Biz zaman atlamalı görüntüleme için montaj tavsiye lokal doku hasarı, Kathy Joubin ve tartışmalar için Sagasti ve Portera-Cailliau laboratuvarları oluşturmak için bir iki foton mikroskop kullanarak ilk tavsiye Mark Terasaki teşekkür ederim. İlk deneyler, AS, MA Woods Hole Deniz Biyolojik Laboratuarlarında Çim Vakfı Üyesi olarak yapıldı. Whitehall Vakfı, Klingenstein Vakfı ve Biyolojik Bilimler Burroughs Wellcome Fonu Kariyer Ödülü hibe Sagasti laboratuarında çalışmalar desteklendi.

Bölüm 1: uzun vadeli görüntüleme Montaj zebrafish embriyolar <ol><li> Gömmek için% 1 düşük erime agaroz çözeltisi hazırlayın. Agaroz DI su ısıtma ile mikrodalga, küçük tüpler ve 42 santigrat derece bir ısıtma bloğu mağaza içine kısım çözülür. </li><li> Görüntüleme için embriyo seçin ve forseps ile yavaşça dışında koryon çekerek chorions kaldırmak. Embriyolar pigment oluşumunu engellediğini, 22-24 saat sonra döllenme (hpf)% 5 PTU Ringers çözüm içine yerleştirilebilir. Bu görüntü netliği artırır ve duyusal akson iki foton axotomies gerçekleştirmek için çok önemlidir. Doğal pigment formu izin verilirse, otoflöresans iki foton mikroskop aksonlar gizler. Çözüm zebrafish için 116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.8 mM CaCl 2, ve 5mM Hepes, pH 7,2 zilleri. </li><li> PTU Ringers ~ 0.02% tricaine ekleyerek embriyolar anestezisi. Emin hayvanların devam etmeden önce dokunmaya duyarlı olun. </li><li> Uzun vadeli, bir tarafı cam veya teflon halka vakum gres yağı uygulayarak ve cam kapak slip üzerine sabitleme görüntüleme odasının hazırlayın. </li><li> PTU Ringers aktarmak için özen, damlalıklı cam ile 42 derece agaroz çözüm, tek bir embriyo transfer, sonra hazırlanmış bir kapak kayma üzerine bir damla agaroz embriyo transferi. </li><li> Embriyo agaroz sertleşir olarak istediğiniz gibi yerleştirin. İşiniz bittiğinde görüntüleme odasının kapak kayma üst yüzeyinde olacak şekilde döndürülebiliyorlar, olacağını aklınızda bulundurun. </li><li> Motorlu bir sahne var ve görüntü tek seferde birden fazla yerde, her bir embriyo için 1,4-1,6 adımları tekrarlayın. </li><li> Agaroz tamamen katılaşmasını sağlayın, sonra% 0,02 tricaine PTU Ringers halka doldurun. </li><li> Sonra, bir bardak slayt halka (lar) kapağı halka (lar) diğer tarafında vakum gres yağı uygulayın. Üzerinde mühürlü odası (ler) çevirin. Bu odaların, dik ya da ters mikroskoplar görüntüleme için kullanılabilir. </li></ol> Bölüm 2: Chameleon Ti-Safir lazer ile özel bir inşa edilen iki foton mikroskop kullanan iki foton axotomy <ol><li> Görüntüleme için hazırlayın. Mikroskop altında bir slayt tutucuya monte embriyo (lar) yerleştirin. 40X (0.8 NA) su amacı ile tek embriyo odaklanın. Lazer açın. Biz tekrarlanabilir görselleştirmek ve aşağıdaki parametreleri kullanarak nöronlar ifade GFP zarar başardık. Aksonlar görselleştirmek için zararlı olmayan bir güç, 910 nanometre dalga boyu (nm) ve 30 bir güç (mW listelenen örnek güç miktarı) miliwatt lazer ayarlayın. Görüntüleme yazılımı açın. Karel Svoboda laboratuarı 2, 3 geliştirilen ScanImage Yazılım kullanın. </li><li> Iki foton lazer ile embriyo tarama odağı basın axotomize isteyen akson bulun ve bu akson bir görüntü yakalamak. Ilk ve son Z konumlarının Mark, görüntü elde Z yığınlarının maksimum projeksiyon yapmak. </li><li> Tarama axotomize ve durdurmak için istediğiniz akson şube 70X zoom. Örnek mW, 180 mW zararlı güç artırın ve lazer ile tek bir tarama gerçekleştirebilirsiniz. Biz 1 Z dilim sayısını ayarlama ve &quot;tut&quot; tuşuna