Bu çalışmalar MEXT, JSP'ler KAKENHI Grant numaraları JP25290009, JP25650120, JP17K07494 ve JP17H05984 alınan hibe tarafından finanse edilmiştir.

1. bir Subpopulation bir lazer iki fotonlu mikroskop kullanarak nöronların ablasyon
Not: Kullanıcılar Ca görüntüleme aşağıdaki ablasyon edâ planlıyorsanız, UAShspzGCaMP6s satır21kullanın. Kullanıcılar davranış kayıt ablasyon takip edâ planlıyorsanız, ablasyon EGFP pozitif hücrelerinin daha GCaMP6s ifade hücrelerinin gerçekleştirmek kolay olan UAS:EGFP çizgi kullanın.
<ol><li>Etiketler belirlenmesi için belirli sinir hücreleri ve UAS:EGFP ya UAShspzGCaMP6s Gal4 bir satýr çiftleşme kadar ayarlayarak başlar. Sedef homozygotes elde edilebilir için her iki ebeveyn sedefli arka plan kullanmayı unutmayın. Not: Sedef homozygotes yok melanophores vücut yüzeyi (Şekil 1B) içerir. Mevcut çalışma, (ki Pretetto etiketleri) bir Gal4 satır gSAIzGFFM119B ve başka bir Gal4 hattı (hangi ILH etiketleri) hspGFFDMC76A kullanılan21vardır.</li>
	<li>Ertesi gün çiftleşme kurulumu, zebra balığı yumurta toplamak ve onları bu noktada faiz nöronlar floresan gazetecilere ifade edecek larva aşaması için yükseltmek.</li>
	<li>Zebra balığı larva de %2 düşük erime noktası-özel (Şekil 1B) bağlayın.<ol>
<li>%2 özel stok çözelti hazırlama başlayın: 2 g dağıtılması düşük erime noktası özel toz 100 mL sistem su (yani, dolaşımdaki su sisteminde yetişkin zebra balığı korumak için kullanılan su)22 veya E3 su23, su getirerek Kaynama noktası bir mikrodalga ve şiddetle karıştırma için.</li>
		<li>Kaynar kadar % 2 düşük erime noktası özel hisse senedi mikrodalga. 6-cm Petri kabına kapağı üzerine özel 3.5-4.0 mL dökün. Böylece devam etmeden önce dokunmak sıcak özel soğur kadar bekleyin.</li>
		<li>Daha sonra (Bu adımda anestezi değil) tek bir larva özel yerleştirin. Böylece dik, diseksiyon iğne (Şekil 1C), konumu ve larva yönünü ayarlama tutmak larva uygun konumlandırma sağlamak için özel katılaşır kadar. Not: Larva iken özel katılaşır çevresinde yüzerek devam edecektir.</li>
		<li>Larva konumlandırılmış, 5 min için tamamen kuvvetlendirmek özel izin verme.</li>
		<li>5 mL tricaine çözeltisi (1 x çalışma konsantrasyonu % 0,4) özel dökün. Not: Hareketleri larva tarafından lazer Ablasyon sırasında önlemek için larvalar ablasyon işlemi imzalat tutulması gerekir.</li>
	</ol></li>
	<li>Bir iki fotonlu lazer mikroskobu sisteminde beyazlatma işlevini kullanarak larva ablate.<ol>
<li>Bir iki fotonlu lazer tarama mikroskop altında özel katıştırılmış larva yerleştirin ve mikroskopi sistemini başlatın.</li>
		<li>Görüntü alma yazılımı başlatmak ve lazer (Şekil 1D) açmak için "Lazer" sekmesinde "On" düğmesini tıklatın. "Modu-kilitli için." "Meşgul" değiştirmek için lazer "durum" bekleyin</li>
		<li>880 lazer dalga boyu "Kanallar" sekmesinde ayarlanan nm (maksimum güç: Yaklaşık 2300 mW) EGFP ablasyon ya da 800 nm (maksimum güç: yaklaşık 2.600 mW) GCaMP ablasyon için.</li>
		<li>20 X objektif lens lens tabanca taşıyarak el ile seçin. "Yerleştirme" sekmesini tıklatın, "GFP" optik yolları değiştirmek ve floresan göz tarafından doğrudan görüntülemek için.</li>
		<li>Zebra balığı larva beyin görüntüleme merkezinde bulun; sonra iki fotonlu mikroskobu geri dönmek "Satın alma" sekmesini tıklatın.</li>
		<li>'Önce ablasyon' koşulu bir kayıt olarak, bir z-yığın görüntü 20 X objektif lens ile hızlı tarama-(ısı-zarar görmemesi için) hızda al. Daha sonra önce ve sonra ablasyon deneyler (Şekil 2A) çekilen görüntüleri karşılaştırın. "Z-yığın" z-yığın seçeneği seçin ve sonra larva beyin ventral tarafta odaklanarak alt sınırı (tıklayın "ayarla ilk" düğmesi") ve üst sınırı ("Son Set"düğmesini tıklatın) sekmesini genişletmek odaklanan sonra z fiş almak için tıklatın dorsal çoğu yüzey beyin. O zaman, z-yığın resim alma çalıştırmak için "Başlat Experiment" düğmesini tıklatın.</li>
		<li>63 X objektif lens lens tabanca taşıyarak el ile seçin.</li>
		<li>Epi-floresan mikroskopi geçiş, görünümü merkezinde göz tarafından ablated için hücreleri bulun, sonra tarama mikroskobu lazer geri dönmek "Satın alma" sekmesini tıklatın için "Yerleştirme" sekmesini tıklatın.</li>
	</ol></li>
	<li>"Satın alma modu" sekmesinde, "Çerçeve boyutu" 256 x 256 ayarlayın. "Canlı"'yı tıklatın ve nöronlar ilgi gözlemlemek.</li>
