Name: double-stranded rna oral delivery methods to induce rna interference in phloem and plant-sap-feeding hemipteran insects
Uploaded: 2018-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects at JoVE.com

Yazarlar, minnetle BMSB HB deneme için düzenlemek ve kolonileri korumak için Donald Weber ve Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) kabul edersiniz; ve Maria T. Gonzalez, Salvador P. Lopez, (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) ve Jackie L. Metz (University of Florida, Fort Pierce, FL) koloni bakım, numune hazırlama ve analiz için.

1. BMSB yetiştirme
<ol><li>Arka BMSB böcekler başı olarak standart laboratuar uygulama ve yukarıda açıklanan63.</li>
	<li>Narenciye macrophylla üzerinde ACP (D. citri) böcekler glasshouse (22 ° C) ve doğal ışık yükseltmek. Yetişkin ACP kullanın, eclosion yaklaşık 5-7 gün sonrası.</li>
</ol>2. çeşitli gen bölgeleri ve In Vitro dsRNA sentezi
<ol><li>Genler belirli BMSB için daha önce yayımlanmış transcriptome profilleri32seçin.</li>
	<li>Seçili vade farkı bölgelerinde 200 ila 500 baz çifti arasında değişir emin olun.</li>
	<li>Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) seçili gen genomik DNA dan ilgi ile ilişkili parçaları oluşturmak için aşağıda açıklanan koşullar kullanarak gerçekleştirin. Gene özel oligonucleotides için bkz: Tablo 1 .<ol>
<li>PCR reaksiyon: 0.25 mL PCR tüp 5 µL PCR tampon, 4 µL dNTP karışımı (2.5 mM her), DNA şablonunun (50 ng/µL), 2,5 µL her astar 1 ve 2 (10 µM), DNA polimeraz (5 U/µL) 0,25 µL 2 µL X 10 birleştirmek , ve Dnaz/RNase free su 50 µL.</li>
		<li>PCR koşulu: bölge 95 ° c 3 dk 30 98 ° C devredir 10 ardından ilgi yükseltmek için PCR reaksiyon döngüsü s, 30 55 ° C s, 1 dk. Incubate tepki bir ek 10 dk. PCR reaksiyon kullanarak arındırmak için 72 ° C'de 72° C bir Arıtma kiti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>T7 RNA polimeraz organizatörü dizisi ile çevrili gen belirli astar ile elde edilen PCR parçaları daha da yükseltmek (5'-GAA TTA ATA CGA CTC Yasası ATA GGG AGA-3') olarak bahsedilen önceki62.</li>
	<li>LacZ gene bir negatif kontrol (sahte) RNAi için kullanın. Not: LacZ β-galaktozidaz Escherichiacoli genomik DNA (kullanılan astar Tablo 1' de listelenen) güçlendirilmiş kodlar bir gen olduğunu.</li>
	<li>Vitro transkripsiyon dsRNA açıklanan önceki62olarak vermeye gerçekleştirir.</li>
	<li>Dağıtılması ve 150 µL Dnaz/RNase free su elde edilen dsRNA resuspend, konsantrasyonu ölçmek ve-80 ° c ileride kullanmak üzere saklamak.</li>
</ol>3. teslimat dsRNA kullanma yeşil fasulye
<ol><li>Seçme erken 4th INSTAR BMSB perileri aynı yumurtadan kitle yumurta ve onları dsRNA besleme önce 24 h için açlıktan.</li>
	<li>İnce sertifikalı organik yeşil fasulye (Phaseolus vulgaris L.) seçin ve 5 min için % 0,2 sodyum hipoklorit çözüm ile yıkayın. Not: ince yeşil fasulye fasulye 2 mL microcentrifuge tüplerde rahatça kalabileceği böylece seçildi.</li>
	<li>GKD2ile O 3 kez yıkama ve kuru hava için sağlar.</li>
	<li>Calyx sonundan itibaren yeşil fasulye 7,5 cm temiz bir jilet kullanarak toplam uzunluğu için trim.</li>
	<li>Yıkanmış ve kesilmiş yeşil fasulye kontrol çözümü 300 µL içeren bir kap daha az 2 mL microcentrifuge tüp sokmak (1:10 yeşil gıda boyası seyreltme (malzemeler: su, propilen glikol, Fd & C sarı 5, Fd & C mavi 1 ve Propylparaben olarak koruyucu)).</li>
	<li>Yapmak dilutions in vitro LacZ, JHAMT veya Vg dsRNAs 5 µg sulandrarak veya 300 µL 0.017 µg/µL veya 0,067 µg/µL, son konsantrasyonları sırasıyla vermeye RNase/Dnaz ücretsiz su içinde 20 µg sentezledim.</li>
	<li>Yıkanmış ve kesilmiş yeşil fasulye dsRNA çözüm (Kimden adım 3.6) 300 µL içeren bir kap daha az 2 mL microcentrifuge tüp sokmak.</li>
	<li>Sarın ve dsRNA çözüm buharlaşma önlemek için ve hayvanlar microcentrifuge tüp girmesini önlemek için dalmış Fasulye kapsayan microcentrifuge tüpler kenarlarını kapatın.</li>
	<li>Bu tüpler yeşil fasulye kılcal eylem tarafından yüklenebilmesi dsRNA çözüm sağlamak 3 h için oda sıcaklığında dik bir şekilde yerleştirin.</li>
	<li>Bu tüpler temiz kültür gemiler (polipropilen) yerleştirin. Yerde üç 4th INSTAR BMSB perileri kültür damarlarının açlıktan.</li>
	<li>Üç hayvan kültür gemi her üç yeşil fasulye ile yeşil gıda renklendirme veya dsRNA çözüm içeren tedavi. 16 L: 8D photoperiod bir kuluçka altında 25 ° C ve %72 bağıl nem, böcekler korumak.</li>
	<li>Yeşil (dalmış ve dsRNA ile emilir) fasulye beslenirler böcekler için 5 gün izin ama 3 gün sonra dsRNA tedavi yeşil boncuk taze yiyecek ile doldurmak.</li>
</ol>4. gerçek zamanlı kantitatif (qPCR) analizi, gen ifade aşağıdaki RNAi aracılı susturmak BMSB içinde
<ol><li>QPCR tarafından transkript ifadesi düzeyi RNAi etkisini ölçmek.</li>
	<li>Toplam RNA tedavi dsRNA hayvanlardan yalıtmak ve cDNA62sentez.</li>
	<li>Bir gerçek zamanlı PCR sistemi ve Tablo 1' de listelenen primerler kullanılarak qPCR reaksiyonlar Kur. Aşağıdaki qPCR Bisiklete binme koşul kullanma: 95 ° C 10 dk ardından 40 devredir 15 95 ° c s, 60 ° C için 1 dakika, 15 95 ° C de dahil olmak üzere ayrışma adım ile birlikte s, 60 ° C için 1 dakika, 15 95 ° C s ve 60 ° C 15 s.</li>
	<li>QPCR standartlar belirlemek: Toplam RNA miktar için referans standart olarak normal bir hayvan izole hazırlanan cDNA seri seyreltme kullanın.</li>
	<li>BMSB 18s RNA bir iç standart olarak RNA kurtarma doku32farklılıkları için düzeltmek için kullanın.</li>
</ol>5. yaprak sprey uygulama büyük saksı narenciye ağaçları ve fidan
Not: Narenciye çeşidinde 'Carrizo' citrange (Citrus sinensis XPoncirus trifoliata, Rutaceae), bitkilerin cam evdeki huysuz gibi doğal ışık ve sıcaklık, 1,2 L kaplarda yetiştirilen altında muhafaza. Bitkiler sürekli 'floş' adı verilen yeni yaprak sürgünler büyümesini teşvik için silinen. ACP yem ve narenciye64yeni büyüme üzerine oviposition için tercih ediyor.
<ol><li>Bitki veya fidan seçin ve bunları 2-3 gün toprağı nemli ama tamamen kuru kurumasına izin kullanmak için önceden su değil.</li>
	<li>Bir el pompası sprey şişe kullanmak alt tepeye (şekil 4A) 200 mL dsRNA çözeltisi (0,5 mg/mL) uygulanır. Not: Yukarıdaki hazırlamak Dnaz/RNase free su çözümlerinde dsRNA bahsetti.</li>
	<li>Uygulama sonrası sprey, tamamen yaprakları tarafından absorbe edilebilir uygulanan dsRNA çözüm sağlar. Not: Narenciye ağaçları uygulanan dsRNA emilir ve sonra yaprakları ya da yeni büyüme veya uygulama öncesinde kaplıydı dalları ayıklanır; dsRNA qPCR kullanarak tespit ve sistemik hareket ağaç üst kubbe yaprakları içine 3-4 h44,45,46de gösterdi.</li>
	<li>25-40 toplayarak gün yaklaşık 10 dört şubeler keyif--dan ayrıldıktan sonra daha önce tepesinde ağaçlarından yeni büyüme örnek. Toplam RNA ayıklamak ve ters transkripsiyon PCR (RT-PCR) tarafından analiz ve qPCR primerler kullanılarak uygulanan dsRNA tetikleyici varlığı için tablo 1'de listelenen ve daha önce açıklanan yöntemleri46. Not: Örnek toplanması, toplam RNA izolasyon, RT-PCR ve qPCR yukarıda açıklanan46yapıldı.</li>
	<li>Benzer şekilde, topikal 10 mL dsRNA bir fide veya küçük saksı ağaç yapraklar alt bölgesine sprey. Not: Hemipteran böcekler (ACP ve GWSS) normalde 24 h beslenme erişim verildi, hangi değil doğrudan püskürtülür veya hangi hafta sonra büyüdü yeni büyüme (yaprak), ya da tüm bitki tedavisi sonrası. Bu böcekler dsRNA doğumdan 3, 6 ve 10 gün için hangi test pozitif sonrası beslenme üretti.</li>
