Bu çalışma, Sinica Akademisi Moleküler Biyoloji Enstitüsü ve Tayvan Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi tarafından desteklenmiştir. Fizik Enstitüsü'ndeki Makine Atölyesi, Academia Sinica, özel tasarım parçaların üretilmesine yardımcı oldu. Ayrıca P. Argast'a (Friedrich Miescher Biyomedikal Araştırma Enstitüsü, Basel, İsviçre) kafa aşamasının hızlı kilit mekanizmasının tasarımı için teşekkür etmek istiyoruz.

Tüm hayvan prosedürleri, Academia Sinica Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir. Araştırma araçlarının ayrıntıları Malzeme Tablosunda bulunabilir.
1. Kayıt odasının hazırlanması
<ol><li>Yarı altıgen bir tank, bir taban plakası ve bir kafa aşaması hazırlayın (Şekil 1A; Ek Dosyalar 1-3). Baş aşaması, dairesel bir plakaya tutturulmuş iki metal direkten oluşur. Dairesel plaka, taban plakasına kilitlenebilen oluklar içerir. Birbirine kilitlendikten sonra, kafa aşaması ve taban plakası yarı altıgen tankın altına yerleştirilir.</li>
	<li>Yarı altıgen tankı mikroskobun deney platformuna yerleştirin. Platform, çeviri aşamasının sınırına çarpmadan X ve Y yönlerinde hareket edebilmelidir.</li>
	<li>Davranışsal kayıt için 810 nm kızılötesi (IR) ışığı ve kamerayı baş sahneye doğrultun. Kameranın görüş alanının yetişkin bir zebra balığının sığabileceği kadar geniş olduğundan emin olun.<ol><li>İki fotonlu lazerin ve görsel uyaranın davranışsal kayda müdahale etmesini önlemek için, kameranın önüne sırasıyla 875 nm kısa geçiren filtre ve 700 nm uzun geçiren filtre kurun.</li>
	</ol></li>
	<li>Görsel uyaranı sunmak için, yarı altıgen tankın üç duvarının iç tarafına geri projeksiyon filmleri takın (Şekil 1A).</li>
	<li>Üç projektörü tankın üç yüzeyine doğrultun. Üç görüntü, sürekli bir görsel sahne oluşturacak şekilde hizalanmalıdır. Projektör ışıklarının kalsiyum floresan sinyalini kirletmesini önlemek için, her projektörün önüne bir nötr yoğunluk filtresi ve bir kırmızı renk filtresi (600 nm, uzun geçişli) yerleştirin ve fotoçoğaltıcı tüpün (PMT) önüne bir bant geçiren filtre (510/80 nm) yerleştirin.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65526/65526fig1v8.jpg"> Şekil 1: Baş desteği ameliyatı için gerekli aletler. (A) Baş aşamasının dairesel plakası ile yarı altıgen tankın içindeki taban plakası arasındaki hızlı kilitleme mekanizması. Özel yapım parçaların bilgisayar destekli tasarım (CAD) dosyaları Ek Dosyalar 1-4'te bulunabilir. (B) Baş desteği için Ω şeklinde kafa çubuğu. (C) Kafa çubuğunu bağlantı yerine konumlandırmak için kullanılan üç eksenli mikro manipülatör. İç: kafa çubuğunun kil içindeki yönü. (D) Ameliyat sırasında balığı tutmak için top. Ek: topun içindeki balıkların oryantasyonu. (E) Balık yükleme modülü ve balığı baş aşamasına yüklemek için kullanılan mikromanipülatör. Ek: modül içindeki balıkların oryantasyonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65526/65526fig1v8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
2. Baş desteği ameliyatı
<ol><li>Ω şeklinde bir kafa çubuğu hazırlayın (Şekil 1B; Ek Dosya 4) zebra balığı baş desteği için. Bunu yapmak için, üç eksenli bir mikromanipülatöre bir parça yağ bazlı modelleme kili takın. Kilin baş çubuğunu tutacak kadar sağlam, ancak baş desteğinden sonra baş çubuğundan ayrılacak kadar yumuşak olduğundan emin olun.</li>
	<li>Kafa çubuğunun bir kolunu kile sokun ve kafa çubuğunu yatay olarak yönlendirin (Şekil 1C). Bu, baş çubuğunun zebra balığına daha sonra bağlanmasının düz olmasını sağlayacaktır. NOT: Kafa çubuğu titanyumdan (24 mg) veya paslanmaz çelikten (43 mg) yapılabilir ve birden fazla deney için yeniden kullanılabilir. Baş çubuğu malzemesi, yetişkin zebra balıklarının (ağırlık 300-1.000 mg arasında değişir) baş desteği altındaki davranışını etkilemez.</li>
	<li>Ameliyat sırasında balık gövdesini yerinde tutmak için içi boş bir tüp olan topu hazırlayın (Şekil 1D).</li>
	<li>Akvaryum suyunda %0.03 ve %0.01 trikain metansülfonat (TMS; Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın. Bu, ameliyat sırasında balığı uyuşturmak ve yatıştırılmış bir durumda tutmak için kullanılacaktır.</li>
	<li>Kafatasındaki bağlantı yerlerinden fazla deri ve suyu çıkarmak için dört doku çubuğu hazırlayın. Her bir çubuğu hazırlamak için, bir kağıt havluyu 3 cm'lik bir kareye kesin ve tüp benzeri bir yapı oluşturmak için köşegeni boyunca katlayın. Tüpün uçlarını ince bir noktaya bükün. Bağlantı yeri çok küçüktür, bu nedenle ince bir nokta, swabın daha hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlar.</li>
	<li>Mikromanipülatör için bir balık yükleme modülü hazırlayın (Şekil 1E). NOT: Modül, dik açılı bir direk kelepçesi ile bir arada tutulan iki çelik direkten oluşur. Bir direk mikromanipülatöre takılırken, diğer direk balığı taşıyan dönen bir direk kelepçesi tutar. Modül, balığı hassas bir kontrolle baş aşamasına yerleştirmek için kullanılır. Dönen direk kelepçesi, balığın eğim açısını değiştirmek için bir adım ayarlayıcı görevi görür.</li>
	<li>Akvaryum suyunda% 0.03 TMS ile balıkları uyuşturun. Aşağıdaki adımlar boyunca, akvaryum suyunda% 0.01 TMS'yi her 90 saniyede bir kısa darbelerle ağza vermek için bir şırınga kullanın. Perfüzyondan gelen su akışı solungaç hareketini indüklemelidir. Bu, balığın ameliyat sırasında 40 dakikadan fazla hayatta kalmasını sağlayacaktır. NOT: Tg [neuroD: GCaMP6f], hem larva hem de yetişkin aşamalarında ön beyindeki kalsiyum göstergesinin geniş ekspresyonu nedeniyle kullanılır10. NOT: İsteğe bağlı olarak, ameliyatta her iki elin meşgul olduğu dönemlerde ağza sürekli su akışı sağlamak için yerçekimi perfüzyonu kullanın.</li>
	<li>Balıkları, balığı topun içinde tutan bir kapsüle (Şekil 2A) sarın.<ol><li>Anestezi uygulanmış balığı kuyruğun ucundan başlayarak solungaçtan solungaca yaklaşık 1 mm kaudal olacak şekilde bir parça nemli kağıt mendile sarın. Balığın dokudan kaymasını önlemek için sargının sıkı olduğundan emin olun.</li>
		<li>Balığı kuyruğun ucundan solungaçtan yaklaşık 2 mm kaudal'a kadar örtmek için kağıt mendilin etrafına uzunlamasına yarıklı (örneğin, orta büyüklükte ısıyla daralan bir boru) yumuşak bir plastik boru sarın. Boru, balığın vücudunun ameliyat boyunca düz kalmasını sağlar.</li>
		<li>Borunun etrafına kabaca topun çapına benzer bir çapa kadar bir kağıt havlu sarın.</li>
		<li>Plastik transfer pipetinin ampulünden kesilmiş yumuşak bir plastik tüpü kağıt havlunun etrafına sarın. Bu, kapsülün topa sorunsuz bir şekilde yüklenebilmesini sağlar.</li>