	<li>En arka taraftan başlayarak, ablated için hücreleri odakta olan bir odak düzlemi bulmak.</li>
	<li>Küçük, dairesel bir alan "Bölgeler" işlevini kullanarak yaklaşık üçte hücrenin boyutu çapı üzerinde her neuron ilgi (ROI) bir bölge olarak işaretleyin.</li>
	<li>Bir lazer Işınma Zamanı yaklaşık 200 µs/piksel veya 200 µs/0,5 µm için karşılık gelen 13,93 s/256 x 256 piksel (134.42 µm x 134.42 µm), için tarama hızını ayarlar. Ayrıca, 4 tekrar ayarla (' yineleme döngüsü: 4'). Böylece yeterli ablasyon elde alternatif olarak, yineleme ve tarama hızı optimize edin.</li>
	<li>Örnek (öncesi ve sonrası ablasyon) ve '(ROIs ayarlamak için) bölgeleri' veya eşdeğer işlevleri kullanılan yazılım (Şekil 1D) görüntüye ablasyon, 'saat serisi (2 döngüleri)' ile birlikte 'Bleaching' işlevi gerçekleştirir.</li>
	<li>(Önce ablasyon) ilk görüntü ve zaman serisi ikinci resimde (sonra ablasyon) karşılaştırarak döngüsü, beyazlatma, floresan (Şekil 2B) arka plan düzeyinde gözlenen için hedeflenen hücreleri azalır, sonra emin.</li>
	<li>Floresans ablasyon sonra hala varsa, yineleme sayısını artırmak.</li>
	<li>Daha sonra odak düzlemi biraz daha derin (yani, ventral yan doğru) hareket ve nerede un ablated hücreleri görünür sonraki odak düzlemi seçin.</li>
	<li>Ağartma işlevi (yukarıda adım 1.9) açıklandığı gibi yapar. İlgi sinirsel yapısındaki tüm hücreleri ablated kadar bu adımları yineleyin.</li>
	<li>Ablated için sinirsel yapıları kapsayan tüm odak uçaklar gittikten sonra kaldırıldı floresan için hücreleri denetleyin. Bazı hücreler hala nedeniyle yetersiz ablasyon floresan olmak bulunursa, lazer-onları tekrar açıklandığı gibi ışınlatayım.</li>
	<li>Larva özel lazer ile sonra kurtarılan gerekiyorsa, bu larva zarar verebilir çünkü dışında özel güç çalışmayın. Bunun yerine, dikkatle özel larva çevresinde küçük kesim dik onun vücut yüzeyine yapın. Daha sonra anestezik etkisi geçiyor zaman özel dışında kendi yüzmeyi larva için bekleyin.</li>
	<li>Ablasyon için sonraki larva geçin veya denetim başka bir nüfus davranış soruşturma altında ilişki kurmadan nöronların kullanarak deneyler yapmak. Not: Burada, kontrol, UAS:EGFP nöronlarda olfaktör ampul olarak; gSAIzGFFM119B larva lazer ablated-(Şekil 2A, sağ) açıklanan aynı iletişim kuralını kullanarak.</li>
	<li>Birkaç saat veya Ca görüntüleme (Bölüm 2) veya davranış kayıt (Bölüm 3) devam etmeden önce kurtarma için 1 gün izin. Bu kurtarma sırada, larva sağlık (yani, normal spontan yüzme, ablated alan, vbetrafında belirgin hiçbir ısı hasarı) denetleyin ve herhangi bir kötü sağlık belirtileri gösteren larva kaldırın.</li>
</ol>2. kalsiyum görüntüleme Pretetto ablated zebra balığı larva av uyarılmış nöronal etkinliklerini kaydetmek için
<ol><li>Kayıt odası hazırlamak için güvenli-mühür hibridizasyon odası conta yapıştırıcı yüzü cama bakacak şekilde bir cam slayt üzerinde koymak ve en iyi mühür kaldırın. Not: Bu 9 mm jant çapında ve derinlik (Şekil 3A) 0.8 mm bir küçük kayıt odası oluşturur.</li>
	<li>Daha sonra bir naylon mesh yerleştirin (açılış boyutu: 32 µm) kesip alt var bir 50 mL tüp üzerinde. Kap kafes Tube (Şekil 3B) bağlamak için kullanın.</li>
	<li>Paramecia (av larva için görsel uyarıcı kullanılacak olan) hazırlayın. Not: Terliksi Hayvan Kültür (adım 2.3.1 ve 2.3.2) hazırlamak önceden.<ol>
<li>Paramecia tohum kültür ticari kaynakları veya akademik biyo-kaynak merkezleri24 önceden alabilirsiniz.</li>
		<li>Kültür autoclaved pirinç saman ve Pelet kuru bira mayası22 (Şekil 3C) içeren suda birkaç gün Terliksi Hayvan .</li>
		<li>Terliksi Hayvan kültür 2 elekler gittikçe dökün (150 µm diyafram ile bir başka bir 75 µm diyafram ile tarafından takip) enkaz kültür kaldırmak için.</li>
		<li>Paramecia akışı aracılığıyla önceki adımda bir naylon mesh (13-µm diyafram) toplamak.</li>
		<li>Paramecia bir sıkmak şişe sistemi su (Şekil 3D) kullanarak bir cam kabı içine naylon mesh üzerinde yeniden askıya alma.</li>
	</ol></li>
	<li>Kafes (Şekil 3B) (Şekil 3E) x 2 sistem suda yıkayın. Not: Bu adımın amacı da çalışmanın amacı gözlemlemek için görsel olarak nöronal aktivite tahrik olduğu gibi herhangi bir olası odorants ve Terliksi Hayvan kültür ortamı, içerdiği tastants kaldırmaktır.</li>
	<li>Zebra balığı larva tricaine çözüm anestezi için yerleştirin.</li>
