Die Autoren möchten den Spendern, die RCWIH-BioBank und der Mount Sinai Hospital/UHN Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie für die menschliche Exemplare in dieser Studie verwendeten danken. Wir möchten den Mitgliedern des Lauge Labor, insbesondere Dr. Caroline Dunk für ihre Hilfe bei der Methodenentwicklung danken. Diese Arbeit wird von der Burroughs-Willkommen-Fonds (Grant #1013759) unterstützt.

Plazentas werden aus gesunden Begriff nicht in Arbeit Frauen elektiven Kaiserschnitt gesammelt. Die Sammlung, Verarbeitung und des humanen Proben Einweg Befolgen der Richtlinien des Mount Sinai Hospital Ethics Board. Jeder Patient ist eine schriftliche Einwilligung eingeholt. Diese Studie wird durch das Research Ethics Board am Mount Sinai Hospital genehmigt.
1. Vorbereitungen
Hinweis: Alle Schritte müssen durchgeführt werden, unter einer Abzugshaube und alle chirurgische Geräte per Autoklav vor der Platzierung in der Dunstabzugshaube sterilisiert werden muss. Alle anderen Materialien (50 mL-Tuben, Flaschen, etc.) müssen mit 70 % Ethanol sterilisiert werden. Immer jederzeit tragen persönlicher Schutzausrüstung bei der Arbeit mit biogefährlichen Abfällen (Kittel, Handschuhe, lange Haare zurück gebunden, etc.).
<ol><li>
Enzymatische Verdauung Lösung (endgültige Lösung: 200 mL)
	<ol>
<li>180 mL HBSS - Pipette / - in einen 500-mL-Becherglas, sterile rühren Magnet hinzufügen und platzieren Sie auf Platte bei Raumtemperatur rühren.</li>
		<li>Abwiegen und fügen Sie Folgendes zum HBSS/Lösung langsam und sequenziell: 20 mL FBS, 400 mg Kollagenase 2 ([final] = 2 mg/mL), 20 mg Soja-Bohne-Trypsin-Inhibitor ([final] = 0,1 mg/mL), 30 mg DNase-1 ([final] = 0,15 mg/mL), und 200 mg BSA ([final] = 1 mg/mL)</li>
		<li>Das Rühren auf mittlerer Geschwindigkeit festgelegt und lassen Sie die Mischung für 10-20 min (Abdeckung mit Zinn Folie oder Paraffin Film unter Rühren) gerührt.</li>
		<li>Gießen Sie die gemischte Lösung in einer 250 mL-Glasflasche mit einem Kunststoff-Trichter und in der Dunstabzugshaube.</li>
		<li>Übergeben Sie die Lösung durch ein Kunststoff Top Filteranlage (0,22 μm Membranfilter, 500 mL), aliquoten 20 mL in 50 mL Tuben (insgesamt 10 Rohre) und Speicher bei-20 ° C bis zur Verwendung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RPMI 1640 Medien (2 % Lösung und 10 % komplette Wachstumsmedium waschen)
	<ol>
<li>RPMI 1640 und FBS in einer Glasflasche in der Dunstabzugshaube zu kombinieren.</li>
		<li>Kombinieren Sie für 2 % FBS Lösung 490 mL RPMI 1640 und 10 mL FBS.</li>
		<li>Kombinieren Sie für 10 % FBS Lösung 450 mL RPMI 1640 und 50 mL FBS.</li>
		<li>Pipette 500 μL des Normocin in der 500 mL Flasche aus dem vorherigen Schritt mit RPMI Medien und FBS (50 mg/mL Brühe, 0,05 mg/mL arbeiten Konzentration).</li>
		<li>Übergeben Sie Medien über eine 0,22 μm Membranfilter und speichern in einer 500 mL-Glasflasche bei 4 ° C bis zur Verwendung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 min vor Beginn des Experiments Platz eine 20 mL Aliquot der enzymatischen Verdauung Lösung in einem 37 ° C Perle Bad eingefroren, Platz 2 % FBS und 10 % FBS RPMI 1640 Medien in einem 37 ° C Perle Bad, schalten die rockigen Wasserbad und auf 37 ° C , 2 g und Satz einer Zentrifuge kontrollierter Temperatur um 4 ° C.</li>
</ol>2. Sammlung von Deziduale Gewebe aus Begriff Plazentar Membranen
<ol><li>Stellen Sie Flaschen mit HBSS + / +, HBSS-/- und fünf 50 mL Röhrchen in einem Rack unter dem Abzug. Pipette 25 mL HBSS + / + in eine Röhre.</li>
	<li>
Herausnehmen Sie die Begriff Plazenta mit behandschuhten Händen aus dem Behälter für den Transport vom OP-Saal Theater verwendet. Die Plazenta auf das Windel-Pad (mütterliche Seite nach oben) und verteilen Sie die fetalen Membranen, mit Schere und Pinzette.
	<ol>
<li>Legen Sie überlappende Windel-Pads auf der Dunstabzugshaube.</li>
		<li>Verwenden Sie eine separate Windel, um die Plazenta zu kippen, so dass die mütterliche Seite aufgedeckt ist.</li>
		<li>Finden Sie den Punkt des Bruches der Membran und Schnitte um die Membran zu nicht entfalten und flach auf der Oberfläche des Fumehood zu ermöglichen. Hinweis: Sobald die Membran aus der Plazenta zurück gezogen wird, werden die Dezidua aufgedeckte ruht auf dem Chorion-Layer mit der Amnion-Schicht auf der Rückseite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit einem Schaber Kunststoff Zelle vorsichtig kratzen das deziduale Gewebe aus dem Chorion und in der 50 mL-Tube mit 25 mL HBSS + / +.</li>
	<li>Kratzen Sie die Membran mit mäßigem Druck. Gelten Sie nicht zu viel Druck, wie es Chorion Kontamination führen kann. Sammeln Sie kleine Blutgerinnsel sowie, als diese einige deziduale Zellen enthalten. Achtung: Nach deziduale Sammlung, Plazenta muss verpackt in einem Plastikeimer Biohazard und im Eisschrank vor der entsprechenden Entsorgung (nach Ihren institutionellen Regeln)-20 ° C eingefroren. Blutige Windel Pads müssen in einer Dichtung-Dichte Plastiktüte verpackt und in ein Biohazard-Safe entsorgt werden.</li>
</ol>3. Waschen und enzymatische Verdauung des Deziduale Gewebes
<ol><li>Waschen Sie die gesammelten Gewebe indem sanft die 50 mL-Tube von hand schütteln und durch ein 250 μm metallsieb (250 μm, Größe 60 Mesh) ruhen auf einem sterilen Probe (Urin) Container übergeben.</li>
	<li>Wiederholen Sie das Waschen zweimal mit HBSS + / + und zweimal mit HBSS-/ - in frischen Rohre für jede Wäsche. (Finale wäscht mit HBSS-/-ermöglicht die Entfernung von Calcium und Magnesium in HBSS vorhanden + / +, die wäre sonst mit der folgenden enzymatische Verdauung stören). HINWEIS. Während die Waschschritte werden Chorion Gewebe Kontamination offensichtlich, als das deziduale Gewebe ist hellrosa Farbe und amorph, während das Chorion ist weiß, dicht und strähnig. Chorion Kontamination kann daher leicht mit der Pinzette entfernt werden.</li>
	<li>Optional, wenn das deziduale Gewebe dick ist, überträgt es auf eine sterile 10 cm Durchmesser Petrischale und gehen Sie zum Zerkleinern des Gewebes mit zwei gegnerischen Skalpelle in der Schale.</li>
	<li>
Legen Sie das gewaschene Gewebe in sterilen 50 mL-Tube mit 100 mg von Gewebe/mL enzymatische Verdauung Lösung (siehe Vorbereitungen).
	<ol>
<li>Als Bezugspunkt sicherzustellen Sie, dass die deziduale Gewebe zur 5-10 mL-Markierung auf die 50 mL Tube erreicht.</li>
		<li>Verwenden Sie ca. 20 mL der enzymatischen Verdauung Lösung (vorbereitet in Schritt 1.1), die insgesamt Dezidua gesammelt von einer gesamten Laufzeit fetalen Membran zu verdauen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Versiegeln Sie die Kappe des Rohres mit dem Paraffin-Film (die Röhre verschließen und wickeln Paraffin Film rund um die Kappe und die Oberseite des Rohres) unter die Kultur Haube und inkubieren Sie deziduale Gewebe bei 37 ° C für 20 min in einem schütteln Wasserbad (145 u/min 2 g).</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Inkubation den Paraffin-Film zu und Sterilisieren Sie die Oberfläche des Rohres, die verdaute Gewebe mit 70 % Ethanol enthält und unter dem Abzug zu bringen. Schütteln Sie das Rohr von hand kurz.</li>
	<li>Sammeln Sie Zellsuspension durch metallsieb (250 μm, Größe 60 Mesh) in einen neuen sterilen Probe Behälter. Verdünnen Sie mit ein gleiches Volumen (20 mL) von RPMI + 10 % FBS mit 0,1 % Normocin enzymatische Reaktion zu stoppen. Gehen Sie direkt zu Zentrifugationsschritt 4.1.</li>
	<li>Bei Bedarf setzen Sie die restliche unverdaute Gewebe wieder in eine neue 50 mL-Tube mit 20 mL frische enzymatische Verdauung Lösung und wiederholen Sie Verdauung (20 min, 37 ° C, schütteln Wasserbad) zu.</li>
	<li>Wenn eine zweite Verdauung notwendig ist, legen Sie das erste Rohr mit Zellsuspension auf Eis (Abdeckung mit Paraffin-Film steril zu halten). Wiederholen Sie die Schritte 3,5-3,6 und kombinieren Sie die zwei Zellen-Suspensionen.</li>
</ol>(4) erzeugen eine einzelne Zelle Suspension
<ol><li>Zentrifugieren der Zellsuspension (420 g, 4 ° C, 11 min.).</li>
	<li>Entfernen Sie den überstand und Aufschwemmen der Zellen in 40 mL RPMI + 2 % FBS mit 0,1 % Normocin ("Waschpuffer"). Hinweis: Zelle Pellets werden lose und wegen der roten Blutzelle Verschmutzung gallertartig, Aspirieren überstand mit Vorsicht. Entfernung der oberen Phase mit einer manuellen Pipette kann erforderlich sein.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Zentrifugation bei 420 g bei 4 ° C für 11 min.</li>
	<li>Sorgfältig entfernen des Überstandes (wie in Anmerkung Schritt 4.2 erwähnt) und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL Waschpuffer und 35 mL Erythrozyten Lyse Puffer im gleichen Rohr. Hinweis: Wenn das Diabolo groß oder sehr blutig ist, kann es in zwei Röhren für den Erythrozyten Lyse Schritt aufgeteilt werden durch Hinzufügen von 10 mL Waschpuffer und Teilen gleich in zwei Röhren und dann 35 mL Erythrozyten Lyse Puffer für jedes Rohr.</li>
	<li>Inkubation auf Eis für 20 min. kurz Wirbel Tube(n) am Anfang und am Ende der Inkubation, die roten Blutkörperchen lysiert.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 420 g für 11 Minuten bei 4 ° C.</li>
	<li>Sorgfältig, überstand zu entfernen und das Pellet in 40 mL Waschpuffer aufzuwirbeln.</li>
	<li>Durchlaufen Sie die Zellen einen 70 μm Nylon Filter, Zelle Klumpen zu entfernen.</li>
	<li>Zentrifuge bei 420 g für 11 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen den überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL komplette Medium (RPMI 10 % + FBS mit 0,1 % Normocin).</li>
	<li>
Anzahl Zellen mit Hilfe der Trypan blau Farbstoff-Ausschlußverfahren Hemocytometer wie unten beschrieben:
	<ol>
<li>Unter der Haube Kultur pipette vorsichtig Zellsuspension nach oben und unten 3 X um gründlich vor dem kombinieren mit Trypan blau mischen. In einer 1,5 mL Tube bereiten Zellsuspension, verdünnt 1:2 (Mähdrescher 20 μL Trypan blau-Lösung) und 20 μL deziduale Zellsuspension. Mischen Sie durch nach oben und unten ein paar Mal (diese Lösung ist nicht steril) pipettieren Trypan blau-Zelle Lösung sorgfältig.</li>
		<li>Platzieren Sie die Hemocytometer auf der Bühne des Mikroskops mit Glas Deckglas an der Spitze. Hinweis: Hemocytometer ist ein Mikroskop-Objektträger mit Gitter drauf, neun große Quadrate geteilt durch drei Linien geben. Jedes große Quadrat hat eine Fläche von 1 mm2, und die Flüssigkeit in der Kammer beträgt 0,1 mm. Daher ist das Volumen der Flüssigkeit, die jedes große Quadrat füllen kann 1 mm * 1 mm * 0,1 mm = 0,1 mm3= 10-4 mL.</li>
		<li>Fügen Sie 10 μL der Trypan blau-Zelle Mischung langsam in die Nut des Hemocytometer, so dass Kapillarwirkung zu zerstreuen die Zelle-Mischung über die gesamte Folie (Stop bevor Mischung gut ausfüllt hinzu)</li>
		<li>Sehen Sie die Zellen unter dem Mikroskop (bei 10 X Vergrößerung) und zählen Sie alle weiß/grün-Zellen, die Trypan blau (diese sind der lebensfähigen Zellen) in den vier großen äußeren Quadraten von der Hemocytometer ausschließen. Wenn Zellen zählen, die die Linie berühren, zählen Sie nur diejenigen die Note der rechten und oberen Zeilen, nicht aber die Berührung der linken und unteren Zeilen. Zählen Sie nicht Dunkele blaue Zellen; blauer Farbe weist darauf hin, dass die Zelle tot ist, wie Trypan blau färben leicht über die Plasmamembran in das Zytoplasma eindringen kann.</li>
		<li>Berechnen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen in 1 mL Zellsuspension (X): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57443/57443eq1v2.jpg"> 2 = Verdünnungsfaktor 10.000 = Umrechnungsfaktor (1 mL = 1 cm3 = 10, 000 * 0,1 mm3)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deziduale Zellen auf eine wünschenswerte Endkonzentration in RPMI + 10 % verdünnen FBS (Wachstumsmedium). Hinweis: Für Gewebekultur Plating, pipette 2 * 106 Zellen/Brunnen in einen Kunststoff 6-Well-Platte, 10 * 106 Zellen in einer 10-cm-Kunststoffplatte oder 75.000 zu einem Glas deckgläschen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+receptor+regulates+decidual+prolactin+expression+in+differentiating+human+endometrial+stromal+cells.">Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells.</a> Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).</li><li>Bell, S. C., D'Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Decidualization and relevance to menstruation. , 187-212 (1990).</li><li>Kariya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+inhibits+in+vitro+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells.">Interleukin-1 inhibits in vitro decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 73, 1170-1174 (1991).</li><li>Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+11+advances+progesterone-induced+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells.">Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Molecular and Human Reproduction. 8, 636-643 (2002).</li><li>Wu, W. -. X., Brooks, J., Glasier, A. F., McNeilly, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+decidualization+and+prolactin+mRNA+and+production+at+different+stages+of+human+pregnancy.">The relationship between decidualization and prolactin mRNA and production at different stages of human pregnancy.</a> Society for Endocrinology. 14, 255-261 (1995).</li><li>Bell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+secretion+of+protein+by+the+endometrium+and+decidua.">Synthesis and secretion of protein by the endometrium and decidua.</a> Implantation: Biology and Clinical Aspects. , 95-118 (1988).</li><li>Croy, B. A., Chantakru, S., Esadeg, S., Ashkar, A. A., Wei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decidual+natural+killer+cells:+key+regulators+of+placental+development.">Decidual natural killer cells: key regulators of placental development.</a> Journal of Reproductive Immunology. 57, 151-168 (2002).</li><li>Smarason, A. K., Gunnarsson, A., Alfredsson, J. H., Valdimarsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytosis+and+monocytic+infiltration+of+decidua+in+early+pregnancy.">Monocytosis and monocytic infiltration of decidua in early pregnancy.</a> Journal of Clinical and Laboratory Immunology. 21, 1-5 (1986).</li><li>Daiter, E., Pampfer, S., Yeung, Y. G., Barad, D., Stanley, E. R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+colony-+stimulating+factor-1+in+the+human+uterus+and+placenta.">Expression of colony- stimulating factor-1 in the human uterus and placenta.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 74, 850-858 (1992).