Name: double-stranded rna oral delivery methods to induce rna interference in phloem and plant-sap-feeding hemipteran insects
Uploaded: 2018-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
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저자는 기꺼이 실험 BMSB와 HB를 제공 하 고 식민지; 유지에 대 한 도널드 웨버와 메 간 헐리 히 요 (USDA, ARS 벨트 스 빌, 메릴랜드)를 인정 그리고 마리아 토니 곤잘레스, 살바도르 P. 로페즈, (USDA, ARS, 포트 피어스, 플로리다)와 재키 L. 메츠 (프로 리 다의 대학, 포트 피어스, 플로리다) 식민지 유지 관리, 샘플 준비 및 분석.

1. BMSB 양육
<ol><li>표준 실험실 연습와 앞에서 설명한63BMSB 곤충 후면.</li>
	<li>유리 공장 (22 ° C) 및 자연 채광에 감귤 꽃 에 ACP (D. citri) 곤충을 올립니다. 성인 ACP를 사용 하 여, 대략 5-7 일에 게시 일수로.</li>
</ol>2. 유전자 영역 및 체 외에서 합성 dsRNA의 선택
<ol><li>이전에 게시 transcriptome 프로필32에서 BMSB에 특정 유전자를 선택 합니다.</li>
	<li>200 ~ 500의 기본적인 쌍 사이 다를 선택 하는 관심 영역을 확인 합니다.</li>
	<li>연쇄 반응 (PCR) genomic DNA에서 선택 된 유전자와 관련 된 파편을 생성 하기 위해 아래 설명 된 조건을 사용 하 여 수행 합니다. 유전자 관련 oligonucleotides 표 1 을 참조 하십시오.<ol>
<li>PCR 반응: 0.25 mL PCR 튜브에 결합 PCR 버퍼, dNTP 혼합물 (2.5 m m 각)의 4 µ L, 2 µ L의 DNA 템플렛 (50 ng / µ L), 2.5 µ L 각 뇌관 1과 2 (10 µ M), DNA 중 합 효소 (5 U / µ L)의 0.25 µ L의 X 10의 5 µ L DNase/RNase 무료 최대 50 µ L를 물.</li>
		<li>PCR 조건: 10 98 ° C의 30 주기 뒤 3 분 동안 95 ° C에 관심이 증폭 PCR 반응 사이클 s, 55 ° C 30 s, 1 분 품 추가 10 분 Purify 사용 하 여 PCR 반응을 위한 72 ° C에 반응 위한 72 ° C를 정화 키트입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>T7 RNA 중 합 효소 발기인 순서 측면 유전자 특정 한 뇌관으로 얻은 PCR 파편을 더 증폭 (5'-GAA 온 ATA CGA CTC 법 ATA GGG AGA-3')으로 언급 이전62.</li>
	<li>RNAi에 대 한 부정적인 컨트롤 (모의) LacZ 유전자를 사용 합니다. 참고: LacZ β-galactosidase (사용 하는 뇌관은 표 1에 나열 됩니다) Escherichiacoli genomic DNA에서 증폭을 인코딩하는 유전자 이다.</li>
	<li>설명된 이전62으로 dsRNA를 녹음 방송 생체 외에서 수행 합니다.</li>
	<li>분해 하 고 150 µ L DNase/RNase 무료 물에서 결과 dsRNA를 resuspend, 측정 농도, 나중에 사용-80 ° C에서 저장.</li>
</ol>3입니다. 배달 dsRNA 사용 녹색 콩의
<ol><li>선택 초기 4회 탈피 BMSB nymphs 동일한에서 부 화 계란 질량 그리고 dsRNA 먹이 전에 24 h에 대 한 그들을 굶 어.</li>
	<li>슬림 인증된 유기 녹색 콩 (Phaseolus vulgaris L.)를 선택 하 고 5 분 0.2% 염소 용액으로 세척. 참고: 슬림 콩 콩 쉽게 2 mL microcentrifuge 튜브에 수용 될 수 있도록 선정 됐다.</li>
	<li>DdH2O 3 번 세척 하 고 건조 공기를 허용.</li>
	<li>녹두를 꽃 받침 끝에서 깨끗 한 면도날을 사용 하 여 7.5 cm의 총 길이 잘라 주세요.</li>
	<li>제어 솔루션의 300 µ L을 포함 하는 뚜껑 없는 2 mL microcentrifuge 튜브에 세척 하 고 트림 녹두를 담가 (1시 10분 희석 녹색 식용 색소의 (성분: 물, 프로필 렌 글리콜, Fd & C 노란색 5, Fd & C 블루 1, 및 Propylparaben로 방부 제))입니다.</li>
	<li>생체 외에서 의 확인 희석 diluting 5 µ g 또는 RNase/DNase 무료 물 0.017 µ g / µ L 또는 0.067 µ µ g/L는의 최종 농도를 각각 300 µ L에서 20 µ g LacZ, JHAMT, 또는 Vg dsRNAs 합성.</li>
	<li>DsRNA 솔루션 (3.6 단계)에서 300 µ L를 포함 뚜껑 없는 2 mL microcentrifuge 튜브에서 세척 하 고 트림 녹두를 담가.</li>
	<li>포장 하 고 몰입된 콩 dsRNA 해결책의 증발을 방지 하 고 microcentrifuge 튜브에 들어가기에서 동물 방지를 포함 하는 microcentrifuge 튜브의 가장자리를 밀봉.</li>
	<li>DsRNA 솔루션 그린 빈을 통해 모 세관 작용에 의해 로드 될 수 있도록 3 시간 실 온에서 직 립 방식으로이 관을 배치 합니다.</li>
	<li>깨끗 한 문화 혈관 (폴 리 프로필 렌)에이 관을 배치 합니다. 장소 3 4회 탈피 BMSB nymphs 문화 선박에 굶주렸다.</li>
	<li>치료 3 동물 문화 선박 마다 각 녹색 식품 색소 또는 dsRNA 해결책을 가진 3 개의 녹색 콩을 포함. 인큐베이터에서 16 L: 8D photoperiod에서 25 ° C 및 72% 상대 습도에서 곤충을 유지 합니다.</li>
	<li>5 일 동안 녹색 콩 (몰입, dsRNA를 흡수)에 공급 하는 곤충을 허용 하지만 3 일 후 dsRNA 치료 녹색 구슬의 신선한 다이어트 보충.</li>
</ol>4. 실시간 정량 분석의 유전자 식 다음 RNAi 중재 입을 BMSB에 (정량)
<ol><li>정량에 의해 대 본 식의 수준에 RNAi의 효과 측정 합니다.</li>
	<li>DsRNA 치료 동물에서 총 RNA를 분리 하 고62cDNA 합성.</li>
	<li>실시간 PCR 시스템 및 표 1에 나열 된 프라이 머를 사용 하 여 정량 Pcr 반응 셋업 한다. 다음 정량 사이클링 조건을 사용 하 여: 15 95 ° C의 40 주기 뒤에 10 분 동안 95 ° C s, 95 ° C 15를 포함 하 여 분리 단계와 함께 1 분 동안 60 ° C s, 1 분, 15에 대 한 95 ° C에 대 한 60 ° C s 그리고 60 ° C 15에 대 한 s.</li>
	<li>정량 기준 결정: cDNA는 정량화에 대 한 참조 표준으로 정상적인 동물에서 분리 된 총 RNA에서 준비의 직렬 희석을 사용 하 여.</li>
	<li>내부 표준으로 BMSB 18s RNA를 사용 하 여 조직32에서 RNA 복구에 차이 대 한 수정.</li>
</ol>5. 잎 스프레이 응용 프로그램 큰 화분에 심은 감귤 나무 묘 목
참고: 'Carrizo' 유리창 (감귤 류 나무 XPoncirus trifoliata, 오렌지), 감귤 류의 품종의 식물 자연 채광 및 온도, 1.2 L 용기에 재배에서 유리 공장에서 유지 되었다. 식물 끊임없이 '플러시' 라는 새로운 잎 싹의 성장을 촉진 하는 정리 된 했다. ACP 피드 및 감귤 류64의 새로운 성장에 산란을 좋아한다.
<ol><li>식물 또는 묘 목을 선택 하 고 습기를 하지만 완전히 건조 건조 토양을 사용 하기 전에 2-3 일 동안 그들을 급수 하지 않는다.</li>
	<li>손 펌프 스프레이 용기를 사용 하 여 낮은 캐노피 (그림 4A) 적용할 dsRNA 솔루션 (0.5 mg/mL)의 200 mL. 참고: 위의 준비 DNase/RNase 무료 물에 dsRNA 솔루션을 언급.</li>
	<li>후 스프레이 응용 프로그램, 적용 된 dsRNA 해결책 잎에 의해 완전히 흡수 될 수 있습니다. 참고: 감귤 나무 적용된 dsRNA를 흡수 하 고 잎 어느 새로운 성장에서 또는 전에 응용 프로그램, 적용 된 지점에서 추출 되었다; dsRNA 정량 Pcr를 사용 하 여 감지 했다 고 3-4 h44,,4546에 최고 캐노피 나뭇잎으로 조직의 움직임을 보여주었다.</li>
	<li>25-40 일 수집 하 여 약 10 4 분기의 끝에서 출발 후 이전 얹어 나무에서 새로운 성장 샘플. 총 RNA를 추출 하 고 반전 녹음 방송 PCR (RT-PCR)에 의해 분석 정량 Pcr 뇌관을 사용 하 여 적용된 dsRNA 트리거의 존재에 대 한 표 1에 나열 된 및 이전에 설명한 방법46. 참고: 샘플 컬렉션, 총 RNA 격리, RT-PCR과 정량 앞에서 설명한46으로 수행 했다.</li>
	<li>마찬가지로, 몸에 붙이기도 경종 또는 작은 화분에 심는 나무 잎의 더 낮은 지역에 10 mL dsRNA 스프레이. 참고: Hemipteran 곤충 (ACP 및 GWSS) 24 h에 일반적으로 먹이 액세스를 부여 했다, 새로운 성장 (잎)을 했다 하지 되었습니다 직접 분무, 나는 성장 주 후, 또는 전체 식물 치료를 게시. 이 곤충 3, 6, 및 10 일에 dsRNA에 대 한 테스트는 긍정적인 수 유 포스트 생산.</li>