		<li>Balıkları topun içine yükleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Bağlanma yerlerini kaplayan deriyi, kafatasının beyincik rostrolateralinde ve solungaçların üzerinde iki üçgen bölgesini çıkarmak için bir neşter kullanın (Şekil 2B), ardından bağlanma bölgeleri arasındaki bölgeyi kaplayan cildi çıkarın. Bağlanma bölgelerini kurutmak ve kalan cildi temizlemek için doku çubukları kullanın.<ol><li>Derinin çıkarılması sırasında başı desteklemek için ayarlanabilir bir platform kullanın, ancak operasyon sırasında göz yaralanmasını önlemek için platform gözlere temas etmemelidir. NOT: Bağlanma bölgelerindeki derinin tamamen çıkarılması, görüntüleme sırasında hareket artefaktlarını azaltmada çok önemlidir.</li>
	</ol></li>
	<li>10 μL'lik bir pipet ucu kullanarak her bağlantı bölgesinin ortasına bir damla doku yapıştırıcısı (Malzeme Tablosuna bakın) uygulayın. NOT: Doku yapıştırıcısı bağlantı yerlerini kaplar ve çabuk kurur. Doku yapıştırıcısı, kafatası ile kafa çubuğunu yapıştırmak için kullanılan diş çimentosu arasında bir bağlanma arayüzü sağlar ve solungaçlardan gelen suyun bağlantı bölgesine ulaşmasını önler.</li>
	<li>Balık gövdesini dik konuma getirin ve baş çubuğu yapıştırmaya hazırlanırken baş çubuğunu biraz yukarıya ve bağlantı yerlerine kaudal olarak yerleştirin.</li>
	<li>Diş çimentosu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın) ve kafa çubuğunu kafatasına yapıştırmak için hemen kullanın (Şekil 2C). İşlem zamana duyarlıdır ve 45 saniye içinde yapılmalıdır.<ol><li>Küçük bir kaşık polimeri dört damla hızlı monomer ve bir damla katalizör V ile karıştırın. Karışımı 15 saniye boyunca eşit şekilde karıştırın.</li>
		<li>Karışımı bağlantı bölgelerine ve bölgeler arasındaki bölgeye uygulamak için bir mikropipet ve 10 μL'lik bir pipet ucu kullanın. Solungaçları ve gözleri kapatmaktan kaçının.</li>
		<li>Mikromanipülatörü kullanarak baş çubuğunu çimentoya hafifçe bastırın. Baş çubuğunu kalan çimento ile örtün.</li>
		<li>Diş çimentosunun kürlenmesi için 12 dakika bekleyin. Çimento ile su temasından kaçının.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalsiyum görüntüleme için ön beyne optik erişimi iyileştirmek için, telensefalonun üzerindeki cildi çıkarın. Derinin çıkarılması, bir neşter kullanılarak beş kesi ile 3 dakika içinde yapılabilir (Şekil 2D). Kafataslarının yüzeyine yapışan lipit damlacıklarının çıkarıldığından emin olun.</li>
	<li>Sertleştikten sonra kili baş çubuğundan çıkarın.</li>
	<li>Tüm kapsülü toptan mikromanipülatörün balık yükleme modülündeki zift ayarlayıcıya aktarın.</li>
	<li>Balığı konumlandırmak için mikromanipülatörü kullanın. Baş çubuğu, baş aşamasının metal direklerinin üzerine yerleştirilmelidir. İki fotonlu görüntüleme sırasında ön beynin yüzeyinin optik düzleme daha iyi hizalanabilmesi için balığın eğim açısını hafifçe artırın.</li>
	<li>Kafa çubuğunu ultraviyole (UV) ile kürlenebilen yapıştırıcı ile metal direklere yapıştırın. Kürlenme için 15 sn UV'ye maruz kalma yeterlidir.</li>
	<li>Balığı kapsülden dışarı çekin ve baş aşamasını yarı altıgen tankın içindeki taban plakasına kilitleyin.</li>
	<li>Hayvanı akvaryum suyuna daldırın. Balık 1-2 dakika içinde nefes almaya başlamalı ve anesteziden kurtulmalıdır. NOT: İsteğe bağlı olarak, ağza tatlı su vermek için şırınga perfüzyonu kullanın.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65526/65526fig02.jpg"> Şekil 2: Baş desteği ameliyatı sırasındaki önemli adımlar . (A) Topun içindeki kapsülün bileşimi. (B) Kafatasındaki bağlanma yerleri (kırmızı). Kırmızı oklar kan damarı bölgelerini belirtir. (C) Üst: balık kafatasına bağlı baş çubuğu. Altta: baş sahneye yüklenen balık. (D) Ön beynin üzerindeki deriyi çıkarmak için gerekli kesikler. Sayılar kesme sırasını gösterir. Hayvanın kanamasını önlemek için işaretli bölgede (ok ucu) derinin çıkarılmasından kaçının. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65526/65526fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
3. İki fotonlu görüntüleme
<ol><li>Lazeri açın ve gücün dengelenmesi için 30 dakika bekleyin. Örnekte dalga boyunu 920 nm'ye ve gücü yaklaşık 50 mW'a ayarlayın. NOT: Rezonans tarayıcı tarafından kontrol edilen lazer ışını, tarama yolunun geri dönüş noktalarında yavaşça hareket eder. Doku hasarını önlemek için, geri dönüş noktalarında lazer gücünü azaltmak için bir Pockels hücresi kullanılır.</li>
	<li>Kafası sabitlenmiş zebra balığını içeren kayıt odasını deney platformuna yerleştirin (Şekil 3A). Platform, çeviri aşamasının sınırına çarpmadan X ve Y yönlerinde hareket edebilmelidir.</li>
	<li>Objektif lensi ön beyin yüzeyine mümkün olduğunca yakın yerleştirin. Objektif mercek, göz bebeğinin ön kenarına yönelik olmalıdır (Şekil 3B).</li>
	<li>Lazer deklanşörünü açın ve PMT'yi etkinleştirin. Floresan görüntüsünde dorsal ön beyin ortaya çıkana kadar objektif lensi (~1 mm) kademeli olarak yükseltin (Şekil 3C).</li>
	<li>Kaydedilen nöron sayısını artırmak için, birden fazla derinlikte (15 μm aralıklarla altı görüntü düzlemi) görüntü elde etmek için bir piezo aktüatör kullanın. Bu, kare hızı pahasına veri verimini artıracaktır. Piezo aktüatörü kontrol etmek için hızlı Z ekseni taramasını etkinleştirin (tek tip mod, dilim sayısı = 6, adım boyutu = 15 μm, dalga formu = testere dişi, geri dönüş süresi = 4 ms, aktüatör gecikmesi = 8 ms).</li>
	<li>Davranış kaydı için, tankın her iki tarafındaki 810 nm kızılötesi (IR) ışıkları açın. Kamerada net bir şekilde görülebilmesi gereken tüm gövdeyi aydınlatmak için açıyı ayarlayın.</li>
	<li>Projektörleri açın.</li>
	<li>Verileri kaydetmeye başlayın.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65526/65526fig3v2.jpg"> Şekil 3: Kalsiyum görüntüleme, davranış kaydı ve görsel uyaran gösterimi gerçekleştirmek için kurulum . (A) Üç projektör, yarı altıgen tankın duvarlarına görsel bir uyaran sunar. Zebra balığının vücudunu aydınlatmak için yan taraftaki IR ışıkları kullanılır. (B) Objektif merceğin konumlandırılması. Sol: önden görünüm. Sağ: yandan görünüm. 16x objektif mercek ile hedeflenen beyin bölgesi arasındaki mesafe yaklaşık 2,5 mm'dir. (C) Örnek iki fotonlu görüntü. Solda: Tg[neuroD:GCaMP6f] cinsinden tüm dorsal ön beynin maksimum projeksiyonu. Sağda: birden fazla beyin bölgesindeki nöronları ortaya çıkarmak için yakınlaştırılmış görüntü. İçindekiler: farklı bir beyin bölgesinden daha yüksek bir büyütme. Görüntüler, 5 Hz'de kaydedilen 10 saniyelik verinin ortalamasıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65526/65526fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Zebra Balığı Ön Beyininde Davranış İzleme ve Nöral Aktivite Örüntüsü