	<li>Tek bir larva iken % 2 düşük erime noktası özel olarak bağlayın.<ol>
<li>İlk olarak, % 2 düşük erime noktası özel mikrodalga ve 1/10 birim konsantre tricaine x 10 için özel ekleme.</li>
		<li>Tricaine içeren özel bir damla kayıt odası (Şekil 3A) yerleştirin.</li>
		<li>Onayladıktan sonra özel çok sıcak değil, (Kimden adım 2.5) imzalat larva özel yüzeyi hafif bombeli görünüyor ki hemen aşırı herhangi bir özel kaldırma özel yerleştirin.</li>
		<li>Hızlı bir şekilde larva dik bir diseksiyon iğnesi (Şekil 1C) gelecek şekilde yönlendirin. Not: Bu yordamları özel katılaşır önce birkaç saniye içinde tamamlanmalıdır.</li>
		<li>Larva şekilde alacak biçimde yerleştirildiğinden, 5 min için tamamen kuvvetlendirmek özel izin verme. Sonra bir damla 1 x tricaine çözüm özel dökün.</li>
	</ol></li>
	<li>Zebra balığı larva başının etrafında özel kaldırmak ve cerrahi bir bıçak kullanarak yüzmeyi Terliksi Hayvan için yer açın. Bunu yapmak için ilk olarak, özel (Şekil 3F) içinde bir kaç küçük kesim yapmak. Sonra yavaşça odası üzerinde sistem su dökerek aşırı özel dikkatli bir şekilde çıkarın. Not: Bu adımda, tricaine yıkanması.</li>
	<li>Daha sonra bir amip görsel bir uyarıcı hizmet için kayıt odasında koymak. Not: Terliksi Hayvan zebra balığı larva Başkanı yüzer zaman nöronal yanıt (Şekil 3G) uyandırmak.</li>
	<li>Kayıt odası bir epi-floresan mikroskop altında bir bilimsel CMOS Kamera (Şekil 3H) ile donatılmış ve bir 2.5 X objektif lens (Şekil 3ben) seçin.</li>
	<li>GCaMP floresan sinyallerini hızlandırılmış kayıtları toplamak.<ol>
<li>Donanımlı kamera görüntü satın alma uygulamasını başlatın.</li>
		<li>"Sıra bölmesi" ve "Sabit Disk kaydı" üstünde belgili tanımlık cam seçin. Tarama ayarları bölümünde, "çerçeve istenen sayısı" 900 ya da herhangi bir diğer toplam çerçeve numarasına ayarlayın. Not: Varsa, bir modül ile hızlandırılmış kayıt yazılımı kullanır (burada, "Sabit Disk kayıt") sağlayan bir sabit disk üzerine veri verimli kaydetme.</li>
		<li>"Yakalama" Bölmesi'nde, pozlama süresi 2 x 30-ms (yani, 33,3 fps) ve Binning 2 olarak ayarlamak.</li>
		<li>GCaMP benzer uyarma/emisyon spectra GFP için olduğu gibi dokunmatik panel kontrol mikroskobunun GFP için ayarla bir filtre seçin.</li>
		<li>"Live" içinde belgili tanımlık fotoğraf makinesi görünümünü ve odak (Şekil 4A), larva bulun ve sonra "Live durdurmak"'ı tıklatın ve "Başlat" düğmesine tıklayın için yakalama Bölmesi'ni tıklatın. Film .cxd veya satın alma durumu ile ilgili bilgiler başka bir biçimde kaydedin.</li>
	</ol></li>
	<li>Sonra kayıtları, hızlandırılmış film Fiji25özgür yazılım kullanarak beyin yapısında ayarlayın yatırım getirisi için Ortalama piksel değerlerini elde ederek GCaMP6s floresan sinyallerini (Ca sinyalleri) analiz. Not: Fiji olduğunu birçok yararlı tapa-içinde ile a yorum-in ImageJ'ın önceden yüklenmiş ve .cxd biçimi görüntü dosyaları ile Bio-oluşum-ebilmek okumak eklentisi.</li>
	<li>Larva biraz kayıt sırasında taşırsanız, Fiji'de TurboReg eklenti26 çalıştırarak görüntü kaydı gerçekleştirmek. Menüden, 'Eklentiler', 'Kayıt' ve 'TurboReg' seçin.</li>
	<li>Nasıl çalışma amacı göre verileri çözümlemek için göz önünde bulundurun. Bir örnek aşağıdadır.<ol>
<li>F/F0 (floresan yoğunluğu tarafından floresan yoğunluğu istirahat veya herhangi bir Ca geçici gerçekleştirilmeden önce bölünmüş her zaman) aşağıdaki gibi hesaplar:</li>
		<li>Ayarla ROIs Pretetto veya ROI Yöneticisi'ni kullanarak ILH: menüde, "Analiz"Araçlar,""ROI Yöneticisi"," seçin ve "Ekle" (Şekil 4A) ROIs listesinde.</li>
		<li>ROIs için Ortalama piksel değerlerini hesaplamak (i.e., floresans yoğunluklarını GCaMP6s in) ROI Yöneticisi panelde seçerek: "Daha fazla," "Çok ölçü" ve "Tamam." Sonuçları bir elektronik tablo dosyası olarak kaydedin.</li>
		<li>Sinyalleri gürültülü olarak, sinyalleri 11 saat-elektronik tablo verilerini işleyen bir Web uygulaması kullanarak puan (hareketli ortalama) için Ortalama.</li>
		<li>F (zamanla yoğunluklarda floresan) F0 tarafından bölmek (floresan yoğunluğu bazal düzeyinde) normalleştirilmiş floresan yoğunluğu hesaplamak için. Veri görselleştirme, örneği değiştikçe normalleştirilmiş GCaMP6s floresan yoğunluğu Pretetto ve ILH renk kodlu ve Terliksi Hayvan yörüngeler (Şekil 4B - D) eşleştirilmiş.</li>