</li><li>Casey, M. L., Cox, S. M., Beutler, B., Milewich, L., MacDonald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cachectin/tumor+necrosis+factor-alpha+formation+in+human+decidua.+Potential+role+of+cytokines+in+infection-induced+preterm+labor.">Cachectin/tumor necrosis factor-alpha formation in human decidua. Potential role of cytokines in infection-induced preterm labor.</a> Journal of Clinical Investigation. 83, 430-436 (1989).</li><li>Lala, P. K., Kennedy, T. G., Parhar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+lymphocyte+alloreactivity+by+early+gestational+human+decidua.+II.+Characterization+of+the+suppressor+mechanisms.">Suppression of lymphocyte alloreactivity by early gestational human decidua. II. Characterization of the suppressor mechanisms.</a> Cellular Immunology. 127, 368-381 (1988).</li><li>Shynlova, O., Nedd-Roderique, T., Li, Y., Dorogin, A., Nguyen, T., Lye, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infiltration+of+myeloid+cells+into+decidua+is+a+critical+early+event+in+the+labour+cascade+and+post-partum+uterine+remodelling.">Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17, 311-324 (2013).</li><li>Osman, I., Young, A., Ledingham, M. A., Thomson, A. J., Jordan, F., Greer, I. A., Norman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+density+and+pro-inflammatory+cytokine+expression+in+human+fetal+membranes,+decidua,+cervix+and+myometrium+before+and+during+labour+at+term.">Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term.</a> Molecular Human Reproduction. 9, 41-45 (2003).</li><li>Farine, T., Lye, S. J., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+maternal+leukocytes+are+activated+in+response+to+cytokines+secreted+by+uterine+tissues+of+pregnant+women.">Peripheral maternal leukocytes are activated in response to cytokines secreted by uterine tissues of pregnant women.</a> Journal of Cellular and Molecular Immunology. 14, 635-638 (2017).</li><li>Hamilton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+infiltrate+the+human+and+rat+decidua+during+term+and+preterm+labor:+evidence+that+decidual+inflammation+precedes+labor.">Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor.</a> Biology of Reproduction. 86, 39 (2011).</li><li>Casey, M. L., Cox, S. M., Word, A., Macdonald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+and+infection-induced+preterm+labour.">Cytokines and infection-induced preterm labour.</a> Reprodution Fertility and Development. 2, 499-510 (1990).</li><li>Yellon, S. M., Mackler, A. M., Kirby, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+leukocyte+traffic+and+activation+in+parturition.">The role of leukocyte traffic and activation in parturition.</a> Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 10, 323-338 (2003).</li><li>Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. S., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cells+in+term+and+preterm+labor.">Immune cells in term and preterm labor.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 11, 571-581 (2014).</li><li>Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+leukocytes+from+the+human+maternal-fetal+interface.">Isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface.</a> Journal of Visualized Experiments. 99, (2015).</li><li>Trundley, T., Gardner, L., Northfield, J., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolation+of+cells+from+the+human+fetal-maternal+interface.">Methods for isolation of cells from the human fetal-maternal interface.</a> Methods in Molecular Medicine. 122, 109-122 (2006).</li><li>Jividen, K., Movassagh, M. J., Jazaeri, A., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+methods+for+establishing+primary+human+endometrial+stromal+cells+from+hysterectomy+specimens.">Two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens.</a> Journal of Visualized experiments. 87, (2014).</li><li>Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+mesenchymal+stem/stromal+cells+derived+from+human+placenta+tissue.">Isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta tissue.</a> Journal of Visualized experiments. 112, (2016).</li><li>De Clercq, K., Hennes, A., Vrien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+endometrial+epithelial+and+stromal+cells+for+in+vitro+decidualization.">Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization.</a> Journal of Visualized Experiments. 121, (2017).</li><li>Zhang, J., Shynlova, O., Sabras, S., Bang, A., Briollais, L., Lye, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotyping+and+activation+status+of+maternal+and+peripheral+blood+leukocytes+during+pregnancy+and+labour,+both+term+and+preterm.">Immunophenotyping and activation status of maternal and peripheral blood leukocytes during pregnancy and labour, both term and preterm.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10, 2386-2402 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben

Das hier beschriebene Protokoll zeigt eine Kosten- und Zeit effektive Methode zur Isolierung von primärer deziduale Zellen gesammelt aus den fetalen Membranen des ganzen menschlichen Begriff plazentas, sehr zugänglich und unkompliziert ist. Der Erfolg dieses Protokolls ist abhängig von zwei entscheidende Faktoren, (1) die Effizienz der deziduale Schaben aus dem Chorion-Layer die fetalen Membranen und (2) die Pflege, mit der die deziduale Zellen im gesamten Protokoll behandelt werden. Es ist wichtig, dass Chorion Geweb...

Das Endometrium, eines der aktivsten erwachsenen weiblichen Gewebe durchläuft dramatischen Umbau jedes Menstruationszyklus in Reaktion auf die Stimulation durch Eierstockhormone, Östrogen (E2) und Progesteron (P4). Die Decidua, auch bekannt als die schwangere Endometrium, ist ein entscheidender Bedeutung reproduktives Gewebe, das durch das Ende der postovulatorischen Phase infolge P4-driven Differenzierung nach der E2-dominante proliferative Phase entsteht. Deziduale Zellen sind verantwortlich für die Sekretion von hormonellen Faktoren für eine erfolgreiche Blastozyste Implantation und für die Entwicklung der Utero-plazentaren Schnittstelle für die Aufrechterhaltung der mütterlichen Toleranz gegenüber der fetale Allograft.
Decidualization ist für die Implantation und die anschließende Umgestaltung der deziduale Spirale Arterien erforderlich. Endometriale Stromazellen Zellen durchlaufen Decidualization, unter der Kontrolle der P4 und Lager, während der späten luteal Phase des Menstruationszyklus1. Dieser Prozess ist rund um die Blutgefäße und breitet sich im ganzen das Stroma, was seine Rolle im Gefäßsystem Umbau und Leukozyten Menschenhandel Verordnung eingeleitet. Diese zellulären Transformation zeichnet sich durch eine kreisförmige Morphologie, erhöhte Kerngröße und Erweiterung des rauen endoplasmatischen Retikulum und Golgi-Apparat2. Decidualized Stromazellen Zellen sind in der Lage, Parakrine Faktoren unterstützen die Einnistung der Blastozyste und zeichnet sich durch die Ausschüttung zahlreicher Hormone (z. B. Prolaktin), angiogene Wachstumsfaktoren, Insulin Wachstumsfaktor binding Protein-1 (IGFBP-1), Prostaglandin (PG) E (Stimulator der intrazellulären cAMP), Zytokine, Komponenten der extrazellulären Matrix und Nährstoffe essentiell für plazentare Einnistung und Entwicklung3,4,5,6 .
Die deziduale Zellpopulation besteht nicht nur aus decidualized Stromazellen Zellen enthält aber auch große, Schwangerschaft-spezifische deziduale Leukozyten Populationen. Decidualization beinhaltet die transiente lokalisierte Ödeme und Zustrom von natürlichen killer (NK)-Zellen, T-Zellen, Dendritische Zellen und Makrophagen. Die größten Leukozyten Teilgesamtheit ist die uterinen NK-Zellen, bestehend aus ca. 50-70 % aller mütterlichen Leukozyten infiltrieren die Dezidua die eine Quelle von Zytokinen und angiogenen Faktoren, die möglicherweise Hilfe bei der Decidualization-Prozess und Zunahme der Anzahl in der gesamten Schwangerschaft7. Makrophagen, wird die zweitgrößte Subpopulation von Immunzellen, befinden sich rund um den Implantationsort und während der Schwangerschaft8erhöhen. Sie sind eine Quelle von Zytokinen und Wachstum Faktoren wie Kolonie stimulierende Faktor (CSF-1)9, Tumor-Nekrose-Faktor α (TNF)10 und Prostaglandin (PG) E11.
Während der gesamten Schwangerschaft und vor der Wehentätigkeit ist der Dezidua eine Hauptquelle der Zytokine und Chemokine verantwortlich für mütterliche peripheren Leukozyten-Aktivierung und anschließende Migration in die Gebärmutter Gewebe, Arbeit zu initiieren. Tierstudien zeigten, dass zahlreiche Pro-inflammatorischen Zytokinen bis in die Maus Dezidua geregelt während der wehen, wie TNF-a, IL-6, IL-12 und IL-1 b12. In der menschlichen Dezidua weisen Pro-inflammatorische Zytokine IL-1 b, IL-6 und IL-8 (große Neutrophilen lockstoffgradient) höheren Ausdruck während der Wehen im Vergleich zu nicht im Labor13. Diese Zytokine führen zu einer Aktivierung und Zustrom von Leukozyten in deziduale Gewebe14abgesondert; eine Zunahme der deziduale Makrophagen und Neutrophilen Infiltration in der Mensch und Ratte ist während der Wehentätigkeit, mit deziduale Infiltration vor Myometrial 4-fach größer ist, zeigt eine Kaskade von Aktivierung zwischen diese zwei benachbarte uterine Gewebe gesehen. 15. diese infiltrieren Leukozyten produzieren PGs in der Lage, synchrone Kontraktionen der Gebärmutter16zu aktivieren, Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) Membran initiieren Bruch17,18, sowie Pro-inflammatorischen Zytokinen, die uterine Aktivierung ("Zytokin-Sturm") zu verstärken.
Während können verschiedene Krankheiten durch viele wichtige Funktionen von deziduale Zellen, wie spielen eine entscheidende Rolle bei der Implantation Aufrechterhaltung mütterlich fötalen Toleranz in der frühen Schwangerschaft und die Teilnahme an der Aktivierung der Arbeit am Begriff auftreten. Schwangerschaft. (1) Unfruchtbarkeit aufgrund von wiederkehrenden Implantation Scheitern und wiederkehrende schwangerschaftverlust kann beispielsweise nach einem Ausfall der deziduale Reifung führen; (2) intrauterine Wachstumsretardierung (IUGR) und Präeklampsie durch unsachgemäße Entwicklungs- und Funktionsstörungen der Dezidua/Plazenta oder kompromittierten Gefäße Umgestaltung an der Kreuzung deziduale Myometrial; sowie (3) Frühgeburt, die von der vorzeitigen deziduale Aktivierung führen kann.
Vor dem Hintergrund dieser wichtigen Erkrankungen, gepaart mit den ethischen und praktischen Einschränkungen des menschlichen in-Vivo -Studien, zur Gründung von primären humanen deziduale Zelllinien ist essentiell für in-vitro- Analyse mit dem Ziel besser zu verstehen und Klinisches Management von Komplikationen während der Schwangerschaft zu verbessern. Daher war das Ziel unserer Forschung, ein Protokoll zu entwickeln, die für die Isolierung von menschlichen primären deziduale Zellen mit hohe Zellausbeute und Lebensfähigkeit, gesammelt von den fetalen Membranen der Begriff plazentas ermöglicht. Das aktuelle Protokoll klar beschreibt ein Zeit und Kosten wirtschaftlicheren Verfahren für bestimmte Subtypen von deziduale isolieren die Zellen für eine Vielzahl von in-vitro- Analysen verwendet werden. Charakterisierung der Fülle und Phänotyp der deziduale Sub-Populationen am Begriff und Vergleich zum ersten oder zweiten Trimester ist entscheidend für ihre Rollen in der gesamten menschlichen Schwangerschaft zu definieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution with calcium and magnesium</td>
			<td>Prepared in facility (LTRI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution without calcium and magnesium</td>
			<td>Prepared in facility (LTRI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaper pads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical scissors</td>
			<td>AL Medical</td>
			<td>2018-12-20.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large surgical forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic disposable cell scraper (25 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mm (size 60 mesh) metal sieve</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1020-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable scalpel with plastic handle (#21)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-927-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1473.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon filter (70 mm)</td>
			<td>VWR/Corning</td>
			<td>21008-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythrocyte lysis buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4% solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>1490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11835-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin (50mg/ mL)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 2, lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy bean trypsin inhibitor, powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9003-250mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA powder)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disc confocal microscope - Leica DMI 6000B</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Flow cytometer - Image Stream MK2</td>
			<td>Amnis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEA software</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated Vimentin antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC2105A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC H7-conjugated CD45 antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>641399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated Cytokeratin antibody</td>
			<td>MACs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-080-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP2-47941PCP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eFluor450 Fixable Viability dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65-0863-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-7558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 primary antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin primary antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 7 primary antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M7018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat IgG</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 secondary antibody</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A-11058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary human decidual cells from the fetal membranes of term placentae

Die Decidua, auch bekannt als die schwangere Endometrium, ist ein entscheidender Bedeutung reproduktives Gewebe. Deziduale Zellen, hauptsächlich bestehend aus decidualized Stromazellen und immune Zellen sind verantwortlich für die Sekretion von hormonellen und entzündliche Faktoren sind entscheidend für eine erfolgreiche Blastozyste Implantation, plazentar Entwicklung und spielen eine Rolle bei der Einleitung der Arbeit am Begriff und Frühgeborenen. Viele Komplikationen während der Schwangerschaft können durch Störungen der eine feine Balance der unterschiedlichen Zellpopulationen bestehend aus Dezidua entstehen. Veränderungen im Verhältnis von bestimmten deziduale Zelltypen können diese entscheidenden Prozesse stören und erhöhen das Risiko für schwere Komplikationen der Schwangerschaft, wie Embryo Implantation Versagen, intrauterine Wachstumsretardierung, Präeklampsie und Preterm Arbeit. Die hier beschriebene Protokoll zeigt eine Kosten- und Zeitaufwand die fetalen Membranen der Begriff plazentas wirksame Methode für die Isolierung von primären humanen deziduale Zellen entnommen. Durch die Kombination von enzymatischen Verdauung und sanfte mechanische Störung des deziduale Gewebes, erhielt eine hohe Ausbeute an deziduale Zellen praktisch ohne Chorion-Kontamination. Wichtig ist, zeichneten sich isolierte deziduale Zellen (Stromazellen Zellen (55-60 %), Leukozyten (35 %), epithelialen (1 %) oder Trophoblast (0,01 %) Zellen) und hohe Tragfähigkeit (80 %) die durch mehrfarbige bildgebenden Flow Cytometry Assay bestätigt wurde. Dieses Protokoll ist spezifisch für die Dezidua Parietalis und an ersten und zweiten Trimester plazentas angepasst werden kann. Einmal isoliert, können deziduale Zellen für eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen mit dem Ziel zu verstehen, die Rolle der verschiedenen deziduale Zelle Sub-Populationen in Komplikationen während der Schwangerschaft verwendet werden.

Um die Effizienz und Rentabilität der isolierten Zellen zu überprüfen, sie zeichneten sich durch zwei Methoden: flow Cytometry und Immunocytochemistry (ICC). 4-Zell-Populationen wurden gezielt; decidualized Stromazellen Zellen wurden von der Anti-Vimentin Antikörper erkannt, Pan-Leukozyten Marker CD45 wurde verwendet, um deziduale Immunzellen zu identifizieren, Cytokeratin wurde zur epithelialen/endothelial Zellen zu erkennen und schließlich Cytokeratin 7 wurde verwendet, um irgendwe...

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Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Dieses Protokoll zeigt eine Methode zur Isolierung von primären menschlichen deziduale Zellen gesammelt von den fetalen Membranen der Begriff plazentas, die für eine Vielzahl von Anwendungen (z. B. Immunocytochemistry, Durchflusszytometrie, etc.) verwendet werden können mit dem Ziel zur Untersuchung der Rolle von verschiedenen Zell-Populationen in Komplikationen während der Schwangerschaft.

Isolation von primären menschlichen Deziduale Zellen aus der fetalen Membranen der Begriff Plazentas

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

14.1K Aufrufe.  University of Toronto. Dieses Protokoll zeigt eine Methode zur Isolierung von primären menschlichen deziduale Zellen gesammelt von den fetalen Membranen der Begriff plazentas, die für eine Vielzahl von Anwendungen (z. B. Immunocytochemistry, Durchflusszytometrie, etc.) verwendet werden können mit dem Ziel zur Untersuchung der Rolle von verschiedenen Zell-Populationen in Komplikationen während der Schwangerschaft.

Serie: Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 diabetic islets from organ donors2. Here we share our protocol for isolating islets from human pancreatic tissue obtained from type 2 diabetic and non-diabetic patients who have undergone partial pancreatectomy due to different pancreatic diseases (benign or malignant pancreatic tumors, chronic pancreatitis, and common bile duct or duodenal tumors). All patients involved gave their consent to this study, which had also been approved by the local ethics committee. The surgical specimens were immediately delivered to the pathologist who selected soft and healthy appearing pancreatic tissue for islet isolation, retaining the damaged tissue for diagnostic purposes. We found that to isolate more than 1,000 islets, we had to begin with at least 2 g of pancreatic tissue. Also essential to our protocol was to visibly distend the tissue when injecting the enzyme-containing media and subsequently mince it to aid digestion by increasing the surface area.
To extend the applicability of our protocol to include the occasional case in which a large amount (&gt;15g) of human pancreatic tissue is available , we used a Ricordi chamber (50 ml) to digest the tissue. During digestion, we manually shook the Ricordi chamber3 at an intensity that varied by specimen according to its level of tissue fibrosis. A discontinous Ficoll gradient was then used to separate the islets from acinar tissue. We noted that the tissue pellet should be small enough to be homogenously resuspended in Ficoll medium with a density of 1.125 g/ml. After isolation, we cultured the islets under stress free conditions (no shaking or rotation) with 5% CO2 at 37 &deg;C for at least 48 h in order to facilitate their functional recovery. Widespread application of our protocol and its future improvement could enable the timely harvesting of large quantities of human islets from diabetic and clinically matched non-diabetic subjects, greatly advancing type 2 diabetes research.

The supply of type 2 diabetic islets for research is insufficient. Here we share our protocol for isolating islets from patients undergoing partial pancreatectomy. This approach represents a unique venue for obtaining islets from type 2 diabetic and clinically matched non-diabetic subjects in adequate numbers for basic and clinical studies.

Isolierung humaner Inselzellen aus teilweise Pankreatektomierten

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Forschung

Medizin

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts in this protocol have been successfully used in the derivation of induced pluripotent stem cells to model disease1. Early passages of these fibroblasts can also be used for cell-based functional assays to study specific disease pathways, mechanisms2 and subsequent drug screening approaches. The advantage of the presented protocol over enzymatic procedures are 1) the reproducibility of the technique from small amounts of tissue derived from older patients, e.g. patients affected with Parkinson's disease, 2) the technically simple approach over more challenging methodologies using enzymatic treatments, and 3) the time consideration: this protocol takes 15-20 min and can be performed immediately after biopsy arrival. Enzymatic treatments can take up to 4 hr and have the problems of overdigestion, reduction of cell viability and subsequent attachment of cells when not handled properly. This protocol describes the dissection and preparation of a 4-mm human skin biopsy for derivation of a fibroblast culture and has a very high success rate which is important when dealing with patient-derived tissue samples. In this culture, keratinocytes migrate out of the biopsy tissue within the first week after preparation. Fibroblasts appear 7-10 days after the first outgrowth of keratinocytes. DMEM high glucose media supplemented with 20% FBS favors the growth of fibroblasts over keratinocytes and fibroblasts will overgrow the keratinocytes. After 2 passages keratinocytes have been diluted out resulting in relatively homogenous fibroblast cultures which expresses the fibroblast marker SERPINH1 (HSP-47). Using this approach, 15-20 million fibroblasts can be derived in 4-8 weeks for cell banking. The skin dissection takes about 15-20 min, cells are then monitored once a day under the microscope, and media is changed every 2-3 days after attachment and outgrowth of cells.

The fibroblast explant culture protocol from human skin punch biopsies is a technically robust and simple way to derive skin cells within 4-8 weeks for banking of about 15-20 million cells at a low passage number.

Haut Stanzbiopsie Explantatkultur für die Ableitung des primären humanen Fibroblasten

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

Isolierung, Kultur und Imaging von humanen fötalen Pankreas-Zellhaufen

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Isolierung von Krebs Stammzellen aus menschlichen Prostatakrebs-Proben

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell culture systems arising from human endometrial samples are no exception. Applications range from normal cyclic physiological processes to endometrial pathologies such as gynecological cancers, infectious diseases, and reproductive deficiencies. Here, we provide two methods for establishing primary endometrial stromal cells from surgically resected endometrial hysterectomy specimens. The first method is referred to as &#8220;the scraping method&#8221; and incorporates mechanical scraping using surgical or razor blades whereas the second method is termed &#8220;the trypsin method.&#8221; This latter method uses the enzymatic activity of trypsin to promote the separation of cells and primary cell outgrowth. We illustrate step-by-step methodology through digital images and microscopy. We also provide examples for validating endometrial stromal cell lines via quantitative real time polymerase chain reactions (qPCR) and immunofluorescence (IF).

Establishing primary endometrial stromal cell culture systems from hysterectomy specimens is a valuable biological technique and a crucial step prior to pursuing a vast array of research aims. Here, we describe two methods used to establish stromal cultures from surgically resected endometrial tissues of human patients.&#160;

Zwei Methoden zur Festlegung von primären humanen Endometrium Stromazellen aus Hysterektomie Proben

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolation, Kryokonservierung und Kultur der Menschen Amnion Epithelzellen für Klinische Anwendungen

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

Isolation of Human Lymphatic Endothelzellen durch Multiparameter-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

Isolierung und Vermehrung von zirkulierenden Tumorzellen aus einer Maus Cancer

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Isolierung und Kultur von primären Endothelzellen von Canine Arterien und der

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...