<ol>
	<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Chow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+three-photon+imaging+of+the+brain+in+intact+adult+zebrafish.">Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).</li><li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo.">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li><li>Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+neuroscience+in+zebrafish.">Circuit neuroscience in zebrafish.</a> Current Biology. 20 (8), R371-R381 (2010).</li><li>Kappel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+recognition+of+social+signals+by+a+tectothalamic+neural+circuit.">Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit.</a> Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).</li><li>Bartoszek, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ongoing+habenular+activity+is+driven+by+forebrain+networks+and+modulated+by+olfactory+stimuli.">Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli.</a> Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).</li><li>Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+classical+and+operant+learning+behaviors+in+zebrafish.">Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish.</a> Learning &amp; Memory. 19 (4), 170-177 (2012).</li><li>Buske, C., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+shoaling+behavior+is+accompanied+by+changes+in+the+dopaminergic+and+serotoninergic+systems+in+zebrafish.">Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish.</a> Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).</li><li>Huang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virtual+reality+system+to+analyze+neural+activity+and+behavior+in+adult+zebrafish.">A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).</li><li>Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+z-scanning+with+a+macroscopic+voice+coil+motor+for+fast+3D+multiphoton+laser+scanning+microscopy.">Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).</li><li>Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -. S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scattering+compensation+by+focus+scanning+holographic+aberration+probing+(F-SHARP).">Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP).</a> Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).</li><li>Torigoe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+capable+of+generating+future+state+prediction+error+show+improved+active+avoidance+behavior+in+virtual+reality.">Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality.</a> Nature Communications. 12 (1), 5712 (2021).</li></ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Burada, iki fotonlu kalsiyum görüntüleme için yetişkin zebra balığının kafasını dizginlemek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Lazer tarama görüntüleme için yeterince stabil bir koltuk başlığı elde etmek için iki kritik adım vardır. İlk olarak, kafa çubuğu kafataslarının belirli bağlantı yerlerine yapıştırılmalıdır. Kafatasının diğer kısımları genellikle mekanik stabilite sağlamak için çok incedir ve hatta güçlü vücut hareketleri sırasında kırılabilir. İki...