	</ol></li>
</ol>3. lazer ablasyon aşağıdaki davranış sonuçları değerlendirilmesi
<ol><li>Bir video kamera ile donatılmış bir stereoscope oluşan bir davranış kayıt sistemi ayarlayın. Bir fotoğraf makinesi bir uygun görüntü alma yazılımı ile ticari veya özel yapım (Şekil 5A) kullanın.</li>
	<li>Aydınlatma koşulu Terliksi Hayvan görüntü işleme tarafından tespit edilebilir en iyi duruma. Örneğin, bir yüzük beyaz LED ışık bir ile (Şekil 5B) kullanılmalıdır. Not: Mesafe ve açısını, LED örnek (yani, karanlık arka planda parlak veya parlak arka planda karanlık) ve vardır, bu nedenle, başarılı görüntü işleme için kritik görünümünü etkiler. Rondela (Şekil 5C) en iyi yüksekliğini belirler.</li>
	<li>(Bölüm 1'de açıklanan lazer ablasyon deneme kurtarılan) bir zebra balığı larva (hangi bir cam slayt için bağlı olduğu) bir davranış kayıt odası kaldırıldı orijinal en iyi mühür ile (Şekil 5D) yerleştirin.</li>
	<li>50 paramecia Kültür (adım 2.3.5) toplamak bir micropipette kullanarak ve kayıt odasına koyun.</li>
	<li>Bir kapak notu kayıt odası üstüne yerleştirin. Küçük bir damla su ile ilgili kapak formu hava odasında tanıtımı önlemek için kayıt odası su yüzeyinde yerleştirmeden önce koymak. Not: Bu adımda, biraz su paramecia ile kayıt odasından taşma. Paramecia kayıt odasında kalan sayısı yaklaşık 30-40 olacak.</li>
	<li>(Bir larva ve parameciaiçeren) kayıt odası aydınlatma sistemi (Şekil 5D) yerleştirin.</li>
	<li>11 dk (6600 çerçeveler) için 10 kare/sn, hızlandırılmış kaydını Başlat seçimini yapın.</li>
	<li>(İsteğe bağlı) Davranış için test edildi her larva için lazer ablasyon (yani, devamsızlık veya önemli ölçüde azaltılmış sayısı, floresan hücreleri etkinliğini doğrulamak için floresan mikroskopi tarafından lazer ablated alanlarda floresans gözlemlemek Lazer ışınlanmış alan). Not: Işınlama sonra bile, floresan bazı hücreler hala daha sonra Gal4 gen ekspresyonu ablasyon27sonra Ayrıştırılan hücrelerdeki başlangıçlı nedeniyle görülebilmektedir.</li>
	<li>Larva'nın davranışı, tekdüzelik arka planda eksikliği telafi etmek için kaydettikten sonra her kare piksel piksel bölünmesi Fiji ortalama bir görüntü yerine getirilir: 'Süreç 'Görüntü hesap makinesi',' tıklayın ' işlemi: bölmek ', ' 32-bit (float) sonuç ', ve ' Tamam '. Ortalama bir resim yapmak, 'Resim', 'Yığar', 'Z-projesi', 'Ortalama yoğunluğu' ve 'OK' (Şekil 5E, F)'ı tıklatın.</li>
	<li>Paramecia sayısı 'Analiz 'Parçacıklar analiz',' ı tıklatarak odasında yaptı sayısı tüm paramecia, kapsayan bir alan aralığı ayarını 'Gösteri: maskeler' onay kutusunu kontrol ve 'Tamam' tıklatın. 'Show: maskeler' seçeneği ayıklanan paramecia görüntüyle (Şekil 5G), parçacıklar (paramecia) her kare sayısı listesini sağlar.</li>
	<li>Paramecia sol kayıt odasında sayısı zaman içinde arsa. Paramecia sayısı tahminleri gürültülü olduğu için hareketli ortalama 600 kare (1 dk) elektronik tablo bir aralıktaki her noktasında yapmak tavsiye.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+whole+picture:+A+comprehensive+imaging+approach+to+functional+mapping+of+circuits+in+behaving+zebrafish.">Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish.</a> Neuroscience. 296, 26-38 (2015).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+visualization+with+an+improved+GCaMP+calcium+indicator+reveals+spatiotemporal+activation+of+the+spinal+motor+neurons+in+zebrafish.">Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).</li><li>Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+space+cadet+gene+controls+axonal+pathfinding+of+neurons+that+modulate+fast+turning+movements.">The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements.</a> Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).</li><li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish.">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li><li>Sternberg, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+Neurotoxin+to+Investigate+the+Contribution+of+Excitatory+Interneurons+to+Speed+Modulation+In+Vivo.">Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo.</a> Curr Biol. , (2016).</li><li>Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+zebrafish+behavior+with+halorhodopsin.">Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).