enjeksiyon vardı temel ya da zirveleri ani gibi) herhangi bir eser varsa, bunlar kaldırılacak olması gerektiği gibi, daha sonra bu veri noktalara dikkat. Sonra, ligand seyreltme kontrol verileri yük ve ligand bağlayıcı izoterm seyreltme veri çıkarma. Şu anda, seyreltme eserler meydana gelen titrasyon ilk bir veya iki veri noktası (7. adıma bakınız) dahil olmak üzere, tüm sahte veri noktaları çıkarın. </li><li> Verilerin sığması amacıyla kullanılmak üzere veri uydurma modeli (bir bağlanma yeri, iki / çoklu bağlayıcı siteleri, kooperatif bağlama, vb.) Seçin. Verileri (K), uydurma parametreleri, stokiyometri (n), entalpi (ΔH) ve bağlanma afinitesi ilk tahmin uygun olabilir . Afinitesi veya diğer parametreler önceden bilgi, dik deneyler bilinen ise, bu değerler girilebilir. Bu uydurma sırasında yerel minimum sıkışıp haline uyum uzak durmanıza yardımcı olur. Veri ilk titrasyon için uygun edildikten sonra, geri kalanı için izotermleri 15 ve 16. adımları tekrarlayın. Alternatif olarak, veriler, dünyada bu tür SEDPHAT programları kullanarak uygun olabilir 6 SEDPHAT üçlü karmaşık veri setleri ile birlikte ikili karmaşık veri setleri (yani moleküller A + B) küresel uydurma özellikle yararlı olabilir (moleküller A + B + C) . Örneğin, bir AB karmaşık molekül C bağlayıcı (tam doymuş değilse) A ya da B, C bağlayıcı nedeniyle herhangi bir sinyal olabilir mi her zaman açık değildir. </li><li> ITC verileri artefakt olduğundan emin olmak için, afinitesi ve ITC elde stoichiometries dik bir yöntem ile karşılaştırıldığında olmalıdır. 7,8 Ayrıca, ITC van&#39;t Hoff arsa entalpi entalpi değeri mukayese edilebilir. 9 Ayrıca, artan macromolecule konsantrasyon ile ısı sinyali mutlak değerini artırmak gerektiği gibi ligand veya makromolekül farklı konsantrasyonlarda kullanmak yararlı olabilir. Eserleri, hücre ve şırınga tamponlar uyumlu değilse ortaya çıkması en muhtemel. Eserler için bir başka olasılık saf örnekleri ortaya çıkar. </li><li> Biz K d ve stoich önceki bilgi yoktur kullanıcı için basit bir ikili karmaşık titrasyonları ile başlamanızı öneririziometry. Daha sonra, eğer ek ligandlar bağlayan, kullanıcı ligand konsantrasyonları farklı, daha karmaşık bir üçlü kompleksi titrasyonları deneyebilirsiniz, ve belki de şırınga ve hücre bileşenleri anahtarlama. Entalpi bir devlet fonksiyonu olarak, hem de yolları için üçlü kompleks oluşum entalpisi bir karşılaştırma katkı olmalıdır. 10, SEDPHAT 6, burada oldukça yararlı muhtemeldir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2796/2796fig1.jpg" /> Şekil 1. E. NADPH kofaktör bağlama için iyi davranmış titrasyon bir temsilci örnek coli kromozom dihidrofolat redüktaz (ecDHFR). Paneli (A), ham değeri şekilden gösterir; (B), entegre değeri şekilden uyum bağlayıcı izoterm Kökeni yazılım bir yerinde modeli kullanarak ve (C) boyunca SEDPHAT izoterm uygun bir bağlayıcı site modeli kullanılarak fit artıklar. Kökeni yazılımı, tek bir site bağlama modelini kullanarak, n = 1.09 ± 0.02, K d = 0.194 ± 0.001 mcM, H = -22,7 ± 0,4 kcal / mol, TΔS = -13.1 ± 0.4 kcal / mol ve işaretiyle karar verilir = - 9.16 ± 0.01 kcal / mol. Sedphat 0.94 n göze kullanarak veri uyar ± 0.01, 0.195, K d ± 0.013 ΔM, bir ΔH -22.5 ± 0.2 kcal / mol, -13,39, TΔS kcal / mol ve -9,15 kcal / mol, işaretiyle karar verilir.