Genetik olarak kodlanmış göstergeler veya sentetik boyalarla kalsiyum floresan görüntüleme, insan olmayan primatlar, kemirgenler, kuşlar ve böcekler dahil olmak üzere davranan hayvanlarda nöronal aktiviteyi ölçmek için güçlü bir yöntem olmuştur1. Beyin yüzeyinin yaklaşık 800 μm altına kadar yüzlerce hücrenin aktivitesi, çoklu foton görüntüleme 2,3 kullanılarak aynı anda ölçülebilir. Spesifik hücre tiplerinin aktivitesi, genetik olarak tanımlanmış nöronal popülasyonlarda kalsiyum göstergelerinin eksprese edilmesiyle de ölçülebilir. Küçük omurgalı modelleri için görüntüleme yönteminin uygulanması, beyin bölgeleri arasında nöronal hesaplama alanında yeni olanaklar sunmaktadır.
Zebra balığı, sinirbilim araştırmalarında yaygın olarak kullanılan bir model sistemdir. Döllenmeden yaklaşık 6 gün sonra larva zebra balıkları, minyatür beyinleri ve şeffaf gövdeleri nedeniyle kalsiyum görüntüleme için kullanılmıştır4. Yavru zebra balığı (3-4 haftalık) ayrıca sensorimotor yolların altında yatan nöral mekanizmaları incelemek için kullanılır 5,6. Bununla birlikte, ilişkisel öğrenme ve sosyal davranışlar da dahil olmak üzere karmaşık davranışlar için maksimum performans düzeyinedaha büyük yaşta ulaşılır 7,8. Bu nedenle, görüntüleme yöntemlerini kullanarak yetişkin zebra balıklarının beyinlerindeki çoklu bilişsel işlevleri incelemek için güvenilir bir protokol gereklidir. Zebra balığı larvaları ve yavru zebra balıkları in vivo görüntüleme için agaroza gömülebilirken, 2 aylık veya daha büyük yetişkin zebra balıkları bu tür koşullarda hipoksiden muzdariptir ve fiziksel olarak agaroz tarafından sınırlandırılamayacak kadar güçlüdür. Bu nedenle, beyni stabilize etmek ve hayvanın solungaçlardan serbestçe nefes almasını sağlamak için cerrahi bir prosedür gereklidir.
Burada, tek bir baş çubuğunun yeni bir tasarımını içeren bir koltuk başlığı protokolünü açıklıyoruz. 25 dakikalık kısaltılmış ameliyat süresi, önceki yönteme göre iki kat daha hızlıdır9. Ayrıca kayıt odasının (yarı altıgen tank), kafa aşamasının ve iki parçayı birleştirmek için hızlı kilitleme mekanizmasının tasarımını da açıklıyoruz9. Son olarak, görsel olarak tetiklenen beyin aktivitesini ve davranışlarını incelemek için sürükleyici bir görsel uyaran sunma kurulumu da açıklanmaktadır. Genel olarak, burada açıklanan prosedürler, kafası kısıtlanmış yetişkin bir zebra balığında genetik olarak tanımlanmış hücre popülasyonlarında iki fotonlu kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için kullanılabilir ve çeşitli davranışsal paradigmalar sırasında beyin aktivitelerinin araştırılmasını sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquisition card</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>Vidrio vDAQ</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Back-projection film</td>
			<td>Kimoto</td>
			<td>Diland screen - GSK</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter (510/80 nm)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/80m</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base plate for the semi-hexagonal tank</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera filter (&#60;875 nm)</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>#86-106</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera filter (&#62;700 nm)</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>#43-949</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MVL50M23</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision-S</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Vision-S</td>
			<td>Laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular plate for the head stage</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller for piezo actuator</td>
			<td>Physik Instrumente&#160;</td>
			<td>E-665. CR</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current amplifier</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TIA60</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elitedent Q-6</td>
			<td>Rolence Enterprise</td>
			<td>Q-6</td>
			<td>Surgery: UV lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter 510/80 nm</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/80m</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head bar</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared light</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M810L3</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED projector</td>
			<td>AAXA</td>
			<td>P2B LED Pico Projector</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moist paper tissue (Kimwipe)</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>Surgery: moist paper tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized XY sample stage</td>
			<td>Zaber</td>
			<td>X-LRM050</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Density Filters (50% Transmission)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>NE203B</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;1/2&#34; Post Holder</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PH1.5V</td>
			<td>Surgery: hollow tube for cannon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;1/2&#34; Stainless Steel Optical Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>TR150/M</td>
			<td>Surgery: fish loading module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens 16x, 0.8NA</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CF175</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil-based modeling clay</td>
			<td>Ly Hsin Clay</td>
			<td>C4086</td>
			<td>Surgery: head bar holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical adhesive</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA68</td>
			<td>Surgery: UV curable glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H11706P-40</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo actuator</td>
			<td>Physik Instrumente&#160;</td>
			<td>P-725.4CA PIFOC</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pockels Cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>M350-80-LA-BK-02</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Wratten filter (&#62; 600 nm)</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>#53-699</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resonant-Galvo Scan System</td>
			<td>INSS</td>
			<td>RGE-02</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-Angle Clamp for &#216;1/2&#34; Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td>Surgery: fish loading module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Clamp for &#216;1/2&#34; Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SWC/M</td>
			<td>Surgery: fish loading module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>Basic version</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-hexagonal tank</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super-Bond C&#38;B Kit</td>
			<td>Sun Medical Co.</td>
			<td>Super-Bond C&#38;B</td>
			<td>Surgery: dental cement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Surgery: anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>BFS-U3-13Y3M-C</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>Surgery: tissue glue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon calcium imaging of forebrain activity in behaving adult zebrafish

Yetişkin zebra balığı (Danio rerio) bilişsel işlevleri incelemek için zengin bir davranış repertuarı sergiler. Ayrıca, optik görüntüleme yöntemleriyle beyin bölgelerindeki aktiviteleri ölçmek için kullanılabilecek minyatür bir beyne sahiptirler. Bununla birlikte, yetişkin zebra balıklarında beyin aktivitesinin kaydedilmesine ilişkin raporlar azdır. Bu çalışma, yetişkin zebra balıklarının dorsal ön beyninde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme gerçekleştirme prosedürlerini açıklamaktadır. Yetişkin zebra balıklarının başlarını hareket ettirmesini engellemeye yönelik adımlara odaklanıyoruz, bu da beyin aktivitesinin lazerle taranarak görüntülenmesini sağlayan stabilite sağlıyor. Kafası kısıtlanmış hayvanlar, vücut kısımlarını serbestçe hareket ettirebilir ve yardım almadan nefes alabilir. Prosedür, baş desteği ameliyatının süresini kısaltmayı, beyin hareketini en aza indirmeyi ve kaydedilen nöron sayısını en üst düzeye çıkarmayı amaçlamaktadır. Kalsiyum görüntüleme sırasında sürükleyici bir görsel ortam sunmak için bir kurulum da burada açıklanmıştır ve bu, görsel olarak tetiklenen davranışların altında yatan nöral bağıntıları incelemek için kullanılabilir.

Calcium fluorescence imaging with genetically encoded indicators or synthetic dyes has been a powerful method of measuring neuronal activity in behaving animals, including non-human primates, rodents, birds, and insects1. The activity of hundreds of cells, up to approximately 800 &#181;m below the brain surface, can be measured simultaneously using multi-photon imaging2,3. The activity of specific cell types can also be measured by expressing calcium indicators in genetically defined neuronal populations. Application of the imaging method for small vertebrate models opens up new possibilities in the field of neuronal computation across brain regions.
Zebrafish are a widely used model system in neuroscience research. Larval zebrafish at around 6 days post-fertilization have been used for calcium imaging due to their miniature brain and transparent body4. Juvenile zebrafish (3-4 weeks old) are also used for studying the neural mechanisms underlying sensorimotor pathways5,6. However, the maximal performance level for complex behaviors, including associative learning and social behaviors, is reached at an older age7,8. Thus, a reliable protocol is required to study multiple cognitive functions in the brains of adult zebrafish using imaging methods. While zebrafish larva and juvenile zebrafish can be embedded in agarose for in vivo imaging, adult zebrafish at 2 months or older suffer from hypoxia in such conditions and are physically too strong to be restrained by agarose. Therefore, a surgical procedure is required to stabilize the brain and enable the animal to breathe freely through the gills. 
Here, we describe a head restraint protocol that involves a novel design of a single head bar. The reduced surgery time of 25 min is twice as fast as the previous method9. We also describe the design of the recording chamber (semi-hexagonal tank), the head stage and a quick-lock mechanism to combine the two parts9. Finally, the setup to present an immersive visual stimulus to study visually triggered brain activity and behaviors is also described. Overall, the procedures described here can be used to perform two-photon calcium imaging in genetically defined cell populations in a head-restrained adult zebrafish, enabling the investigation of brain activities during various behavioral paradigms.

Yazar Spotlight: Yetişkin Zebra Balığı Beyin Araştırmalarındaki Gelişmeler 

Davranan Yetişkin Zebra Balıklarında Ön Beyin Aktivitesinin İki Fotonlu Kalsiyum Görüntülemesi

The fish fore-brain hosts areas suspected to be homologous to mammalian brain regions involved in complex behavior. These include the hippocampus, the cortex, and the amygdala. We are currently trying to understand the effect of sensory information on the activity of these brain regions.Current research in zebra fish neuroscience uses two photon calcium imaging of immobilized larvae. Combined with virtual reality based behavior essays, to study sensory motor processing in the brain. Most research on the zebra fish brain is done on larvae, however some complex behaviors in fish do not fully develop until adulthood.Our protocol allows the study of brain activity in the adult during behavior. This protocol reduced surgery times by fifty percent compared to the previous method. It's a more efficient approach for restraining the head of adult zebra fish for a better image.This head restraint protocol opened an opportunity to perform an in vivo experiment on the adult zebra fish brain. In addition to the two-photon calcium image, head restraint potentially allows the opto-genetic manipulation, electro-physiology, and even ultra-sound imaging of live fish.

Protokol iki bölümden oluşur: baş desteği cerrahisi ve ön beyindeki nöronal aktivitelerin iki fotonlu kalsiyum görüntülemesi. Ameliyatın başarısı, hayvanın hayatta kalması ve baş desteğinin stabilitesi ile tanımlanır. Hayatta kalma oranı, ameliyat sırasında ağızdan% 0.01 TMS çözeltisinin sık sık perfüzyonu ile büyük ölçüde iyileştirilebilir. Balıklar anesteziden kurtulmalı ve akvaryum suyuna daldırıldıktan sonra 1-2 dakika içinde aktif olarak nefes almalıdır. İki fotonlu kalsi...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Adult Zebrafish Brain Research at JoVE.com

Burada, yetişkin zebra balıklarının dorsal ön beyninde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme yapmak için bir protokol sunuyoruz.

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used ...

Balıkların ön beyni, karmaşık davranışlarda yer alan memeli beyin bölgelerine homolog olduğundan şüphelenilen alanlara ev sahipliği yapar. Bunlar hipokampus, korteks ve amigdalayı içerir. Şu anda duyusal bilginin bu beyin bölgelerinin aktivitesi üzerindeki etkisini anlamaya çalışıyoruz.Zebra balığı sinirbilimindeki güncel araştırmalar, hareketsizleştirilmiş larvaların iki foton kalsiyum görüntülemesini kullanır. Beyindeki duyusal motor işlemeyi incelemek için sanal gerçeklik tabanlı davranış denemeleri ile birleştirilmiştir. Zebra balığı beyni üzerine yapılan araştırmaların çoğu larvalar üzerinde yapılır, ancak balıklardaki bazı karmaşık davranışlar yetişkinliğe kadar tam olarak gelişmez.Protokolümüz, davranış sırasında yetişkinlerde beyin aktivitesinin incelenmesine izin verir. Bu protokol önceki yönteme göre ameliyat sürelerini yüzde elli oranında azalttı. Daha iyi bir görüntü için yetişkin zebra balıklarının kafasını dizginlemek daha etkili bir yaklaşımdır.Bu baş desteği protokolü, yetişkin zebra balığı beyni üzerinde in vivo bir deney yapma fırsatı açtı. İki fotonlu kalsiyum görüntüsüne ek olarak, baş desteği potansiyel olarak opto-genetik manipülasyona, elektro-fizyolojiye ve hatta canlı balıkların ultra ses görüntülemesine izin verir.

two-photon-calcium-imaging-forebrain-activity-behaving-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish

1.5K Görüntüleme.  Academia Sinica. Balıkların ön beyni, karmaşık davranışlarda yer alan memeli beyin bölgelerine homolog olduğundan şüphelenilen alanlara ev sahipliği yapar. Bunlar hipokampus, korteks ve amigdalayı içerir. Şu anda duyusal bilginin bu beyin bölgelerinin aktivitesi üzerindeki etkisini anlamaya çalışıyoruz.Zebra balığı sinirbilimindeki güncel araştırmalar, hareketsizleştirilmiş larvaların iki foton kalsiyum görüntülemesini kullanır. Beyindeki duyusal motor işlemeyi incele...

Video: Yazar Spotlight: Yetişkin Zebra Balığı Beyin Araştırmalarındaki Gelişmeler 

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used for measuring activities across brain regions through optical imaging methods. However, reports on the recording of brain activity in behaving adult zebrafish have been scarce. The present study describes procedures to perform two-photon calcium imaging in the dorsal forebrain of adult zebrafish. We focus on steps to restrain adult zebrafish from moving their heads, which provides stability that enables laser scanning imaging of the brain activity. The head-restrained animals can freely move their body parts and breathe without aids. The procedure aims to shorten the time of head restraint surgery, minimize brain motion, and maximize the number of neurons recorded. A setup for presenting an immersive visual environment during calcium imaging is also described here, which can be used to study neural correlates underlying visually triggered behaviors.

Here, we present a protocol to perform two-photon calcium imaging in the dorsal forebrain of adult zebrafish.

Nörobilim

Preparation of Recording Chamber for Zebrafish Imaging

To begin, prepare a semi-hexagonal tank, a base plate, and a head stage. Place the semi-hexagonal tank on the experimental platform of the microscope. Aim the 810 nanometer infrared light and the camera to the head stage for behavioral recording.Then, set up an 875 nanometer short-pass filter, and a 700 nanometer long-pass filter in front of the camera to prevent the two-photon laser and the visual stimulus from interfering with behavioral recording. To present the visual stimulus, attach back projection films to the inner side of the three walls of the semi-hexagonal tank. Aim the three projectors at the three surfaces of the tank.

Zebra Balığı Görüntüleme için Kayıt Odasının Hazırlanması

Head-Fixation Surgery in Zebrafish

To prepare an omega-shaped head bar for the zebrafish head restraint, attach a piece of oil-based modeling clay to a three-axis micro manipulator. Then insert an arm of the head bar into the clay and orient the head bar horizontally. Prepare the cannon for holding the fish's body in place during surgery.To remove excess skin and water from the skull's attachment sites, prepare four tissue swabs by cutting a paper towel into a three centimeter square. Then fold the paper squares along their diagonal to produce a tube-like structure and twist the ends of the tube into a fine point. After anesthetizing the fish with 0.03%TMS, perform syringe perfusion with 0.01%TMS to maintain sedation throughout the procedure.Wrap the fish in moist paper tissue starting from the tip of the tail to around one millimeter caudal to the gill. Then wrap a soft plastic tubing with a longitudinal slit around the paper tissue covering the fish from the end of the tail to around two millimeter caudal to the gill. Wrap the paper towel around the tubing.Then wrap a soft plastic tube cut from the bulb of a plastic transfer pipette around the paper towel. Load the wrapped fish into the cannon. Next, using a scalpel, remove the skin covering the attachment sites, two triangular areas of the skull rostrolateral to the cerebellum and above the gills.Then use tissue swabs to dry the attachment sites and clear any remaining skin. Using a 10 microliter pipette tip, apply a drop of tissue glue at the center of each attachment site. Place the fish body in an upright position and position the head bar slightly above and caudal to the attachment sites.Next, prepare dental cement by mixing one small spoon of polymer with four drops of quick monomer and one drop of catalyst five. Stir the mixture evenly for 15 seconds. Immediately after mixing, use a micropipette and a 10 microliter pipette tip to apply the cement onto the attachment sites and the region between the sites.Then using a micro manipulator, gently press the head bar onto the cement. Cover the head bar with the remaining cement and wait for 12 minutes to allow the curing of the cement. Next, to improve optical access to the forebrain for calcium imaging, use a scalpel to remove the skin above the telencephalon.After curing, remove the clay from the head bar. Next, prepare a fish loading module for the micro manipulator. Then transfer the entire capsule from the cannon to the pitch adjuster in the fish loading module.Using the micro manipulator, position the fish with the head bar placed on top of the metal posts of the head stage. Slightly increase the pitch angle of the fish. Apply ultraviolet curable glue to secure the head bar to the metal posts.Then pull out the fish from the capsule and lock the head stage onto the base plate within the semi hexagonal tank. After surgery, immerse the animal in fish tank water to recover from anesthesia.

Zebra Balıklarında Kafa Fiksasyon Cerrahisi

Two-Photon Imaging of Zebrafish Forebrain 

Turn on the laser and wait for 30 minutes for the power to stabilize. Set the wavelength to 920 nanometers and power to approximately 50 milliwatts at the sample. Place the recording chamber with the head-restrained zebrafish on the experimental platform.Position the objective lens close to the forebrain surface. For behavior recording, turn on the 810 nanometer infrared lights on both sides of the tank. Select the input source for VR display and start recording data.Then, open the laser shutter and enable the photo multiplier tube. Gradually elevate the objective lens until the dorsal forebrain is revealed. Use a piezo actuator to acquire images at multiple depths to increase the number of neurons recorded.Two photon calcium imaging records individual neuron activity in the dorsal forebrain up to 200 microns deep through intact skulls. The imaging range includes the paleo areas, Dm, cDc, rDc, and part of the Dl covering 30%of the adult zebrafish forebrain. Simultaneous behavioral recording performed during brain imaging enables the identification of neuronal correlates of motor outputs.During imaging, tail movements should not cause visible motion artifacts.