</li><li>Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+visually+guided+behavior+by+distinct+populations+of+spinal+projection+neurons.">Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons.</a> Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).</li><li>Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+projection+neurons+control+turning+behaviors+in+zebrafish.">Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish.</a> Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).</li><li>Smear, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+glutamate+transport+at+a+central+synapse+limits+the+acuity+of+visual+perception+in+zebrafish.">Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish.</a> Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).</li><li>Bianco, I. H., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visuomotor+transformations+underlying+hunting+behavior+in+zebrafish.">Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish.</a> Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).</li><li>Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visually+driven+chaining+of+elementary+swim+patterns+into+a+goal-directed+motor+sequence:+a+virtual+reality+study+of+zebrafish+prey+capture.">Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture.</a> Front Neural Circuits. 7, 86 (2013).</li><li>Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+2D+virtual+reality+system+for+visual+goal-driven+navigation+in+zebrafish+larvae.">A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae.</a> Sci Rep. 6, 34015 (2016).</li><li>Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+neuronal+activity+during+perception.">Real-time visualization of neuronal activity during perception.</a> Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).</li><li>Del Bene, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtering+of+visual+information+in+the+tectum+by+an+identified+neural+circuit.">Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit.</a> Science. 330 (6004), 669-673 (2010).</li><li>Semmelhack, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dedicated+visual+pathway+for+prey+detection+in+larval+zebrafish.">A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish.</a> Elife. 3, 04878 (2014).</li><li>Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+object+size+in+retinotectal+microcircuits.">Classification of object size in retinotectal microcircuits.</a> Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).</li><li>Romano, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+Neuronal+Network+Dynamics+Reveal+Circuit's+Functional+Adaptations+for+Behavior.">Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit's Functional Adaptations for Behavior.</a> Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).</li><li>Barker, A. J., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+decision+making+in+the+zebrafish+tectum.">Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum.</a> Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).</li><li>Ewert, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior. , (1980).</li><li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+hypothalamic+feeding+centre+upon+visual+prey+detection.">Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection.</a> Nat Commun. 8, 15029 (2017).</li><li>Muto, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+in+Free-Swimming+Larval+Zebrafish.">Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition. , (2007).</li><li>. Fiji Available from: <a target="_blank" href="https://fiji.sc">https://fiji.sc</a> (2017)</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Mueller, T., Wullimann, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU-,+neuroD+(nrd)-+and+Hu-studies+reveal+unusual+non-ventricular+neurogenesis+in+the+postembryonic+zebrafish+forebrain.">BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain.</a> Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).</li><li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+genetic+analysis+of+visual+behavior+in+zebrafish.">Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish.</a> PLoS Genet. 1 (5), 66 (2005).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li></ol>