basarak bunu. Bu akson koparmak için yeterli olmalıdır. Mikroskop ve deneysel amaç için bu yordamı optimize yöntemleri tartışma bakın. </li><li> Uzaklaştır 30 mW güç azaltmak ve bir görüntü almak. </li></ol> Bölüm 3: İki foton axotomy Zeiss 510 konfokal / iki foton mikroskop <ol><li> Yeri sahneye embriyo monte edilmiş ve 25X su hedefi veya başka uygun bir amacı kullanarak odak noktası haline getirmek. </li><li> Birinden diğerine geçiş yapmak mümkün, böylece iki foton (910 nm) ve multi-track bir ortamda Argon (488 nm) lazerler açın. Her iki lazerler GFP tespit etmek için kullanılsa da, iki-foton emisyon kırmızı ile görüntülendi ve yeşil argon lazer emisyon ikisini ayırt etmek için. </li><li> Argon lazer zarar bir akson tanımlamak için kullanın. Z altında ayarları, ilk ve son optik bölümleri işaretleyin. Konfokal bir görüntü çekmek ve maksimum projeksiyon Z yığını oluşturmak. </li><li> Yaralı akson bölge seçin ve bu bölgede odak noktası haline getirmek. Argon lazer kapatın ve iki foton lazer açın. ~ 9% iletim akson odak hala emin olmak için bir lazer yoğunlukta iki foton örnek tarayın. </li><li> Kırpma aracını satışa sunulacak, böylece &quot;dur&quot; düğmesine tıklayın. Ilgi alanı yakınlaştırmak için kırpma kullanın. Genellikle ~ 70X (zoom &quot;mode&quot; sekmesi altında kontrol edilebilir) yakınlaştırma. &quot;Kanallar&quot; sekmesi altında iki-foton ~% 15-20 iletim% 9 iletim yoğunluğunu değiştirebilirsiniz. </li><li> Bir akson sever, fazla zarar vermemek için stop düğmesine basın ve sonra yaklaşık 1 saniye ve için &quot;hızlı XY&quot; düğmesini etkinleştirin. Prosedür çalıştı akson dağılmış enkaz olarak görülmelidir. </li><li> Emin olmak için akson488 nm argon lazer dönmek hasar gördü, bir başka konfokal görüntü çekmek ve maksimum projeksiyon oluşturmak. </li></ol> Bölüm 4: Zeiss LSM 510 Konfokal zaman atlamalı görüntüleme <ol><li> Görüntüleme için hazırlayın. Isıtılmış bir aşamada kullanıyorsanız, o zaman-lapse kurmadan önce en az 30 dakika açmak için emin olun. Mikroskop altında bir slayt tutucuya monte embriyo (lar) yerleştirin. İstenen hava amacı ile, tek bir embriyo odaklanın. Biz 20X, 0.5 NA objektif kullanın. Açık Zeiss LSM 510 görüntüleme yazılımı. Uygun lazerler açın ve istenen yapılandırma kurmak. Biz şimdi Zeiss LSM Çok Zaman yazılımı ile uzun vadeli görüntüleme için ayrıntılı bir protokol anlatacağız. Bu yöntemler, görüntüleme yazılımı ile kendi mikroskop kullanım için adapte edilebilir. </li><li> Çok Zaman penceresinde ilk embriyonun konumu ve yapılandırma tanımlayın. Tarama, sahne ve Çok Zaman pencereleri açın. Hızlı tarama penceresi tarama etkinleştirin. Aşamasında istenen XY konumunu taşıyın. Tarama penceresi ilk ve son Z konumlarının işaretleyin. Ayrıca tarama penceresinde, sonra Orta stop basın. Orta Z dilim bitirmek için tarama için bekleyin, sonra sahne pencere işareti konumunu basın. Tek bir embriyo tek görüntüleme Çok Zaman penceresinde, &quot;Tek Yer&quot; sekmesini tıklatın. &quot;Değiştir XYZ&quot; üzerine tıklayın ve ardından &quot;Yapılandırma Kaydet&quot;. Önceki yapılandırmaya üzerine sorulduğunda kabul etmiş sayılırsınız. 4.4 adıma geçin. Mekanize bir sahne varsa, görüntü çoklu embriyo birden fazla yerde ayarlayabilirsiniz. Bu durumda, ilk konum için XYZ ve yapılandırma tanımlamadan önce &quot;Birden fazla yerler&quot; sekmesini seçmelisiniz. Ayrıca, &quot;Çoklu Yerler&quot; sekmesi altında açılan menüden konumu 1 açık olduğundan emin olun ve size yapılandırmayı kaydetmek tıklatmadan önce yapılandırma bölümünde açılan menüden, loc 1 adet çok diyor. </li><li> Çok Zaman pencerede kalan embriyoların konumu ve yapılandırma tanımlayın. Sonraki embriyo bulun, daha sonra, hızlı tarama basın sahneye taşımak istediği XY pozisyonu, ve tarama penceresinde ilk ve son Z konumlarının işaretleyin. Ayrıca tarama penceresinde, sonra Orta stop basın. Orta Z dilim bitirmek için tarama için bekleyin, sonra sahne pencere işareti konumunu basın. &quot;Değiştir XYZ&quot; üzerine tıklayın. &quot;Yapılandırma Kaydet&quot; seçeneğini tıklatın, yapılandırma bölümünde açılan menüden çok loc 2 diyor ki, &quot;Birden fazla yerler&quot; sekmesi altında açılan menüden yeri 2 olduğunu kontrol edin ve. Önceki yapılandırmaya üzerine sorulduğunda kabul etmiş sayılırsınız. Kalan embriyolar için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Çok Loc penceresinde görüntü elde etmek için parametreleri ayarlayın. &quot;Blok Listesi&quot; bölümünde GR-GL seçeneğini seçin, daha sonra grup tekrarlar istediğiniz numarayı girin. Bu konfokal her yerde bir görüntü elde kaç kez. Parametreler bölümünde istenilen bekleme aralığı girin. Bu, başından itibaren bir görüntü tekrarı sonraki tekrarı başlangıç ​​zaman miktarıdır. Yapılandırma bölümü &quot;ZStackXY&quot; i seçin. Alt bölümünde temel dosya adı girin. &quot;Resim Seç DB&quot; tıklayın ve seçim sizin mdb. &quot;Seçenekler&quot; butonuna tıklayın. Geçici dosyaları kaydetmek için mdb klasörü seçin. Son görüntüyü kaydetmek &quot;ve&quot; z yığınının ortasında &quot;,&quot; son görüntüyü açık tutmak &quot;seçeneğini işaretleyin. Aralığı bekleyin seçin. Seçenekler penceresini kapatmak için Tamam tıklayın. &quot;Başlangıç ​​zamanı&quot; üzerine tıklayın. Çok Zaman pencere görüntüleme süresi boyunca açık bırakın. </li><li> Verileri analiz. Zaman atlamalı görüntüleme tamamlandığında, Çok Zaman yazılımı tüm geçici dosyaları her konum için bir özet dosyası içine derlenir. Tamamlanmadan önce filmi durdurmak istiyorsanız, emin olun, bu yüzden bir özet dosyası oluşturulur olacağını &quot;Dur&quot; yerine &quot;Finish&quot; tuşuna basın. Geçici dosyaları ve özet dosyaları otomatik olarak belirlenen mdb klasöre kaydedilmesi gerekir. LSM yazılım menüsünden, &quot;Projektör&quot;, sonra &quot;3D View&quot; üzerine tıklayın. Özet dosyası ile açılan menüden seçilen, &quot;Uygula&quot; yı tıklayın. Bu her konfokal görüntü için Z yığını maksimum projeksiyonları üretecektir. LSM yazılım menüsü, ardından &quot;İhracat&quot;, &quot;Dosya&quot; tıklayın. Tif dosyaları bir dizi olarak maksimum projeksiyonları kaydedin. Daha sonra dizi ImageJ veya QuickTime Pro kullanarak tif dosyaları dışında bir film yaratabilir. LSM görüntüler Aksonlar akson morfolojisi hakkında ayrıntılı kantitatif bilgiler üretmek için görüntü analiz yazılımı (örneğin NeuroLucida MicroBrightfield gelen) kullanarak üç boyutlu olarak takip edilebilir. </li></ol> Bölüm 5: Temsilci sonuçları Başarılı bir deney hücresel dinamik doğru bir temsili neden olacaktırakson kurtarma yaralanma. Embriyolar görünür dejenerasyon ve güçlü bir kalp atışı, görüntüleme sonra sağlıklı olacaktır. Axotomy sadece akson tanımlanan şube kesilmesinin, kesin hasar görmesine neden olacaktır. Akson ve minimal hücre ölümünü çevreleyen herhangi bir yaralanma olmamalıdır. Biz doğrudan deneylerin ~% 50 axotomy site üzerinden tek bir epidermal hücre ölümü görmek inanıyoruz. Daha fazla zarar gözlemlemek tartışma açıklandığı gibi, iki-foton protokol optimize gerekir.

<ol>
	<li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors.">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons.">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li><li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li><li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery.">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li></ol>

Biz tam periferik duyusal aksonlar axotomize ve oturma zebrafish embriyo rejenerasyon doğrudan gözlemlemek için açıklanan yöntemleri kullanmışlardır. Zebrafish Uzun vadeli zaman atlamalı konfokal görüntüleme in vivo birçok gelişimsel süreçlerini gözlemlemek için kullanılabilir. Açıklanan iki foton axotomy prosedürü, pek çok farklı deneysel amaçları için değiştirilebilir. Biz hücre gövdesi ziyade periferik akson bir şube yakınlaştırma, tüm trigeminal duyusal nöron hücre g?...

two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebra balığı uzun zaman atlamalı görüntüleme ile yaşayan şeffaf embriyonun gelişim hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. Burada uzun vadeli görüntüleme için zebrafish embriyolar montaj ve konfokal bir mikroskop kullanılarak zaman atlamalı görüntüleri yakalama otomatikleştirmek için nasıl göstermek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz de iki foton mikroskop üzerine monte edilmiş bir femtosaniye lazer odaklı güç kullanarak zebrafish periferik duyusal aksonlar bireysel şube kontrollü, kesin hasar oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Başarılı iki foton axotomy için parametreler her mikroskop için optimize edilmiş olmalıdır. Biz iki örnek sağlamak için özel inşa edilen iki foton mikroskop ve Zeiss 510 konfokal / iki-foton hem de iki foton axotomy gösterecektir. Zebra balığı trigeminal duyusal nöronlar bir duyusal nöron spesifik 1 organizatörü tarafından yönlendirilen bir transgenik hattı ifade GFP görüntülenebilir. Biz doğrudan doğruya zebrafish embriyolar yaşayan duyusal akson rejenerasyonu gözlemlemek için bu zebrafish trigeminal model adapte var. Embriyolar tricaine ile anestezi ve agaroz bir damla içinde katılaşır olarak konumlandırılmış. İmmobilize embriyolar phenylthiourea (PTU) Zil sesleri ile dolu bir görüntüleme odası içinde mühürlenir. Embriyoların 12-48 saat boyunca sürekli bu odaları görüntülü olduğunu bulduk. Sonra tek bir konfokal görüntü axotomy istenen site belirlemek için yakalanır. Ilgi bölge görüntüleme, düşük, zararlı olmayan güç altında duyusal aksonlar tarafından iki foton mikroskop yer almaktadır. Axotomy istenen sitesinde yakınlaştırma sonra, gücü artar ve tanımlanan bölgenin tek bir tarama akson koparmaya yeterli olur. Çoklu konumu zaman atlamalı görüntüleme sonra yaralanma aksonal kurtarma doğrudan gözlemlemek için bir konfokal mikroskop kurulur.

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos at JoVE.com

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Burada, uzun vadeli görüntüleme, iki foton görüntüleme ve doku hasarı teknikleri ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme zebrafish embriyolar montaj için bir yöntem açıklanmaktadır.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

two-photon-axotomy-time-lapse-confocal-imaging-live-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Görüntüleme.  University of California, Los Angeles. Burada, uzun vadeli görüntüleme, iki foton görüntüleme ve doku hasarı teknikleri ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme zebrafish embriyolar montaj için bir yöntem açıklanmaktadır.

Video: Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biyoloji

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Transplantasyon GFP of-Kimerik Zebra balığı Embriyolar Retina ve Beyin Gelişimi Canlı Görüntüleme blastomer ifade

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

In Oksijen yetersizliği kaynaklı Asma Animasyon Visualize&#39;a Time Lapse Mikroskopi kullanın<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyolar

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...