<ol>
	<li>Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+binding+constants+and+heats+of+binding+using+a+new+titration+calorimeter.">Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter.</a> Anal. Biochem. 179, 131-137 (1989).</li><li>Jelesarov, I., Bosshard, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+and+differential+scanning+calorimetry+as+complementary+tools+to+investigate+the+energetics+of+biomolecular+recognition.">Isothermal titration calorimetry and differential scanning calorimetry as complementary tools to investigate the energetics of biomolecular recognition.</a> J. Mol. Recognit. 12, 3-18 (1999).</li><li>Velazquez-Campoy, A., Leavitt, S. A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein-protein+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry.">Characterization of protein-protein interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Methods Mol. Biol. 261, 35-54 (2004).</li><li>Turnbull, W. B., Daranas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+value+of+c:+can+low+affinity+systems+be+studied+by+isothermal+titration+calorimetry.">On the value of c: can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 14859-14866 (2003).</li><li>Fukada, H., Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enthalpy+and+heat+capacity+changes+for+the+proton+dissociation+of+various+buffer+components+in+0.1+M+potassium+chloride.">Enthalpy and heat capacity changes for the proton dissociation of various buffer components in 0.1 M potassium chloride.</a> Proteins. 33, 159-166 (1998).</li><li>Houtman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+multisite+binary+and+ternary+protein+interactions+by+global+analysis+of+isothermal+titration+calorimetry+data+in+SEDPHAT:+application+to+adaptor+protein+complexes+in+cell+signaling.">Studying multisite binary and ternary protein interactions by global analysis of isothermal titration calorimetry data in SEDPHAT: application to adaptor protein complexes in cell signaling.</a> Protein Sci. 16, 30-42 (2007).</li><li>Bradrick, T. D., Beechem, J. M., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+binding+stoichiometries+and+cooperativity+are+observed+during+binary+and+ternary+complex+formation+in+the+single+active+pore+of+R67+dihydrofolate+reductase,+a+D2+symmetric+protein.">Unusual binding stoichiometries and cooperativity are observed during binary and ternary complex formation in the single active pore of R67 dihydrofolate reductase, a D2 symmetric protein.</a> Biochemistry. 35, 11414-11424 (1996).</li><li>Shenoy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+and+multivalent+binding+between+cyanovirin-N+and+branched+oligomannosides:+calorimetric+and+NMR+characterization.">Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization.</a> Chem. Biol. 9, 1109-1118 (2002).</li><li>Chopra, S., Lynch, R., Kim, S. H., Jackson, M., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+and+viscosity+on+R67+dihydrofolate+reductase+catalysis.">Effects of temperature and viscosity on R67 dihydrofolate reductase catalysis.</a> Biochemistry. 45, 6596-6605 (2006).</li><li>Norris, A. L., Serpersu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Coenzyme+A+with+the+Aminoglycoside+Acetyltransferase+(3)-IIIb+and+Thermodynamics+of+a+Ternary+System.">Interactions of Coenzyme A with the Aminoglycoside Acetyltransferase (3)-IIIb and Thermodynamics of a Ternary System.</a> Biochemistry. 49, 4036-4042 (2010).</li><li>Falconer, R. J., Penkova, A., Jelesarov, I., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2008:+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">Survey of the year 2008: applications of isothermal titration calorimetry.</a> J. Mol. Recognit. 23, 395-413 (2010).</li><li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2005:+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> J. Mol. Recognit. 20, 4-14 (2007).</li><li>Buurma, N. J., Haq, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+analysis+of+isothermal+titration+calorimetry+data+for+ligand-DNA+interactions.">Advances in the analysis of isothermal titration calorimetry data for ligand-DNA interactions.</a> Methods. 42, 162-172 (2007).</li><li>Salim, N. N., Feig, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+of+RNA.">Isothermal titration calorimetry of RNA.</a> Methods. 47, 198-205 (2009).</li><li>De, M., You, C. C., Srivastava, S., Rotello, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+interactions+of+proteins+with+functionalized+nanoparticles:+a+thermodynamic+study.">Biomimetic interactions of proteins with functionalized nanoparticles: a thermodynamic study.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 10747-10753 (2007).</li><li>Velazquez-Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+to+determine+association+constants+for+high-affinity+ligands.">Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands.</a> Nat. Protoc. 1, 186-191 (2006).</li><li>Velazquez Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ITC+in+the+post-genomic+era...?+Priceless.">ITC in the post-genomic era...? Priceless.</a> Biophys. Chem. 115, 115-124 (2005).</li><li>Harries, D., Rau, D. C., Parsegian, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solutes+probe+hydration+in+specific+association+of+cyclodextrin+and+adamantane.">Solutes probe hydration in specific association of cyclodextrin and adamantane.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 2184-2190 (2005).</li><li>Chervenak, M. C., Toone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+measure+of+the+contribution+of+solvent+reorganization+to+the+enthalpy+of+binding.">A direct measure of the contribution of solvent reorganization to the enthalpy of binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 116, 10533-10539 (1994).</li><li>Taneva, S. G., Moro, F., Velazquez-Campoy, A., Muga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+nucleotide-induced+DnaK+conformational+states.">Energetics of nucleotide-induced DnaK conformational states.</a> Biochemistry. 49, 1338-1345 (2010).</li><li>Jelesarov, I., Bosshard, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+ferredoxin+binding+to+ferredoxin:NADP++reductase+and+the+role+of+water+at+the+complex+interface.">Thermodynamics of ferredoxin binding to ferredoxin:NADP+ reductase and the role of water at the complex interface.</a> Biochemistry. 33, 13321-13328 (1994).</li><li>Burrows, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+monomer-dimer+equilibrium+of+interleukin-8+reveals+it+is+a+monomer+at+physiological+concentration.">Determination of the monomer-dimer equilibrium of interleukin-8 reveals it is a monomer at physiological concentration.</a> Biochemistry. 33, 12741-12745 (1994).</li><li>Baker, B. M., Murphy, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+linked+protonation+effects+in+protein+binding+reactions+using+isothermal+titration+calorimetry.">Evaluation of linked protonation effects in protein binding reactions using isothermal titration calorimetry.</a> Biophys. J. 71, 2049-2055 (1996).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

ITC ligand makromolekül etkileşimleri, 11, 12 DNA-13 ve RNA makromolekül 14 çalışma ligand, protein-ligand bakarak çalışmaları ile eğitim yaygın olarak kullanılan olmuştur . ITC bile üniforma süspansiyonlar formu gibi nanopartiküller gibi sağlam malzemeler, Ayrıca 15, bir ligand zaten makromolekül bağlı ve ikinci bir ligand titre üçlü sistemler, termodinamik belirlemek için kullanılabilir, Örneğin, bir enzim kofaktör sistemi substrat bağlanması 7 Araştırmalar aynı zamanda, normalde zayıf bağlayıcı ligandlar ile rekabet bağlayıcı deneyleri yaparak ITC algılama sınırını aşacak çok yüksek bağlanma afiniteleri ile moleküller için yapılabilir. 16 zayıf bağlayıcı Bilgiler son 19 ligandlar rekabet analizleri ile de elde edilebilir. 17 su bağlama rolü çözücü yeniden yapılanma entalpi bağımlılığı ile birlikte, 18 ITC tarafından keşfedilmeyi olabilir. DNAK varyantlarının konformasyonel değişim termodinamik bağlayıcı üzerine ölçüldü ADP ve ATP bağlayıcı entalpi 20 protein-protein birliği hetero kompleksleri 21 homo-dernek hakkında bilgilerin yanı sıra verimli, ITC tarafından incelenecektir. 22 Sıcaklık etkileri bağlayıcı olay ısı kapasitesi 2 numara verecektir. ek ITC çalışmaları farklı pH değerlerinde yapılırsa proton emilir veya bağlayıcı üzerine yayımlanan iyonizasyon farklı entalpisi ile tampon yapılan deneyler de tespit edilebilir. 5 pKa katılan grup, daha sonra potansiyel olarak tespit edilebilir. 23 Özetlemek gerekirse, makromolekül ve ligand konsantrasyonu iyi bir ITC deneyi için doğru ölçümler zorunludur. Örnek konsantrasyonları da güvenilir veri elde etmek için uygun bir aralık içinde olması gerekir. Küçük molekül kirlilikler ve pH uyumsuzlukları değeri şekilden gölgeleri neden olacaktır Bakım tamponu ile alınmalıdır.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> 1.7 mL mikrosantrifüj tüpler </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-282 </td></tr><tr><td> 15 ml şahin borular </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49B </td></tr><tr><td> 2.5 mL Hamilton şırınga </td><td> MicroCal </td><td> SYN161714 </td></tr></tbody></table>

isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity

Izotermal titrasyon kalorimetri (ITC) bağlayıcı bir reaksiyon termodinamik resim anlamak için yararlı bir araçtır. Biyolojik bilimler, makromoleküler etkileşimleri hücre makine anlamak çok önemlidir. Tampon ve sıcaklık gibi deneysel koşullar, çalışılan belirli bir bağlama sistemi için uygun olabilir. Ancak, belirli bir ligand ve makromolekül konsantrasyon aralıkları yararlı veriler elde etmek için gerekli olduğundan, dikkatli bir planlama gereklidir. Makromolekül ve ligand konsantrasyonları güvenilir sonuçlar elde etmek için doğru bir şekilde tespit edilmesi gerekmektedir. Bakımı da kirleri deney önemli ölçüde etkileyebilir örnekleri hazırlanırken alınması gerekir. Stokiyometri, yakınlık ve entalpi gibi kontrollerle birlikte ITC deneyleri, doğru yapılır, yararlı bağlama bilgileri, elde edilir. Farklı tampon veya sıcaklık koşulları altında ilave deneyler çalıştıran, sistemi hakkında daha ayrıntılı bilgi elde edilebilir. ITC deneyi temel kurulum için bir protokol verilir.

Watch this Scientific Journal Video about Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity at JoVE.com

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Izotermal titrasyon kalorimetri orta bağlanma afiniteleri ile biyolojik sistemler için bağlayıcı termodinamik izlemek için kullanmak için genel bir protokol sunulmuştur.

Makromolekül-ligand Affinity Ölçüm İzotermal Titrasyon Kalorimetre

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction.  In biological ...

isothermal-titration-calorimetry-for-measuring-macromolecule-ligand

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biology

Unit 1

Acid–Base Titration

SCIENTISTS IN ACTION

52.5K Görüntüleme.  University of Tennessee. Izotermal titrasyon kalorimetri orta bağlanma afiniteleri ile biyolojik sistemler için bağlayıcı termodinamik izlemek için kullanmak için genel bir protokol sunulmuştur.

Video: Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.

In this video, we demonstrate an alternative method for detection and titering of viruses using an enzymatic antigen detection technique known as an immunoperoxidase assay. Here, we will show you how to collect your viral samples, prepare the cells for testing, and finally the immunoperoxidase assay using serial dilutions to determine the viral titer.

Immunoperoksidaz Testi İnsan coronavirüsleri Titrasyon

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

Biyoloji

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host macromolecule. ITC has some advantages over common spectroscopic approaches for studying host/ligand interactions. For example, the heat released or absorbed when the two components interact is directly measured and does not require any exogenous reporters. Thus the binding enthalpy and the association constant (Ka) are directly obtained from ITC data, and can be used to compute the entropic contribution. Moreover, the shape of the isotherm is dependent on the c-value and the mechanistic model involved. The c-value is defined as c = n[P]tKa, where [P]t is the protein concentration, and n is the number of ligand binding sites within the host. In many cases, multiple binding sites for a given ligand are non-equivalent and ITC allows the characterization of the thermodynamic binding parameters for each individual binding site. This however requires that the correct binding model be used. This choice can be problematic if different models can fit the same experimental data. We have previously shown that this problem can be circumvented by performing experiments at several c-values. The multiple isotherms obtained at different c-values are fit simultaneously to separate models. The correct model is next identified based on the goodness of fit across the entire variable-c dataset. This process is applied here to the aminoglycoside resistance-causing enzyme aminoglycoside N-6'-acetyltransferase-Ii (AAC(6')-Ii). Although our methodology is applicable to any system, the necessity of this strategy is better demonstrated with a macromolecule-ligand system showing allostery or cooperativity, and when different binding models provide essentially identical fits to the same data. To our knowledge, there are no such systems commercially available. AAC(6')-Ii, is a homo-dimer containing two active sites, showing cooperativity between the two subunits. However ITC data obtained at a single c-value can be fit equally well to at least two different models a two-sets-of-sites independent model and a two-site sequential (cooperative) model. Through varying the c-value as explained above, it was established that the correct binding model for AAC(6')-Ii is a two-site sequential binding model. Herein, we describe the steps that must be taken when performing ITC experiments in order to obtain datasets suitable for variable-c analyses.

ITC is a powerful tool for studying the binding of a ligand to its host. In complex systems however, several models may fit the data equally well. The method described here provides a means to elucidate the appropriate binding model for complex systems and extract the corresponding thermodynamic parameters.

Cilt Mekanizmaları belirleme Sipariş Değişken konsantrasyon İzotermal Titrasyon Kalorimetre Veri Kümeleri toplanıyor

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

Glikojenin Biyokimyasal titrasyonu<em&gt; In vitro</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Dan Tagged Çekirdeğin Affinity-tabanlı yalıtım<em&gt; Drosophila</emGen ekspresyon analizi için&gt; Dokular

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Lusiferaz ifade eden rekombinant virüsler yüksek verimlilik Titrasyon

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree of compositional heterogeneity of a complex do not usually impede progress in conducting such studies. In contrast, a complex intended for structural characterization should be purified in a state that is both compositionally and structurally homogeneous as well as at a higher concentration than required for proteomics. Recently, there have been significant advances in the application of electron microscopy for structure determination of large macromolecular complexes. This has heightened interest in approaches to purify native complexes of sufficient quality and quantity for structural determination by electron microscopy. The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been optimized to extract and purify an 18-subunit, ~ 0.8 MDa ribonucleoprotein assembly from budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) suitable for negative stain and electron cryo microscopy. Herein is detailed the modifications made to the TAP method, the rationale for making these changes, and the approaches taken to assay for a compositionally and structurally homogeneous complex.

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

Bir Tandem Affinity Etiket Yöntemiyle Yapısal Çalışmaları Yerli Komplekslerinin saflaştırılması

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between cells, the extracellular matrix, and soluble and non-soluble chemical factors (e.g., chemoattractants). Standard methods for measuring the migration of cells, such as the Boyden chamber assay, work by counting cells on either side of a divider. These techniques are easy to use; however, they offer little geometric modification for different applications. In contrast, microfluidic devices can be used to observe cell migration with customizable concentration gradients of soluble factors1,2. However, methods for making microfluidics based assays can be difficult to learn.
Here, we describe an easy method for creating cell culture chambers to measure cell migration in response to chemical concentration gradients. Our cell migration chamber method can create different linear concentration gradients in order to study cell migration for a variety of applications. This method is relatively easy to use and is typically performed by undergraduate students.
The microchannel chamber was created by placing an acrylic insert in the shape of the final microchannel chamber well into a Petri dish. After this, poly(dimethylsiloxane) (PDMS) was poured on top of the insert. The PDMS was allowed to harden and then the insert was removed. This allowed for the creation of wells in any desired shape or size. Cells may be subsequently added to the microchannel chamber, and soluble agents can be added to one of the wells by soaking an agarose block in the desired agent. The agarose block is added to one of the wells, and time-lapse images can be taken of the microchannel chamber in order to quantify cell migration. Variations to this method can be made for a given application, making this method highly customizable.

This protocol details a customizable method to measure cell migration in response to chemoattractants that may also be used to determine the diffusion rate of a drug out of a polymer matrix.

Ölçme Hücre Göç Bir Özelleştirilebilir Odası

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into protein function. Despite the importance of multi-PTM enrichment studies, few studies investigate more than one PTM at a time, due partially to the expenses, time, and large protein quantities required to perform multiple global proteomic analysis of PTMs. The &#34;one-pot&#34; affinity enrichment detailed in this protocol overcomes these barriers by permitting the simultaneous identification and quantification of peptides with lysine residues containing acetylation and succinylation PTMs with low amounts of sample input. The protocol involves preparation of protein lysate from mouse livers of SIRT5 knockout mice, performance of trypsin digestion, enrichment for PTMs, and performance of mass spectrometric analysis using a data-independent acquisition (DIA) workflow. Because this workflow allows for the enrichment of two PTMs from the same sample simultaneously, it provides a practical tool to study PTM crosstalk without requiring large amounts of samples, and it greatly reduces the time required for sample preparation, data acquisition, and analysis. The DIA component of the workflow provides comprehensive PTM-specific information. This is particularly important when studying PTM site localization, as DIA provides comprehensive sets of fragment ions that can be computationally deciphered to differentiate between different PTM localization isoforms.

This workflow describes the performance of time- and cost-efficient enrichment of multiple protein post-translational modifications (PTMs) simultaneously for quantitative global proteomic analysis. The protocol utilizes peptide-level PTM enrichment with multiple conjugated antibodies, followed by data-independent acquisition mass spectrometry analysis to gain biological insights into PTM crosstalk.

Niceleme ve Site Yerelleştirmesi Için İki Çeviri Sonrası Modifikasyonun Eşzamanlı Affinity Zenginleştirmesi

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...