Yazarlar raporlanacak hiçbir çıkar çatışması var.

İki fotonlu lazer özellikle bireysel nöronlar ablate için mükemmel bir uzaysal çözünürlük olmasına rağmen ısı nedeniyle beyin dokusu üzerinde istenmeyen herhangi bir zarar vermemek için çok dikkatli alınmalıdır. Ablasyon deney konusunda en önemli adım lazer ile en uygun miktarda tespit etmektir. Yetersiz ışınlama nöronlar öldürmek başarısız olur. Çok fazla ışınlama istenmeyen etkileri neden olur çevreleyen doku ısı-hasar olacak. Lazer ile (ROIs, yinelemeler ve tarama hızı alanları...

Nasıl davranış beyinde nöronal aktivite doğar anlamak için bu davranışı üretimi söz konusu sinir devreleri tanımlamak gereklidir. Küçük, şeffaf beyinleri geniş bir alanda hücresel çözünürlükte nöronal aktivite araştırmak olanak sağlar çünkü beyin fonksiyonu eğitim davranışı ile ilişkili larva aşamasında, zebra balığı ideal bir hayvan modeli sağlar. davranış1gözlem sırasında beyin. Görüntüleme belirli nöronlar nöronal faaliyete GCaMP2gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum (Ca) göstergeleri (turk) icadı sayesinde mümkün olmuştur. GCaMP transgenik zebra balığı işlevsel sinir devre davranışı ile hayvanlar3davranışlar içinde Ca görüntüleme yaparak ilişkilendirmek için yararlı olması için kanıtlanmış.
CA görüntüleme nöronal aktivite ve davranışı arasındaki bağıntıları kanıtlamanın, nedensellik, göstermek için nöronal aktivite ve onun consequence(s) davranışı üzerinde test bastırılması iken önemli adımlar. Bunu sağlamanın çeşitli yolları vardır: belirli sinir devreleri4, nörotoksinler belirli nöronlar5,6, halorhodopsin7gibi optogenetic araçların kullanımını ifade değiştirir genetik mutasyonun kullanın ve Lazer ablasyon hedeflenen nöronlar8,9. Lazer ablasyon belirli nöronlar nispeten az sayıda etkinliğinde ortadan kaldırılması için özellikle uygundur. Geri dönüşü olmayan sinir hücreleri öldürmek tarafından nöronal aktivite kaldırılması davranış sonuçları değerlendirilmesi kolaylaştırır.
Zebra balığı larva safhasında gözlenen bir ilginç av yakalama (Şekil 1A) davranıştır. Bu görsel olarak destekli, hedefe yönelik davranış olumlu bir deneysel sistem görme keskinliği10, visuomotor dönüştürme11,12,13, görsel algı ve tanınması için çalışma sağlar. nesneleri14,15,16,17,18ve karar verme19. Nasıl yırtıcı yırtıcı ve AVI algılama av nasıl yol açar tarafından davranış yakalamak neuroethology20merkezi bir soru olmuştur kabul edilmektedir. Bu yazıda, Pretetto çekirdeğinde projeksiyonları tarafından kurulan pretecto-hipotalamik devre rolü ele (çekirdek pretectalis superficialis pars magnocellularis, bundan sonra sadece Pretetto kaydetti) için ILH. Lazer-ablasyon Pretetto, av yakalama etkinliğini azaltmak ve nöronal visual av algı21ile ilişkili ILH etkinliğinde kaldırılması gösterilmiştir. Burada, yerine getirmek için kullanılan iletişim kuralları lazer ablasyon ve onun etkisi Ca2 + görüntüleme ve davranış kayıt içinde zebra balığı larva açıklanmıştır kullanarak test.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1283px;" width="1282">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:316px;">NuSieve GTG Agarose</td>
			<td style="width:223px;">Lonza</td>
			<td style="width:361px;">Cat.#50080</td>
			<td style="width:383px;">low-melting temperature agarose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">6 cm petri dish</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>Product#:351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dissecting needle</td>
			<td>AS ONE Corporation</td>
			<td>Cat. No. 2-013-01</td>
			<td>https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">LSM7MP</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>two-photon laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">W Plan-Apochromat 63x/1.0</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>63X objective lens</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Imager.Z1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>an epi-fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ZEN</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition software for confocal microscopes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Catalogue # S-24732</td>
			<td>Used as a recording chamber in Ca imaging</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Imageing Chambers</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5</td>
			<td>Used as a behavioral recording chamber</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">surgical knife</td>
			<td>MANI</td>
			<td>Ophthalmic knife MST15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ORCA-Flash4.0</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>model:C11440-22CU</td>
			<td>a scientific CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:316px;">HCImage</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:361px;"></td>
			<td style="width:383px;">image acuisition software</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;">Hard Disk Recording module</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:361px;"></td>
			<td style="width:383px;">An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SZX7</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>stereoscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DF PL 0.5X</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>objective lens for SZX7</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio</td>
			<td>FLIR Systems, Inc.</td>
			<td>Product No. GS3-U3-41C6NIR-C</td>
			<td>CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">XIMEA xiQ camera</td>
			<td>XIMEA</td>
			<td>Product No. MQ042RG-CM</td>
			<td>CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">a ring LED light</td>
			<td>CCS</td>
			<td>Model: LDR2-100SW2-LA</td>
			<td>White LED</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:316px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:361px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nylon mesh 32&#181;m</td>
			<td>Tokyo Screen</td>
			<td>N-No.380T</td>
			<td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Nylon mesh 13&#181;m</td>
			<td>Tokyo Screen</td>
			<td>N-No. 508T-K</td>
			<td style="width:383px;">http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:316px;">Metal seive 150 micron aperture</td>
			<td>Tokyo Screen</td>
			<td style="width:361px;"></td>
			<td style="width:383px;">http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:316px;">Metal seive 75 micron aperture</td>
			<td>Tokyo Screen</td>
			<td></td>
			<td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:316px;">EBIOS</td>
			<td>Asahi Food &#38; Healthcare, Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>dry beer yeast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:316px;">LabVIEW</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>an integrated development environment for programming</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:316px;">Mai-Tai HP</td>
			<td>Spectra Physics&#160;</td>
			<td></td>
			<td>two-photon laser&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ablation of a neuronal population using a two-photon laser and its assessment using calcium imaging and behavioral recording in zebrafish larvae