</ol>6. toprak/Root Drench uygulamada büyük ya da küçük narenciye ağaçları ve fidan saksı
<ol><li>Bitki veya fidan seçin ve bunları 2-3 gün toprağı nemli değil kurumasına izin kullanmak için önceden su değil tamamen kuru (bu sıvı çözüm uygulanması için tutmak için hava alanı oluşturur).</li>
	<li>DsRNA çözüm (0.2 mg/mL) 1 L büyük Saksı bitkileri (yaklaşık 2,5 m) toprağa ekleyin ve 1 saat sonra 1 litre su (cila) ekleyin.</li>
	<li>100 mL dsRNA çözeltisi (1.33 mg/mL) 1 m boyunda toprak saksı ağaçları kısmen kuru topraklarda uygula.</li>
	<li>Küçük Fideler için 10 mL dsRNA çözeltisi (1 mg/mL) koniler toprakta veya çıplak kökleri (şekil 4B, C) uygulanır.</li>
	<li>İzin almak için 30 dk emmesi için bir toprak drench olarak uygulanan dsRNA çözüm bitkiler. O zaman daha büyük bitki kapları > 1 galon Eğer absorpsiyonu kökleri (20 mL sarı kaplarda bitkiler için) veya 100 mL ile yardım etmek için düz su tek tedavi uygulanır. Not: Yeşillik için topikal uygulanan dsRNA şube 3-6 h mesaj tedaviler, ağaçlar sistemik hareketi gösterilen içinde en distal ipuçları algılama ile sonuçlandı. Yeni büyüme dalları dsRNA 60-90 gün sonrası tedaviler, pozitif. Kupürleri böcekler (ACP ve GWSS) bir dsRNA bioassay44besleme sağlanır.</li>
</ol>7. kök dokunun (ağaç gövde enjeksiyon) uygulamada büyük saksı narenciye ağaçları ve fidan
<ol><li>Narenciye Fidan, yeni veya yaklaşık 3,5 yıl kök kullanarak dsRNA enjekte için eski bitkiler dokunun (gövde enjeksiyonları) yöntemi seçin.</li>
	<li>Bir matkap ve 2 cm veya kök yaklaşık yarım çap aşmayacak şekilde dikkat çekici bir 10 mm matkap biraz kullanarak narenciye bitki delik.</li>
	<li>Her enjektör bakır ucu ucuna yakın kaçağı önlemek için film sızdırmazlık 4 - 6 kez bir 0.6 cm (¼ inç) geniş şerit ile sarın.</li>
	<li>Ağaç gövde enjektörleri Dnaz/RNase free suda seyreltilmiş dsRNA çözüm 6 mL (1.7 mg/mL) ile doldurulması (ile belirtilen burada renkli çözüm olarak).</li>
	<li>Çözüm ağaç gövde içine enjekte ve enjektör dsRNA çözüm emilimini izin vermek 6-10 h için bagajda bırak. Böcekler 3, 10 ve 30 gün sonrası tedavi tedavi ağaçlarından kesimler üzerinde beslemek izin. Not: gövde enjeksiyon yöntemi kullanarak enjekte dsRNA ağaçların arasında 30-60 gün41,42,44bir süre için kalıcı. Doğrulama RNAi için Tablo 1' de listelenen primerler kullanılarak qPCR tarafından gerçekleştirildi.</li>
</ol>8. dsRNA tedavi kil granül teslim edilmek üzere böcekler aracılığıyla toprak
<ol><li>Kil emici tüp 35 mL işaretine (yaklaşık 30 g kil emici) 50 mL konik tüp içine dökmek.</li>
	<li>20 mL dsRNA çözeltisi (100 µg/mL) Dnaz/RNase free suda seyreltilmiş tüm emici ıslak için tüp dökün. Cap konik tüp, tüp hava kaldırmak için ipucu ve tüp kap.</li>
	<li>Tüp dik koyun ve 1-2 min için çözüm emmek kil parçacıkları için stand izin verin.</li>
	<li>Yeterli dsRNA batırılmış kil 1 galon potu doldurmak için toprak karışımı içine ekleyin.</li>
	<li>Mix ve el ile iyice dsRNA batırılmış kil toprak karıştırmak için toprağı.</li>
	<li>Bu toprak dsRNA tedavisi için seçili fidan repot için kullanın.</li>
	<li>Su 200 mL dsRNA olmadan sade su ile toprak. 1 h 30 dk sonra sade su ile 100 mL izleyin. 24 saat sonra normal sulama zamanlamaya göre bitki koymak.</li>
	<li>Tedavi Saksı bitkileri kil emiciler ve dsRNA ile 4-6 yaprakları dsRNA için her ay sonrası tedavi yeni bitki büyüme en apikal yaprakları toplayarak sınayın. Not: Bitki veya kesimler bu tedavi bitkilerden böcekler için herhangi bir süre sonra 24 saat tedavi sonrası ve böcekler (yayınlanmamış veri) teslim RNAi için bir yıl kadar mümkün olmuştur beslenir.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

RNAi gen biyolojik işlev ve düzenleme, böcek zararlıları19,68,69,70, yönetimi için kullanılmak üzere büyük potansiyeli keşfetmek için önemli bir araç olarak kanıtlamıştır 71. tasarım ve belirli bir böcek türü ve karşılık gelen dsRNA(s) böcek için teslim yöntemi susturulması için uygun bir gene(s) seçim ikisi son derece önemlidi...

Hemipteran böcekler bazı yüksek nüfus artışı elde ettiği ve bitki hastalık yaymak için agriculturebecause yeteneklerini en ekonomik olarak önemli zararlıları oluşturmaktadır. BMSB, H. halys Stål, yanlışlıkla Allentown, Pennsylvania (Çin, Tayvan, Kore ve Japonya) Asya'dan Batı yarımkürede 19961' de rapor ilk nişan ile kullanılmaya başlanan bir invaziv zararlı olduğunu. Yana, BMSB 43 Devletler'de, Orta Atlantik (DE, MD, PA, NJ, VA ve WV) yanı sıra Kanada ve Avrupa'da, en yüksek nüfus ile tespit etti ve tarım2için potansiyel bir tehdit temsil eder. Polyphagous baş belası BMSB elma, üzüm, süs bitkileri, tohum bitkileri, soya ve Mısır gibi yüksek değerli bitkileri de dahil olmak üzere yaklaşık 300 tanımlanan bitki ana bilgisayarlara zarar isteyip başlatabilir. Hasar nedeniyle öncelikle hayvan ana ürün erişmek için besin damar doku2,3, iğne gibi stylet ile delip geçiyor nerede lacerate ve floş olarak bilinen besleme modu neden olur. BMSB okullar gibi yaşam alanları içinde ikamet bulabilirsiniz ayrıca kapalı bir haşere ve sonbahar kış2sırasında evler. Kimyasallar ve BMSB tarafından yayımlanan aeroallergens meyve kırpma işçileri yasadışı Alerjik reaksiyon için rapor edilmiştir. BMSB de alerjik hastalık Kontakt Dermatit, konjonktivit ve duyarlı bireyler4,5rinit için katkıda bulunabilir. Başka bir hemipteran böcek, ACP, D. citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), narenciye ciddi bir zararlı olduğunu ve Huanglongbing (HLB), daha çok bilinen neden phloem sınırlı bakteri (olan Liberibacter asiaticus) iletir narenciye greening hastalığı6,7olarak. HLB ilk Güney Çin bildirildi ve 40 farklı Asya, Afrika, Okyanusya, Güney ve Kuzey Amerika ülkeleri7' ye yayıldı. Narenciye greening ekonomik ve mali kayıp narenciye meyve kaybı nedeniyle tehdit ile dünya çapında bir sorundur; Bu nedenle, ACP yönetimi önlemek ve HLB denetlemek için çok önemli olarak ele alınır.
Bu böcek zararlıları etkin denetimini önlemleri genellikle gerektirir nispeten kısa kimyasal böcek ilaçları uygulanması yaşadı. Kimyasal Böcek ilacı denetim stratejileri genellikle güvenli Çevre Yönetim Stratejileri eksikliği veya duyarlılık nedeniyle pestisit direnç haşere nüfus8,9düştü. Bu nedenle, moleküler biopesticides olan biyolojik mücadele potansiyel bir alternatif, ama kullanımı genel olarak mütevazı kalır, ve parasitoids (örneğin, Trisolcus japonicus) çeşitli türlerin de doğal biyolojik etkili olabilir denetimleri. RNAi teknolojisi moleküler biopesticides10ile invaziv böcek zararlıları yönetmek için ortaya çıkan bir potansiyeldir. RNAi, endojen sonunda mRNA, gen ifadesinin düzenlenmesinde yol açar fingerprinting şekilde, dsRNAs istila yanı sıra etkili posttranscriptional gen susturulması kolaylaştırır bir de açıklanan gen düzenleyici mekanizma olduğunu seviye11,12. Eksojen dsRNA bu bidentate nükleaz RNase III süper bir üyesi tarafından çift işlenir bir hücre içine içselleştirilmiş, kısaca, evrimsel solucanlar, sinekler, bitkiler, mantarlar ve memeliler13, korunmuş Dicer aradı 14 , 15. bu 21-25 nükleotit siRNA dubleks sonra sapmasına ve RNA-induced silencing kompleksi (RISC) RNA'ların rehber olarak entegre. Bu RISC-RNA kompleksi Watson-Crick baz eşleşmesi sağlar tamamlayıcı için hedef mRNA; Bu sonunda Argonaute protein, karşılık gelen mRNA düşürür ve protein çeviri, böylece posttranscriptional gene16 susturmak için önde gelen azaltır bir RNase H benzeri etki alanı içeren bir çoklu etki alanı protein tarafından bölünme için açar , 17 , 18.
RNAi haşere yönetimi için faiz, gen susturmak için dsRNA vivo içinde giriş böylece siRNA yolu etkinleştirme gerektirir. 10,1920,21, mikroenjeksiyon22, taşıyıcılar gibi lipozomlar iliklerine kadar besleme için dsRNA teslim böcekler ve böcek hücreleri sistemik RNAi ikna etmek için kullanılmış çeşitli yöntemleri içerir 23ve diğer teknikleri24. RNAi unc-22 gen ekspresyonu yangın tarafından susturmak için ilk Caenorhabditis elegans gösterdi ve Mello25nakavt Drosophila melanogaster26frizzled genlerin ifadesinde ardından, olmuştur. İlk fonksiyonel çalışmalar mikroenjeksiyon böceklerde, Apis mellifera22,27, Acyrthosiphon pisum28, Blattella germanica29gibi dsRNA teslim etmek için kullanılan, H. halys30ve Lepidoptera böcekler (Terenius ve ark. tarafından gözden 31). mikroenjeksiyon böcek ilgi sitenin doğru ve hassas bir doz sunmak için avantajlı. De olsa böyle septik delikler ifade onun pratiklik tarım biopesticides geliştirme dışarı iktidar bağışıklık ilgili genlerin travma32, dolayısıyla, nedeniyle çıkarmak.
DsRNA vivo içinde teslim başka bir ıslatarak, hangi yenmesi veya dsRNA genellikle ekstraselüler ortamda dsRNA içeren absorpsiyonu hayvanlar veya hücrelerin süspansiyon ile ilgili bir yöntemdir. İliklerine kadar verimli bir şekilde RNAi Drosophila S2 doku kültürü hücrelerin Downstream Raf1 (DSOR1) mitojenle-aktive protein kinaz kinaz (MAPKK)20etkisizleştirmek için hem de susturmak için C. elegans ikna etmek için kullanılmıştır POS-1 gen33. Ancak, iliklerine kadar kullanılarak teslim dsRNA mikroenjeksiyon20' ye göre RNAi ikna etmek için daha az etkilidir. Aracılı RNAi çiğneme bir böcek susturmak ilk bir yapay agar diyet10dsRNA beslerken tarafından Batı Mısır rootworm (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) gösterildi. Önceki raporları yöntemleri doğal diyetler eklembacaklılar34için belirli infüzyon dsRNA teslim özetledik. Bu teslim yöntemi daha fazla kıyaslanabilir teslim yapay araçlarının etkili olduğu belirlenmiştir; çeçe sineği (Glossina morsitans morsitans), nerede bir bağışıklık ile ilgili gen eşit nakavt kan yemek veya microinjected35ile dsRNA ne zaman teslim edildiği gözlenmiştir olgusu gibi. Benzer şekilde, dsRNA hafif kahverengi elma güve (Epiphyas postvittana)36, diamondback güve (Plutella xylostella) larvaları37yanı sıra bal arıları38,39 damlacıklar yoluyla teslim verimli RNAi indüklenen. Oral dsRNA hemipteran böceklerde teslimini ana bitkinin Vaskular dokuları teslim edilmelidir beri zorlu çünkü en etkili RNAi deneylerde hemipteran enjeksiyon dsRNA40 kullanılan. Etkili RNAi Ayrıca gözlenen ACP ve camsı kanatlı keskin nişancı leafhopper (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA narenciye ve dsRNA kök drench, yaprak aracılığıyla damar doku içine absorbe asma aracılığıyla teslim edildi spreyler, gövde enjeksiyonları veya absorpsiyonu ile kesimler41,42,43,44,45,46. Bu da ACP (2016, bize 20170211082 A1) karşı dsRNA için ilk patent sonuçlandı. SiRNA ve dsRNA gemileri nano tanecikleri ve lipozomlar kullanarak istikrar kazandırır ve teslim edilen dsRNA etkinliği artışlar hızla23,47,48,49 ortaya çıkıyor ,50. Teslimat nanoparçacık tabanlı araçlar vitro ve in vivo uygun teslimat51vektörler gibi özellikle tedavi uygulamaları muazzam potansiyel vermek için bu özetlendiği nükleik asitler için yeni bir sınıf. Nano tanecikleri dsRNA için bir teslimat araç olarak çözünürlük, hydrophobicity veya sınırlı biyoakümülasyon52gibi dezavantajları olabilir, ama uygun polimer yardım teslim bu dezavantajları telafi. Geliştirme ve nükleotid kendi kendine teslim kullanım da 'tek iplikçikli RNA/DNA dubleks46olan denilen antianlamlı oligonucleotides', ortaya çıkıyor.
Vitellogenesis eklembacaklılar içinde bir anahtar olduğunu kontrol etmek üreme süreci ve Juvenil hormon (JH) veya ecdysone tarafından düzenlenir, vücut yağ tarafından; Vg sentezi anahtar indükleyicileri olduğu Vg sonunda Vg reseptör aracılı endositoz53ile gelişmekte olan oosit tarafından kaplıyor. VG polipeptitler bir grup büyük yumurta sarısı protein vitellin54,55, gelişimi için gerekli olan extraovarially, sentez ve bu nedenle, önemli üreme ve yaşlanma56olmasıdır. VG nematodlar57 de başarıyla susturuldu yanı sıra nerede RNAi Vg tükenmesi aracılı bal arı (Apis mellifera) Yetişkin ve yumurta22yılında gözlendi. Çünkü bu onun tükenmesi gözlemlenebilir fenotipik efekt gibi yol açacak düşünüldü aracılı posttranscriptional gen Vg susturmak test RNAi doğurganlık ve potansiyel olarak BMSB kontrol yardımcı olmak için verimlilik, azaltılmış. S-adenosyl-L-metiyonin (SAM) kodlar JHAMT gen-bağımlı JH asit O-Metiltransferaz, tromboksan JH biyosentezi yolu58son adım. Bu yolu farnesyl pirofosfat (FPP) ardışık olarak farnesol JH JHAMT tarafından metil farnesoate dönüşüm ardından farnesoic aside dönüşür. Bu yolu böcekler ve eklembacaklılar metamorfoz, developmentally hormonlar59,60,61tarafından denetlenmektedir bir işlem için özel olarak korunmuş. B. moriJHAMT gen ekspresyonu ve Corpora allata JH biyosentetik faaliyete JHAMT gen transkripsiyon bastırılması JH biyosentezi58sona erdirilmesi için çok önemli olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, JHAMT ile Vg gen RNAi kullanarak hedeflenen tükenmesi için seçildi. RNAi Ayrıca narenciye ağaçları ACP ve GWSS kontrolü için test edildi. Narenciye ağaçları dsRNA kök drench aracılığıyla ile tedavi edildi, dsRNAs karşı böcek belirli arginin kinaz (AK) Tutanaklar42,44ile yaprak spreyleri yanı sıra dokunun (gövde enjeksiyon), kök. DsRNA topikal uygulama her yerinde bitkiler damar doku üzerinden verimli bir şekilde teslim gösteren ve ACP ve GWSS41,42, artmış mortalite sonuçlandı narenciye ağaçları, gölgelik algılandı 45.
Mevcut çalışmada, biz dsRNA gibi tedaviler için doğal diyet Teslimat yöntemi belirledik. Yeni geliştirilen bu teknik daha sonra JHAMT ve Vg susturmak için kullanılan gen belirli dsRNAs BMSB perileri kullanılarak mRNA önceki62gösterdi. Bu yeni teslim iletişim kuralları aşağıda gösterildiği topikal spreyler veya microinjections kullanmak geleneksel RNA dağıtım sistemlerinin yerini. Sebze ve meyve, kök dokunun, drenching toprak ve kil emiciler biopesticide zararlı ve hastalık yönetimi sürekli gelişimi için kritik olan dsRNA, teslimi için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>BMSB (H. halys) insects&amp;nbsp;</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACP (D. citri) insects&amp;nbsp;</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>organic green beans</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citrus plants</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodium hypochlorite solution</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>green food coloring&amp;nbsp;</td><td>McCormick &amp;amp; Co., Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma chambers&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magenta vessel (Culture)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers&amp;nbsp;</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiMix SYBR</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR ABI 7500</td><td>Applied Biosystems&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spray bottle</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American Can Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

double-stranded rna oral delivery methods to induce rna interference in phloem and plant-sap-feeding hemipteran insects

Phloem ve bitki su besleme böcekler bitkileri ve meyve gıda bitkileri zarar sürecinde besin almak için bütünlüğünü istila. Hemipteran böcekler bitkilerin bitkileri zarar phloem sap üzerinde besleyerek ekonomik açıdan önemli zararlıları bir dizi hesap. Kahverengi marmorated koku hata (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) ve Asya narenciye psyllid (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) çoğu Kuzey Amerika'da tanıttı hemipteran böcek zararlıları nerede onlar Ne zaman onlar kapalı toplam değeri yüksek özel, satır ve elyaf bitkileri ve narenciye invaziv bir tarımsal haşere yanı sıra bir baş belası zararlı vardır. Pek çok tür böcek ilacı direniş haşere Yönetim Stratejileri alternatif yöntem geliştirme için açmıştır. Çift iplikçikli RNA (dsRNA)-aracılı RNA müdahale (RNAi) fonksiyonel genomik çalışmalar için böcek zararlıları yönetimi için bir araç olarak potansiyel uygulamalar olan mekanizma susturmak bir gen olduğunu. Exogenously sentezlenen dsRNA veya küçük müdahale RNA (siRNA) sunulan bu homolog endojen RNA bozulması ile yüksek verimli gen susturmak tetikleyebilir. Etkili ve çevresel RNAi moleküler biopesticides olarak için kullanımı biyolojik hemipteran böceklerin besleme yoluyla dsRNAs vivo içinde teslim gerektirir. Burada dsRNA teslim edilmek üzere böcekler yöntemleri göstermektedir: dsRNA yeşil fasulye daldırma tarafından yükleme ve gene özgü dsRNA yenmesi ile oral teslimat ile emici. Biz de transgenik olmayan bitki teslim yaklaşımlar yaprak Spreyleri, kök drench, gövde enjeksiyonları yanı sıra kil granülleri, tüm bunların dsRNA sürekli serbest bırakılması için gerekli olabilir kullanarak belirttiğimiz. Verimli bir şekilde teslim sözlü olarak alınan dsRNA tarafından hedeflenen genler, Juvenil hormon asit O-Metiltransferaz gibi (JHAMT) ve vitellogenin (Vg) ifadesi önemli bir azalma ikna etmek için etkili bir doz olarak teyit edildi. Bu yenilikçi yöntemler stratejileri bitki koruma kullanın ve haşere yönetimi için çevresel zorlukların üstesinden gelmek için dsRNA teslim etmek için temsil eder.

Sebze aracılı dsRNA teslim BMSB 4th INSTAR perileri besleme yoluyla moleküler biopesticides RNAi invaziv böcek zararlıları için kullanarak gelişimi için test edildi. BMSBs yem olarak bilinen bir mekanizma tarafından onların iğne gibi stylets kullanarak lacerate ve floş, hangi bitkileri için önemli hasara neden olur. İnce organik yeşil fasulye, P. vulgaris L., besin veya dsRNA vivo içinde BMSB için beslenme3' ten tesli...

Watch this Scientific Journal Video about Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects at JoVE.com

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Phloem ve Hemipteran böcekler bitki su besleme RNA müdahale ikna etmek için çift iplikçikli RNA Oral teslim yöntemleri

Bu makalede damar doku bitkiler için RNA müdahale (RNAi) böcekler besleme phloem sap ile çift iplikçikli RNA (dsRNA) oral teslimat için geliştirilen roman tekniklerini gösterir.

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

double-stranded-rna-oral-delivery-methods-to-induce-rna-interference

Research

JoVE Journal

Environment

13.8K Görüntüleme.  United States Department of Agriculture. Bu makalede damar doku bitkiler için RNA müdahale (RNAi) böcekler besleme phloem sap ile çift iplikçikli RNA (dsRNA) oral teslimat için geliştirilen roman tekniklerini gösterir.

Video: Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Genetik

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

Belirli Gelişimsel Zaman Noktalarında Gen İfadesi Manipüle Etmek Için Güçlü Bir Araç Olarak Su Böcekleri RNA Girişim

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

Çevre

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

Bal Arısı RNAi-aracılı Çift Gen demonte ve tat Algı Ölçüm (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Nörobilim

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

DsRNA Enjeksiyon RNAi Girişim içine Drosophila Embriyolar

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Biyoloji

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects facilitated research in new facets of mosquito biology, including functional genetic studies in the primary African malaria vector Anopheles gambiae and the dengue and yellow fever vector Aedes aegypti. RNA interference- (RNAi-) mediated gene silencing has been used to target genes of interest in both of these disease vector mosquito species. Here, we describe a procedure for preparation of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are combined with food and ingested by larvae. This technically straightforward, high-throughput, and relatively inexpensive methodology, which is compatible with long double stranded RNA (dsRNA) or small interfering RNA (siRNA) molecules, has been used for the successful knockdown of a number of different genes in A. gambiae and A. aegypti larvae. Following larval feedings, knockdown, which is verified through qRT-PCR or in situ hybridization, can persist at least through the late pupal stage. This methodology may be applicable to a wide variety of mosquito and other insect species, including agricultural pests, as well as other non-model organisms. In addition to its utility in the research laboratory, in the future, chitosan, an inexpensive, non-toxic and biodegradable polymer, could potentially be utilized in the field.

Here we describe a procedure for inhibiting gene function in disease vector mosquitoes through the use of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are ingested by larvae.

Hastalık Vektör Sivrisinek Larva içinde Kitosan / Müdahale RNA Nanopartikül Aracılı gen susturma

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

içine RNAi Tetik Teslimat<em&gt; Anofel gambiae</em&gt; Pupa

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool operating by disruption of essential gene expression. Although different methods, such as injection, feeding, and soaking, have been reported for successful delivery of double-stranded RNA (dsRNA), the efficiency of RNAi through oral delivery of dsRNA is highly variable among different insect groups. The German cockroach, Blattella germanica, is highly sensitive to the injection of dsRNA, as shown by many studies published previously. The present study describes a method to demonstrate that the dsRNA encapsulated with liposome carriers is sufficient to retard the degradation of dsRNA by midgut juice. Notably, the continuous feeding of dsRNA encapsulated by liposomes significantly reduces the tubulin expression in the midgut, and led to the death of cockroaches. In conclusion, the formulation and utilization of dsRNA lipoplexes, which protect dsRNA against nucleases, could be a practical use of RNAi for insect pest control in the future.

This manuscript demonstrates the depletion of gene expression in the midgut of the German cockroach through oral ingestion of double-stranded RNA encapsulated in liposomes.

RNA müdahale pratik kullanımı: lipozom taşıyıcıları hamamböceği için çift iplikçikli RNA'ın sözlü teslim

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

Yetişkin Anofeller gambiae Sivrisineklerine Etkili Oral RNA İnferferi (RNAi) Uygulaması

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of pine trees. Despite the recognition of their economic and environmental significance, it has thus far been impossible to study the detailed gene functions of plant-parasitic nematodes (PPNs) using conventional forward genetics and transgenic methods. However, as a reverse genetics technology, RNA interference (RNAi) facilitates the study of the functional genes of nematodes, including B. xylophilus. 
This paper outlines a new protocol for RNAi of the ppm-1 gene in B. xylophilus, which has been reported to play crucial roles in the development and reproduction of other pathogenic nematodes. For RNAi, the T7 promoter was linked to the 5&#8242;-terminal of the target fragment by polymerase chain reaction (PCR), and double-stranded RNA (dsRNA) was synthesized by in vitro transcription. Subsequently, dsRNA delivery was accomplished by soaking the nematodes in a dsRNA solution mixed with synthetic neurostimulants. Synchronized juveniles of B. xylophilus (approximately 20,000 individuals) were washed and soaked in dsRNA (0.8 &#181;g/mL) in the soaking buffer for 24 h in the dark at 25 &#176;C.
The same quantity of nematodes was placed in a soaking buffer without dsRNA as a control. Meanwhile, another identical quantity of nematodes was placed in a soaking buffer with green fluorescent protein (gfp) gene dsRNA as a control. After soaking, the expression level of the target transcripts was determined using real-time quantitative PCR. The effects of RNAi were then confirmed using microscopic observation of the phenotypes and a comparison of the body size of the adults among the groups. The current protocol can help advance research to better understand the functions of the genes of B. xylophilus and other parasitic nematodes toward developing control strategies through genetic engineering.

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Here, we introduce a detailed soaking method of RNA interference in Bursaphelenchus xylophilus to facilitate the study of gene functions.

RNA Girişiminin Çam Ağacı Nematodunda Uygulanması, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

Gen Fonksiyon Analizi için Trichogramma dendrolimi'de RNAi Tekniklerinin Geliştirilmesi

RNA Interference in the Egg Parasitoid, Trichogramma dendrolimi Matsumura

The egg parasitoids, Trichogramma spp, are recognized as efficient biological control agents against various lepidopteran pests in agriculture and forests. The immature stages of Trichogramma offspring develop within the host egg, exhibiting remarkable diminutiveness (approximately 0.5 mm in adult length). RNA-interference (RNAi) methodology has emerged as a crucial tool for elucidating gene functions in numerous organisms. However, manipulating RNAi in certain small parasitoid species, such as Trichogramma, has generally posed significant challenges. In this study, we present an efficient RNAi method in Trichogramma denrolimi. The outlined procedure encompasses the acquisition and isolation of individual T. dendrolimi specimens from host eggs, the design and synthesis of double-stranded RNA (dsRNA), the in vitro transplantation and cultivation of T. dendrolimi pupae, the micro-injection of dsRNA, and the subsequent assessment of target gene knockdown through RT-qPCR analysis. This study furnishes a comprehensive, visually detailed procedure for conducting RNAi experiments in T. dendrolimi, thereby enabling researchers to investigate the gene regulation in this species. Furthermore, this methodology is adaptable for RNAi studies or micro-injections in other Trichogramma species with minor adjustments, rendering it a valuable reference for conducting RNAi experiments in other endoparasitic species.

Yazar Spotlight: RNA Girişimi Yoluyla Wolbachia'nın Neden Olduğu Thelytokous Partenogenez ve Genetik Araç Seti Gelişiminin Araştırılması

The manipulation of RNA interference (RNAi) presents a formidable challenge in many parasitoid species with diminutive size, such as Trichogramma wasps. This study delineated an efficient RNAi method in Trichogramma denrolimi. The present methodology provides a robust model for investigating gene regulation in Trichogramma wasps.

Phloem ve Hemipteran böcekler bitki su besleme RNA müdahale ikna etmek için çift iplikçikli RNA Oral teslim yöntemleri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,

Belirli Gelişimsel Zaman Noktalarında Gen İfadesi Manipüle Etmek Için Güçlü Bir Araç Olarak Su Böcekleri RNA Girişim

Bal Arısı RNAi-aracılı Çift Gen demonte ve tat Algı Ölçüm (

DsRNA Enjeksiyon RNAi Girişim içine Drosophila Embriyolar

Hastalık Vektör Sivrisinek Larva içinde Kitosan / Müdahale RNA Nanopartikül Aracılı gen susturma

içine RNAi Tetik Teslimat

RNA müdahale pratik kullanımı: lipozom taşıyıcıları hamamböceği için çift iplikçikli RNA'ın sözlü teslim

Yetişkin Anofeller gambiae Sivrisineklerine Etkili Oral RNA İnferferi (RNAi) Uygulaması

RNA Girişiminin Çam Ağacı Nematodunda Uygulanması, Bursaphelenchus xylophilus

Yumurta Parazitoidinde RNA Girişimi, Trichogramma dendrolimi Matsumura