</ol>6. 토양/물 약 응용 프로그램에 큰 또는 작은 감귤 류 나무와 모 종 화분
<ol><li>식물 또는 묘 목을 선택 하 고 2-3 일 아니지만 습기를 밖으로 건조 하는 토양을 사용 하기 전에 그들을 급수 하지 않는다 완전히 건조 (이 공기 공간 적용 될 액체 솔루션을 만듭니다).</li>
	<li>큰 화분 (약 2.5 m)의 토양에 dsRNA 솔루션 (0.2 mg/mL) 1 리터를 추가 하 고 1 시간 후 물 (체이서) 1 패를 추가.</li>
	<li>100ml dsRNA 해결책 (1.33 mg/mL) 1 m 높이의 토양의 화분에 심는 나무 부분적으로 건조 토양에 적용 됩니다.</li>
	<li>작은 묘 목, 콘에서 토양 또는 벌 거 벗은 뿌리 (그림 4B, C) 10 mL dsRNA 해결책 (1 mg/mL)의 적용.</li>
	<li>식물을 30 분 동안 담가 수 토양 물 약으로는 dsRNA 솔루션을 받을 수 있습니다. 다음 경우 큰 화분 > 1 갤런 (20 mL 노란색 용기에 식물을 위해) 또는 100 mL 뿌리에 의해 흡수를 돕기 위해 일반 물만 치료 적용. 참고: 잎을 몸에 붙이기도 적용된 dsRNA 탐지 최대 원심 팁 3-6 h 게시물 치료, 나무를 통해 조직의 움직임을 보여주는 내 분기의 결과. 새로운 성장 분기 60-90 일 포스트 트리트먼트에 dsRNA에 대 한 긍정적인 테스트합니다. 잘라 먹이 생물 검정44dsRNA에 곤충 (ACP 및 GWSS)에 제공 됩니다.</li>
</ol>7. 줄기 큰 화분에 심은 감귤 나무와 묘에서 응용 프로그램 탭 (트리 트렁크 주입)
<ol><li>새로운, 또는 대략 3.5 년 오래 된 식물 줄기를 사용 하 여 dsRNA를 주입에 대 한 탭 (트렁크 주사) 방법 감귤 류의 묘 목을 선택 합니다.</li>
	<li>감귤 류 식물 훈련 및 2 cm, 또는 줄기의 약 절반 직경을 초과 하지 않도록 주의 복용 10 m m 드릴 비트를 사용 하 여 구멍을 드릴 합니다.</li>
	<li>팁 근처 누설을 방지 하기 위하여 필름을 씰링의 0.6 cm (¼ 인치) 넓은 스트립으로 4-6 시간 각 인젝터의 구리 끝부분을 바꿈.</li>
	<li>6 mL (1.7 mg/mL)에 dsRNA 솔루션 DNase/RNase 무료 물에 희석 하는 트리 트렁크 인젝터 채워 (표시 색된 솔루션으로 서 여기).</li>
	<li>나무의 줄기에 솔루션을 주입 하 고 6-10 h dsRNA 해결책의 흡수 수 있도록 트렁크에 인젝터를 둡니다. 3, 10, 30 일 게시물 치료에서 치료 나무에서 절단에 피드에 곤충을 허용 합니다. 참고: 트렁크 주입 방법을 사용 하 여 주입 dsRNA 나무에서 30-60 일41,,4244의 기간에 대 한 유지. RNAi에 대 한 유효성 검사는 표 1에 나열 된 프라이 머를 사용 하 여 정량에 의해 수행 되었다.</li>
</ol>8. dsRNA 곤충을 통해 토양으로의 배달을 위해 처리 점토 알갱이
<ol><li>튜브에 35 mL 마크 (흡수 성 찰 흙의 약 30 g) 50 mL 원뿔 관으로 흡수 성 찰 흙 밖으로 붓는 다.</li>
	<li>젖은 모든 흡수 관으로 dsRNA 솔루션 DNase/RNase 무료 물 (µ g/100ml)에 희석의 20 mL를 붓으십시오. 원뿔 튜브 캡, 튜브를 제거 하는 공기, 팁 및 튜브 캡.</li>
	<li>튜브 똑바로 놓고 그것은 솔루션을 흡수 하는 찰 흙 입자에 대 한 1-2 분 동안 서 보자.</li>
	<li>1 갤런 냄비를 채우기 위해 토양 혼합으로 충분 한 dsRNA에 젖은 점토를 추가 합니다.</li>
	<li>혼합 고 손으로 철저 하 게 토양으로 dsRNA에 젖은 흙을 혼합 하는 토양.</li>
	<li>사용 하 여이 토양 repot 묘 dsRNA 치료에 대 한 선택.</li>
	<li>DsRNA 없이 일반 물 200 mL와 함께 토양을 물. 1 시간 30 분, 후 일반 물 100 mL를 따릅니다. 24 시간 후 정상 급수 계획에 식물을 넣어.</li>
	<li>새로운 식물 성장의 가장 꼭대기 잎을 수집 하 여 4-6 잎 점토 absorbents와 dsRNA 치료 화분의 dsRNA에 대 한 각 달 게시물 치료를 테스트 합니다. 참고: 식물 또는 절단이 대우 식물에서 먹인 다 곤충에 언제 든 지 24 시간 치료를 게시 하 고 곤충 (되지 않은 데이터)를 최대 1 년을 위한 RNAi 배달 할 수 있다.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

RNAi 입증 유전자 생물학 기능 및 규정, 해충19,,6869,70, 의 관리에 대 한 활용을 중대 한 잠재력을 탐험을 위한 중요 한 도구 71. 디자인 및 특정 곤충 종과 곤충에 해당 dsRNA(s)의 납품의 방법에 입을 위한 적절 한 gene(s)의 선택은 매우 중요 둘 다. 곤충으로 dsRNA를 제공 하기 위한 ?...

Hemipteran 곤충 높은 인구 증가 달성 하 여 식물에 질병을 확산 그들의 능력의 agriculturebecause의 경제적으로 가장 중요 한 해충의 일부를 구성. BMSB, H. halys 찾을, 19961에 보고 된 첫 번째 보이 질와 아시아 (중국, 대만, 한국, 그리고 일본)에서 알 렌 타운, 펜실베이니아에 서반구에 실수로 도입 된 침입 해충 이다. 그것의 소개부터 BMSB Mid-atlantic (DE, MD, 펜 실바 니 아, 뉴저지, 버지니아, 그리고 웨스트 버지니아), 뿐만 아니라 캐나다, 유럽, 가장 높은 인구가 43 개 주에서 감지 되었습니다 하 고 농업2에 잠재적인 위협을 나타냅니다. Polyphagous 해충으로 BMSB 사과, 포도, 관 상용 식물, 씨앗, 콩, 작물과 옥수수 등 고부가가치 작물을 포함 하 여 약 300 확인 된 식물 호스트 손상을 선동 수 있습니다. 피해는 어디 동물 피어 호스트 작물 영양분을 혈관 조직2,3에서 액세스 하는 바늘 같은 stylet와 lacerate 및 플러시 라고 먹이의 모드 때문에 주로 발생 합니다. BMSB 학교 등 생활 지역에 거주지를 찾을 수 있습니다 그들은 실내 해충 이기도 하 고가을 겨울2집. 화학 물질 및 aeroallergens BMSB 발표 과일 자르기 근로자에서 불법 알레르기 반응으로 보고 되었다. BMSB 또한 접촉 피부염, 결막염, 그리고 민감한 개인4,5비 염 알레르기 질환에 기여할 수 있습니다. 또 다른 hemipteran 곤충, ACP, D. citri 쿠 (Hemiptera: Liviidae), 감귤 류 과일의 심각한 해충 이며 Huanglongbing (HLB), 더 잘 알려진 원인 체 관 부-제한 된 박테리아 (Candidatus Liberibacter asiaticus)를 전송 감귤 류 녹화 질병6,7로. HLB 중국 남부에서 처음 알려졌다 고 40 다른 아시아, 아프리카, 오세아니아, 한국 및 북미 국가7확산 하고있다. 감귤 류 녹화는 경제 및 재정 손실 때문에 감귤 류의 과일 손실; 위협 세계적인 문제 따라서, ACP의 관리는 방지 하 고 HLB 제어 매우 중요 간주 됩니다.
이러한 해충의 효과적인 제어를 위한 조치는 일반적으로 비교적 짧은 화학 살충제의 응용 프로그램 살 필요 합니다. 화학 살충제 제어 전략 종종 안전 환경 관리 전략 부족 또는 유해물 인구8,9농약 저항으로 인해 민감성을 감소. 따라서, 분자 biopesticides 가진 유해물의 생물학 통제는 잠재적인 대안 이다, 하지만 그것의 사용은 세계적으로 겸손, 남아 및 parasitoids (예를 들어, Trisolcus 나무)의 다양 한 종 자연 생물으로도 효과적일 수 있습니다. 제어 합니다. RNAi 분자 biopesticides10침략 적인 해충을 관리 하기 위한 기술을 신흥 잠재력 이다. RNAi는 결국 리드는 mRNA에 유전자 발현의 규칙 순서 특정 방식에서 dsRNAs 침입 뿐만 아니라 내 생의 효과적인 posttranscriptional 유전자 입을 용이 하 게 잘 설명된 유전자 규제 메커니즘 레벨11,12. 간단히, 외 인 dsRNA는 siRNAs에 bidentate nuclease RNase III superfamily의 구성원에 의해 처리 되는 셀에 내 면, 진화론에 벌레, 파리, 식물, 균 류, 포유류13, 보존 Dicer 호출 14 , 15.이 21-25의 뉴클레오티드 siRNA duplexes 다음 해제 및 RNAs를 가이드로 RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC)에 통합. 이 RISC RNA 복잡 한 Watson 근육 경련 기본적인 쌍 수 하는 보완 대상 mRNA; 이 결국 지도 한다 분열 Argonaute 단백질, 멀티 도메인 단백질 저하 해당 mRNA 및 단백질 번역, 그로 인하여 입을16 posttranscriptional 유전자로 이어지는 감소는 RNase H-같은 도메인을 포함 하 여 , 17 , 18.
해충 관리를 위한 RNAi siRNA 통로 활성화 함으로써 dsRNA에서 vivo에서 , 관심사의 유전자를 침묵의 도입을 필요 합니다. 곤충 및 곤충 세포 dsRNA 배달 조직의 RNAi를 유도 하기 위해 사용 된 다양 한 방법이 포함10,19,20,21, microinjection22, 사업자 리 같은 몸으로 먹이 23, 그리고24다른 기술. RNAi 화재로 unc-22 유전자 발현을 침묵 하 꼬마 선 충 에서 처음 되었고 멜로25, 최저 초파리 melanogaster26에 frizzled 유전자의 표현에 의해 따라. 초기 기능 연구 활용 곤충, Apis mellifera22,27,28 Acyrthosiphon pisum, Blattella germanica29, dsRNA를 제공 microinjection H. halys30및 (Terenius 그 외 여러분 검토 lepidopteran 곤충 31). microinjection 곤충에 대 한 관심의 사이트를 정확 하 고 정확한 복용량을 제공 하는. 비록 같은 정화 조 자국 농업 biopesticides 개발에서의 실용성을 배제 외상32, 그러므로, 때문에 면역 관련된 유전자의 표정을 유도 수 있습니다.
DsRNA에서 vivo에서 제공 하는 또 다른 방법은입니다 몸을 담근 채, 섭취 또는 흡수 dsRNA의 동물 또는 세포의 dsRNA를 포함 하는 extracellular 매체에서 일반적으로 포함. 효율적으로 침묵 C. 선 충 뿐만 아니라 하류로의 Raf1 (DSOR1) 물질 활성화 한 단백질 키 니 아 제 키 니 아 제 (MAPKK)20, 억제 하기 위해 초파리 S2 조직 배양 세포에서 RNAi를 유도 하는 데 사용 되었습니다 젖어 pos-1 진33. 그러나, 몸으로 사용 하 여 배달 dsRNA microinjection20에 비해 RNAi를 유도 하는 것 덜 효율적입니다. RNAi 중재 씹는 곤충에 입을 인공 한 천 다이어트10으로 dsRNA를 일으키는 여 서 부 옥수수 rootworm (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera)에 먼저 보였다. 이전 보고서는 dsRNA 절지동물34특정 자연 다이어트에 주입을 제공 하는 방법을 요약 있다. 이러한 전달 방법 추가 배달;의 인위적인 수단을 대 등 하 게 효과적일 수 결정 등 어디 동등한 최저 면역 관련 유전자의 dsRNA 혈액 식사 또는 microinjected35를 통해 전달 했다 때 관찰 되었다 체체파리 비행 (Glossina morsitans morsitans)의 경우. 마찬가지로, 꿀 꿀벌38,39 뿐만 아니라 밝은 갈색 애플 엄 (Epiphyas postvittana)36, 다이아몬드 나 방 (이용한 배 xylostella) 애벌레37, 방울 통해 dsRNA의 납품 효율적인 RNAi를 유도. 호스트 식물의 혈관 조직을 통해 전달 해야 합니다 때문에, hemipteran 곤충에 dsRNA의 구두 전달 힘든 때문에 hemipteran에 가장 효과적인 RNAi 실험 dsRNA40 의 주입 활용가. 효과적인 RNAi 또한 ACP와 유리 날개 사격의 명 수 leafhopper (GWSS) Homalodisca vitripennis에서 관찰 되었다: dsRNA 감귤 류와 루트 물 약, 잎을 통해 혈관 조직으로 dsRNA를 흡수 했다 포도 덩굴을 통해 전달 했다 스프레이, 트렁크 주사, 또는 절단41,,4243,44,45,46에 의해 흡수. 이것 또한 dsRNA ACP (2016, 미국 20170211082 A1)에 대 한 첫 번째 특허 귀착되는. SiRNA 나노 입자 등 리 캐리어를 사용 하 여 dsRNA의 납품 부여 안정성, 그리고 전달된의 dsRNA 효능 증가23,,4748,49 신흥 빠르게 ,50. 나노 기반 배달 차량의 생체 외에서 그리고 vivo에서 적당 한 배달 벡터51로 치료 응용 프로그램 엄청난 잠재력을 얻으며 수 있습니다에 대 한 구체적으로 요약 했다에 대 한 핵 산에 대 한 새로운 클래스. DsRNA에 대 한 배달 차량으로 나노 입자 용 해도, hydrophobicity, 또는 제한 된 bioaccumulation52를 포함 하 여 단점 있지만 적당 한 폴리머 탈출 배달 이러한 단점을 보상 수 있습니다. 개발 및 자체 제공 뉴클레오티드의 사용 이라는 '센스 oligonucleotides', 단일 좌초 RNA/DNA 쌍 신 회로46는 등장도 하고있다.
절지동물에 vitellogenesis 키가는 체 지방; Vg 합성의 주요 inducers 복제 제어 과정 및 젊은 호르몬 (JH) 또는 ecdysone 규제, Vg는 결국 Vg 수용 체 중재 된 endocytosis53통해 개발 oocyte에 의해 촬영. Vg은 polypeptides의 그룹 합성 extraovarially vitellin54,55, 주요 계란 노 른 자 단백질의 개발을 위한 필수 이며 따라서, 재생산 및 노화56에 중요 하다. Vg은 nematodes57 에 성공적으로 침묵 되었다 뿐 아니라 꿀벌 (Apis mellifera) 어디 RNAi 중재 Vg의 고갈에서에서 성인과 계란22에서 관찰 되었다. RNAi 그것의 고갈 같은 관찰 phenotypic 영향으로 이어질 것으로 생각 되었다 때문에 시험 되었다 중재 posttranscriptional 유전자 Vg의 입을 감소 산과 통치, 잠재적으로 BMSB 제어에 도움. JHAMT 유전자 인코딩하는 S-adenosyl-L-메티오닌 (SAM)-종속 JH 산 O-methyltransferase, JH 생 합성 통로58의 마지막 단계를 catalyzes. 이 통로 farnesyl 파이 인산 (FPP)는 순차적으로 farnesol에서 farnesoic 산 JHAMT에 의해 JH 메 틸 farnesoate의 변환 다음에 변형 됩니다. 이 통로 곤충 변 태 호르몬59,,6061에 의해 규제 발달 과정에 맞게 절지동물에 보존 됩니다. B. 모리, JHAMT 유전자 발현 및 Corpora allata에 JH 생 합성 활동 제안 JHAMT 유전자의 transcriptional 억제 JH 생 합성58의 종료에 대 한 결정적 이다. 따라서, JHAMT 및 Vg 유전자 RNAi를 사용 하 여 대상된 고갈에 대 한 선정 됐다. RNAi는 ACP와 GWSS의 제어를 위한 감귤 나무에서 또한 시험 되었다. 감귤 나무 dsRNA 루트 물 약을 통해 치료 했다, dsRNAs 곤충 특정 아르기닌 키 (AK) 녹취 록42,44에 대 한와 잎 스프레이 뿐만 아니라 탭 (트렁크 주사), 줄기. 감귤 나무, 식물 혈관 조직을 통해 효율적인 납품을 나타내는 고 귀착되 었 다 ACP GWSS41,42, 에서 사망률 증가의 캐노피 온통 dsRNA의 국 소 응용 프로그램 검색 되었습니다. 45.
현재 연구에서 우리는 dsRNA 등 치료에 대 한 자연 식단 배달 방법을 확인 했습니다. 새로 개발된 된이 기술은 이후 JHAMT 및 Vg 입을 사용 되었다 mRNA 유전자 특정 dsRNAs BMSB로 nymphs에 사용 하 여 이전62시연. 여기 설명 이러한 새로운 배달 프로토콜 국 소 스프레이 또는 microinjections를 사용 하는 기존 RNA 배달 시스템을 대체 합니다. 야채와 과일, 줄기 탭, 토양에는 억 수 같이 쏟아지는, 및 찰 흙 absorbents에서 사용할 수 있습니다 전달의 dsRNA,이 중국 해충 및 병원 체 관리의 지속적인된 발전에 매우 중요.

<table><tbody><tr><td>BMSB (H. halys) insects&amp;nbsp;</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACP (D. citri) insects&amp;nbsp;</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>organic green beans</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citrus plants</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodium hypochlorite solution</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>green food coloring&amp;nbsp;</td><td>McCormick &amp;amp; Co., Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma chambers&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magenta vessel (Culture)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers&amp;nbsp;</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiMix SYBR</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR ABI 7500</td><td>Applied Biosystems&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spray bottle</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American Can Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

double-stranded rna oral delivery methods to induce rna interference in phloem and plant-sap-feeding hemipteran insects

체 관 부 및 식물 sap 먹이 곤충 침략 작물과 식량 작물을 손상 하는 과정에서 영양소를 검색 하는 과일의 무결성. Hemipteran 곤충 체 관 부 수액에 먹이로 작물을 손상 하는 식물의 경제적으로 상당한 해충의 숫자에 대 한 계정. 갈색 marmorated 악취 버그 (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae)와 아시아 감귤 류 psyllid (ACP), Diaphorina citri 쿠 (Hemiptera: Liviidae)는 북미 지역에서 도입 hemipteran 해충 어디 그들은 그들은 실내 집계 때 고부가가치 전문, 행, 및 주식 작물 및 감귤 류 과일의 침략 농업 유해물으로 귀찮은 해충 있습니다. 많은 종에서 살충제 저항 해충 관리 전략의 대체 방법의 개발을 주도하 고 있다. 이중 가닥 RNA (dsRNA)-중재 RNA 간섭 (RNAi)는 해충의 관리를 위한 공구로 잠재적인 응용 프로그램을 기능 게놈 연구에 대 한 메커니즘을 입을 유전자. 것 합성된 dsRNA 또는 작은 간섭 RNA (siRNA)은 동종 제시 하는 내 생 RNA의 저하를 통해 매우 효율적인 유전자 침묵 하는 것을 실행할 수 있습니다. 효과적이 고 환경으로 사용 RNAi 분자 biopesticides biocontrol hemipteran 곤충의 대 한 먹이 통해 dsRNAs 비보에 전달을 해야합니다. 여기 곤충 dsRNA의 납품을 위한 방법 제시: 침수로 녹색 콩으로 dsRNA의 로드 하 고 섭취를 통해 구두 전달 유전자 특정 dsRNA의 흡수. 우리는 또한 비-유전자 변형 식물 배달 방법을 사용 하 여 잎 스프레이, 루트 물 약, 트렁크 주사 뿐만 아니라 찰 흙과 립, 모두의 dsRNA의 지속적인된 출시에 필수적인 수 있습니다 설명 했습니다. 구두로 섭취 dsRNA에 의해 효율적인 배달 타겟된 유전자, 청소년 호르몬 산 O-methyltransferase 등 (JHAMT)와 vitellogenin (Vg)의 표현에 상당한 감소를 유도 하는 효과적인 복용량으로 확인 됐다. 이러한 혁신적인 방법 해충 관리에 대 한 환경 문제를 극복 하 고 작물 보호에 사용 하는 dsRNA의 납품에 대 한 전략을 나타냅니다.

BMSB 4회 탈피 님프에 먹이 통해 야채 중재 dsRNA 배달 분자 biopesticides RNAi를 사용 하 여 침입 곤충 해충에 대 한 개발에 대 한 테스트를 했다. BMSBs 피드로 알려진 메커니즘에 의해 그들의 바늘 같은 stylets를 사용 하 여 입힌 고 플 러쉬, 어떤 작물에 상당한 손상을 초래. 슬림 유기 녹색 콩, P. vulgaris L., 영양소 또는 dsRNA 전달 될 수 있는 비보에 BMSB에 먹이<su...

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Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

체 관 부 식물 수액 공급 Hemipteran 곤충에 RNA 간섭을 유도 하 이중 가닥 RNA 구두 전달 방법

이 문서에는 RNA 간섭 (RNAi) 곤충 먹이 체 관 부 수액에 대 한 식물의 혈관 조직을 통해 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 구두 납품을 위해 개발 된 새로운 기술을 보여 줍니다.

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

double-stranded-rna-oral-delivery-methods-to-induce-rna-interference

Research

JoVE Journal

Environment

13.8K 조회수.  United States Department of Agriculture. 이 문서에는 RNA 간섭 (RNAi) 곤충 먹이 체 관 부 수액에 대 한 식물의 혈관 조직을 통해 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 구두 납품을 위해 개발 된 새로운 기술을 보여 줍니다.

비디오: Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

연구

유전학

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

특정 발달 시점에서 유전자 발현을 조작하기 위한 강력한 도구로 수생 딱정벌레의 RNA 간섭

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

환경과학

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

꿀벌의 RNAi를 매개로 두 유전자 넉다운과 미각 지각 측정 (<em&gt; 아피스 mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

신경과학

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

dsRNA 주입하여 RNAi 간섭에 Drosophila 태아

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

생물학

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects facilitated research in new facets of mosquito biology, including functional genetic studies in the primary African malaria vector Anopheles gambiae and the dengue and yellow fever vector Aedes aegypti. RNA interference- (RNAi-) mediated gene silencing has been used to target genes of interest in both of these disease vector mosquito species. Here, we describe a procedure for preparation of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are combined with food and ingested by larvae. This technically straightforward, high-throughput, and relatively inexpensive methodology, which is compatible with long double stranded RNA (dsRNA) or small interfering RNA (siRNA) molecules, has been used for the successful knockdown of a number of different genes in A. gambiae and A. aegypti larvae. Following larval feedings, knockdown, which is verified through qRT-PCR or in situ hybridization, can persist at least through the late pupal stage. This methodology may be applicable to a wide variety of mosquito and other insect species, including agricultural pests, as well as other non-model organisms. In addition to its utility in the research laboratory, in the future, chitosan, an inexpensive, non-toxic and biodegradable polymer, could potentially be utilized in the field.

Here we describe a procedure for inhibiting gene function in disease vector mosquitoes through the use of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are ingested by larvae.

질병 벡터 모기 유충의 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자 중재 유전자 음소거

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

에 RNAi의 트리거 배달<em&gt; 아노 펠 레스 gambiae</em&gt; 번데기

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool operating by disruption of essential gene expression. Although different methods, such as injection, feeding, and soaking, have been reported for successful delivery of double-stranded RNA (dsRNA), the efficiency of RNAi through oral delivery of dsRNA is highly variable among different insect groups. The German cockroach, Blattella germanica, is highly sensitive to the injection of dsRNA, as shown by many studies published previously. The present study describes a method to demonstrate that the dsRNA encapsulated with liposome carriers is sufficient to retard the degradation of dsRNA by midgut juice. Notably, the continuous feeding of dsRNA encapsulated by liposomes significantly reduces the tubulin expression in the midgut, and led to the death of cockroaches. In conclusion, the formulation and utilization of dsRNA lipoplexes, which protect dsRNA against nucleases, could be a practical use of RNAi for insect pest control in the future.

This manuscript demonstrates the depletion of gene expression in the midgut of the German cockroach through oral ingestion of double-stranded RNA encapsulated in liposomes.

RNA 방해의 실용적인 사용: Liposome 캐리어 바퀴벌레에 대 한 이중 가닥 RNA의 구두 납품

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

성인 Anopheles 감비아 모기에 효과적인 경구 RNA 간섭 (RNAi) 투여

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of pine trees. Despite the recognition of their economic and environmental significance, it has thus far been impossible to study the detailed gene functions of plant-parasitic nematodes (PPNs) using conventional forward genetics and transgenic methods. However, as a reverse genetics technology, RNA interference (RNAi) facilitates the study of the functional genes of nematodes, including B. xylophilus. 
This paper outlines a new protocol for RNAi of the ppm-1 gene in B. xylophilus, which has been reported to play crucial roles in the development and reproduction of other pathogenic nematodes. For RNAi, the T7 promoter was linked to the 5&#8242;-terminal of the target fragment by polymerase chain reaction (PCR), and double-stranded RNA (dsRNA) was synthesized by in vitro transcription. Subsequently, dsRNA delivery was accomplished by soaking the nematodes in a dsRNA solution mixed with synthetic neurostimulants. Synchronized juveniles of B. xylophilus (approximately 20,000 individuals) were washed and soaked in dsRNA (0.8 &#181;g/mL) in the soaking buffer for 24 h in the dark at 25 &#176;C.
The same quantity of nematodes was placed in a soaking buffer without dsRNA as a control. Meanwhile, another identical quantity of nematodes was placed in a soaking buffer with green fluorescent protein (gfp) gene dsRNA as a control. After soaking, the expression level of the target transcripts was determined using real-time quantitative PCR. The effects of RNAi were then confirmed using microscopic observation of the phenotypes and a comparison of the body size of the adults among the groups. The current protocol can help advance research to better understand the functions of the genes of B. xylophilus and other parasitic nematodes toward developing control strategies through genetic engineering.

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Here, we introduce a detailed soaking method of RNA interference in Bursaphelenchus xylophilus to facilitate the study of gene functions.

파인우드 선충류에서의 RNA 간섭의 적용, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

유전자 기능 분석을 위한 Trichogramma dendrolimi 의 RNAi 기술 발전

RNA Interference in the Egg Parasitoid, Trichogramma dendrolimi Matsumura

The egg parasitoids, Trichogramma spp, are recognized as efficient biological control agents against various lepidopteran pests in agriculture and forests. The immature stages of Trichogramma offspring develop within the host egg, exhibiting remarkable diminutiveness (approximately 0.5 mm in adult length). RNA-interference (RNAi) methodology has emerged as a crucial tool for elucidating gene functions in numerous organisms. However, manipulating RNAi in certain small parasitoid species, such as Trichogramma, has generally posed significant challenges. In this study, we present an efficient RNAi method in Trichogramma denrolimi. The outlined procedure encompasses the acquisition and isolation of individual T. dendrolimi specimens from host eggs, the design and synthesis of double-stranded RNA (dsRNA), the in vitro transplantation and cultivation of T. dendrolimi pupae, the micro-injection of dsRNA, and the subsequent assessment of target gene knockdown through RT-qPCR analysis. This study furnishes a comprehensive, visually detailed procedure for conducting RNAi experiments in T. dendrolimi, thereby enabling researchers to investigate the gene regulation in this species. Furthermore, this methodology is adaptable for RNAi studies or micro-injections in other Trichogramma species with minor adjustments, rendering it a valuable reference for conducting RNAi experiments in other endoparasitic species.

저자 스포트라이트: RNA 간섭을 통한 Wolbachia-Induced Thelytokous partthenogenesis 및 Genetic Toolkit Development 조사

The manipulation of RNA interference (RNAi) presents a formidable challenge in many parasitoid species with diminutive size, such as Trichogramma wasps. This study delineated an efficient RNAi method in Trichogramma denrolimi. The present methodology provides a robust model for investigating gene regulation in Trichogramma wasps.

체 관 부 식물 수액 공급 Hemipteran 곤충에 RNA 간섭을 유도 하 이중 가닥 RNA 구두 전달 방법

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양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초,

특정 발달 시점에서 유전자 발현을 조작하기 위한 강력한 도구로 수생 딱정벌레의 RNA 간섭

꿀벌의 RNAi를 매개로 두 유전자 넉다운과 미각 지각 측정 (

dsRNA 주입하여 RNAi 간섭에 Drosophila 태아

질병 벡터 모기 유충의 키토산 / 간섭 RNA 나노 입자 중재 유전자 음소거

에 RNAi의 트리거 배달

RNA 방해의 실용적인 사용: Liposome 캐리어 바퀴벌레에 대 한 이중 가닥 RNA의 구두 납품

성인 Anopheles 감비아 모기에 효과적인 경구 RNA 간섭 (RNAi) 투여

파인우드 선충류에서의 RNA 간섭의 적용, Bursaphelenchus xylophilus

계란 기생충의 RNA 간섭, Trichogramma dendrolimi Matsumura