Bir subpopulation davranış nöronların rolü tanımlamak için faaliyete yaşayan hayvanlarda engelleme sonuçlarını test etmek esastır. Ne zaman sinir hücreleri seçerek floresan problar ile etiketlenir lazer ablasyon nöronların bu amaç için etkili bir yöntemdir. Bu da çalışmanın, bir subpopulation iki fotonlu mikroskop kullanarak ve onun işlevsel ve davranışsal sonuçları test nöronların ablating lazer protokollerde açıklanmıştır. Bu çalışmada, zebra balığı larva'av yakalama davranışı bir çalışma modeli kullanılır. Pretecto-hipotalamik devre davranış bulaşıcı görsel olarak tahrik av altında yatan olduğu bilinmektedir. Zebra balığı Pretetto lazer ablated ve hipotalamus (ILH; pretectal projeksiyon hedef) alt lob nöronal aktivite incelenmiştir. Av yakalama davranışı pretectal ablasyon sonra da test edildi.

Belirli nöronlar genetik olarak EGFP ya da GCaMP6s Ifade Gal4 satırlarında tahrik, etiketlenmiş. Gal4 hattı gSAIzGFFM119B bir çekirdek pretectal alanında (magnocellular yüzeysel pretectal çekirdeği), hem de bir subpopulation olfaktör ampul nöronların etiketlemek için kullanıldı. Başka bir Gal4 satır, hspGFFDMC76A, ILH etiketlemek için kullanıldı. Biz lazer-pretectal nöronlar bilateral ablated (resim 2A sol paneli) ve ayn...

Watch this Scientific Journal Video about Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Burada, zebra balığı larvaları üzerinden bir iki fotonlu lazer nöronların genetik olarak etiketlenmiş bir subpopulation ablate için bir protokol mevcut.

Ablasyon nöronal nüfusunun iki fotonlu lazer ve kalsiyum görüntüleme ve davranış kayıt zebra balığı larva kullanarak kendi değerlendirme kullanma

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

ablation-neuronal-population-using-two-photon-laser-its-assessment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K Görüntüleme.  SOKENDAI (The Graduate University for Advanced Studies). Burada, zebra balığı larvaları üzerinden bir iki fotonlu lazer nöronların genetik olarak etiketlenmiş bir subpopulation ablate için bir protokol mevcut.

Video: Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Nörobilim

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Zebra balığı Larva otomatik Yüksek verim Davranış Analizleri

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve Suprakiazmatik Nucleus Nöronlar Kalsiyum Görüntüleme

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

Elektrofizyoloji ve Kalsiyum-görüntüleme için akut nöronal Doku Uzamış İnkübasyon

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the human brain. MEG is quiet and less likely to induce claustrophobia compared with magnetic resonance imaging (MRI). It is therefore a promising tool for investigating brain function in young children. However, analysis of MEG data from pediatric populations is often complicated by head movement artefacts which arise as a consequence of the requirement for a spatially-fixed sensor array that is not affixed to the child's head. Minimizing head movements during MEG sessions can be particularly challenging as young children are often unable to remain still during experimental tasks. The protocol presented here aims to reduce head movement artefacts during pediatric MEG scanning. Prior to visiting the MEG laboratory, families are provided with resources that explain the MEG system and the experimental procedures in simple, accessible language. An MEG familiarization session is conducted during which children are acquainted with both the researchers and the MEG procedures. They are then trained to keep their head still whilst lying inside an MEG simulator. To help children feel at ease in the novel MEG environment, all of the procedures are explained through the narrative of a space mission. To minimize head movement due to restlessness, children are trained and assessed using fun and engaging experimental paradigms. In addition, children's residual head movement artefacts are compensated for during the data acquisition session using a real-time head movement tracking system. Implementing these child-friendly procedures is important for improving data quality, minimizing participant attrition rates in longitudinal studies, and ensuring that families have a positive research experience.

This article introduces a child-friendly research protocol designed to improve data quality by reducing head movement during pediatric magnetoencephalography (MEG). We familiarize families with the MEG environment, train children to remain still using an MEG simulator, and correct for residual head movement artefacts using a real-time head movement detection system.

Beyin fonksiyonları çocuklarda Magnetoencephalography kullanarak eğitim

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy

Recent advances in optical bioimaging and optogenetics have enabled the visualization and manipulation of biological phenomena, including cellular activities, in living animals. In the field of neuroscience, detailed neural activity related to brain functions, such as learning and memory, has now been revealed, and it has become feasible to artificially manipulate this activity to express brain functions. However, the conventional evaluation of neural activity by two-photon Ca2+ imaging has the problem of low temporal resolution. In addition, manipulation of neural activity by conventional optogenetics through the optic fiber can only simultaneously regulate the activity of neurons with the same genetic background, making it difficult to control the activity of individual neurons. To solve this issue, we recently developed a microscope with a high spatiotemporal resolution for biological applications by combining optogenetics with digital holographic technology that can modify femtosecond infrared laser beams. Here, we describe protocols for the visualization, evaluation, and manipulation of neural activity, including the preparation of samples and operation of a two-photon holographic microscope (Figure 1). These protocols provide accurate spatiotemporal information on neural activity, which may be useful for elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that lead to abnormalities in neural activity.

We developed a two-photon holographic microscope that can visualize, assess, and manipulate neural activity using high spatiotemporal resolution, with the aim of elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that are associated with abnormal neural activity.

Ablasyon nöronal nüfusunun iki fotonlu lazer ve kalsiyum görüntüleme ve davranış kayıt zebra balığı larva kullanarak kendi değerlendirme kullanma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler