Bu eser Ulusal Sağlık hibe RO1 AI067979 NWA Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. YK Lisans Bursu dan Howard Hughes tıp Enstitüsü/üniversite Maryland College Park, alıcı olduğunu.

Tüm deneysel yordamlar bakım ve laboratuvar hayvanları Kullanım Kılavuzu'nda bulunan öneriler doğrultusunda Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yapılmıştır ve University of Maryland'ın IACUC tarafından kabul edildi. 1-4 arası bölümlerde açıklanan tüm adımları aseptik biyolojik Laminer akış kabinleri içinde yapılmalıdır. Kişisel koruma kullanılması gerektiğini ve her deneme aşaması boyunca canlı LEISHMANIA parazitler işlenmesi sırasında dikkat edilmelidir.
1. izolasyon ve kemik iliği türevi makrofajlar (BMMs)8,30,31 farklılaşma
<ol><li>
Gün 0: 4 - 6-hafta-yaşlı kadın C57BL/6 veya BALB/c fare CO2 odasında kurban ve ölüm servikal yerinden çıkması ile onaylayın. Sterilizasyon makas ve forseps onları % 70 etanol batırılmış tutarak emin olun. Eldiven steril kemik iliği hücre izolasyon süreci boyunca işleme izin vermek için % 70 etanol ile sprey.</li>
	<li>Onun forelimbs iğneleyerek diseksiyon kuruluna kurban fare güvenli ve bol % 70 etanol ile püskürtülerek dezenfekte.</li>
	<li>Kalça eklemi yakınındaki makas ile küçük bir insizyon attım (yaklaşık 1 cm) olun. Dikkatle makas temel kas ayrı ve Kalça eklemi çevresindeki tüm yol deriyi kesme deri altına yerleştirin. Not: Diseksiyon kurulu Kalça eklemi geliştirilmiş erişmesine izin vermek için döndürülmüş.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde bacak deri ayak bileği doğru çekerek derisini soymak ve kaldırın. Veya ayak bileği altında tibia tam olduğu gibi bırakma ortak kesmek çok dikkatli olmanın ayak bileği, ayak kesilmiş. Not: Bu aşamada fibula gevşek bağlı olduğu ve Forseps ile kolayca ayrılabilir.</li>
	<li>El ile Kalça eklemi döndürme noktası tanımlamak için uyluk manipüle ederek bulun. Dikkatle makas proksimal femur başında olduğu gibi bırakma ve Kalça eklemi yukarıda bacak sever için kullanın.</li>
	<li>Mümkün olduğu kadar çok kas ve bağ dokusu bacak makasla kaldırın. Ayak bileği ve herhangi bir aşırı kemik malzeme ve Kalça eklemi yukarıda kalan herhangi bir cilt kaldırın.</li>
	<li>Temizlenmiş bacak kemikleri steril RPMI penisilin/streptomisin (%1 son konsantrasyonu) içinde bir petri buz ile takıma yerleştirin.</li>
	<li>1.4 1.6 tibia ve uyluk arka diğer bacak dan izole etmek için aracılığıyla adımları yineleyin.</li>
	<li>Kalan kas ve bağ dokusu RPMI sterilize forseps ve steril #10 bıçak kullanarak iliklerine kemik kaldırın.</li>
	<li>Kemikler Petri kabına kapağını yerleştirin. Tibia dikkatle iliği erişmek için hemen ayak bileği eklemi yukarıda bıçak ile kesin. Tibia bacak kalan kısmından hemen altında diz eklemi keserek çıkarın.</li>
	<li>10 mL steril RPMI 10 mL şırınga penisilin/streptomisin (%1 son konsantrasyonu) ile desteklenmiş ve 25 G iğne takmak çizin.</li>
	<li>Tibia sıkıca Forseps ile dikey olarak 50 mL konik tüp buz üzerinde tutun. Şırıngayı yavaşça yaklaşık 5 mL RPMI konik tüp içine diğer ucunu kemik iliğini temizlemek için kemik sonu içine enjekte etmek için kullanın. Beyaz kemik yaşına gelene kadar 10 mL RPMI sayısı ile kemik iliği sifonu çek. Not: ayrıntılı kızarma sonra kemik beyaz açmalısınız. Değilse, iliği kaldırmak için temizlemeye devam edin. Distal tibia sonuna iğne eklemek için çok dar ise geri bıçakla kesilmiş olabilir gerekir.</li>
	<li>Uyluk kemiği hemen diz eklemi üzerinde ve hemen altında her iki ucunda da kemik iliği erişmek için ortaya çıkarmak için Kalça eklemi kesti. Kemik iliği uyluk 10 mL RPMI tibia olarak aynı şekilde toplam üzerinden sifonu çek.</li>
	<li>Temizlik ve adımları 1.6 1,13 kalan kemikleri aracılığıyla kızarma yineleyin ve bir tek 50 mL konik tüp temizlenen kemik iliği hücrelerinde toplamak Not: bir kemik kemik kızarma önce diseksiyon sırasında herhangi bir noktada kırılırsa, bu kemik iliği kullanmayın.</li>
	<li>Santrifüj kemik iliği toplamak için kullanılan konik tüp 300 x g de 4 ° C'de 10 dakika için tüm dört kemik üzerinden atıp sifonu çektim.</li>
	<li>60 mL steril BMM orta yerleştirin (RPMI % 20 son bir konsantrasyon ile FBS, % 1 penisilin/streptomisin, 1,2 mM Na-pyruvate, 25 µg/mL insan M-CSF) filtre kapağı ile 175 cm2 hücre kültür şişesi içine.</li>
	<li>Süpernatant aşağıdaki Santrifüjü atın ve hücre Pelet hafif yukarı ve aşağı BMM orta 5 mL balonun kullanarak pipetting tarafından resuspend.</li>
	<li>Hücre süspansiyon kültür şişeye aktarmak ve BMM orta ile iki kez konik tüp maksimal hücre kurtarma sağlamak için kültür balonun durulayın. Hücre süspansiyon orta iyice karıştırılır emin olun ve bir ikinci 175 cm2 hücre kültür şişesi filtre kapağı ile ilk 175 cm2 hücre kültür balonun üzerinden 30 mL dağıtmak.</li>
	<li>Her gece 37 ° c, % 5 CO2 herhangi bir bulaşıcı fibroblastlar, ikamet makrofajlar ve diğer yapışık hücreleri ayrılması izin vermek için 30 mL hücre süspansiyon içeren her iki şişe kuluçkaya.</li>
	<li>
1. gün: Farklılaşmamış kemik iliği hücrelerinden şişeler 100 mm x 15 mm TC tedavi polistren Petri yemekler yaklaşık 10 mL içeren süpernatant transfer/çanağı ve 37 ° C, % 5 CO2. kuluçkaya Şişeler atmak.</li>
	<li>
Günde 3 ya da 4: (37 ° C için önceden ısındı) bir ek 5 mL BMM orta her Petri kabına ekleyin ve kuluçka 37 ° C, % 5 CO2devam edin.</li>
</ol>2. kaplama BMMs üzerinde Coverslips enfeksiyonu (7 veya 8 gün)
<ol><li>6-iyi doku kültürü plakaları dört (4) steril 12 mm cam coverslips (autoclaved ve bir kapalı cam kap içinde saklı) her boş dibinde de koyarak hazırlamak. Not: her steril 12 mm coverslip bir vakum hattına monte alıyorum bir ipucu ile al. Coverslips vakum böldüğüm için tüp pinching tarafından istenen konumda bırakmadan örtüşme olmadan kuyu içine koyun.</li>
	<li>Petri yemekler yapisan kemik iliği aspiratı ile kaplı aspiratı medya (ve herhangi bir yapışık olmayan hücreleri) makrofajlar elde ve yavaşça durulama yapışık hücreleri 2 x ile steril Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz olmadan önceden ısınmış kalsiyum ve magnezyum klorür (PBS- /) 37 ° C'ye</li>
	<li>Dropwise, 5 mL steril 1 x PBS- / - 1 mM EDTA her Petri kabına için son bir konsantrasyon ile ekleyin ve 37 ° C'de yapışık BMMs. doğrula hücreleri bir mikroskop kullanarak ayrılır ayırmak için 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>1 x PBS- / - 50 mL konik tüp içinde 1 mM EDTA ile takıma içinde tüm müstakil hücreleri toplamak. Durulama her 2 x 5 mL- / - PBS ile çanak ve hücre süspansiyon havuzuna ekleme. Not: Hücre süspansiyon seyreltilmiş ek PBS ile- / - makrofajlar EDTA toksisite toplama işlemi sırasında korumak için.</li>
	<li>4 ° C'de 10 dakika için 300 x g, santrifüj Süpernatant atın ve makrofajlar tarafından pipetting 5-10 mL BMM ortamda resuspend. Yer hücreleri tüpler ve topaklanma eki önlemek için buz üzerinde resuspended.</li>
	<li>Hücrelerin içinde hemasitometre Trypan mavi dışlama kullanarak say. Not: 5 mL ortamda resuspended BMM hücreleri saymak için 25 µL hücre süspansiyon 445 µL PBS- / - ve 30 µL % 0,4 Trypan mavi çözüm karışımı seyreltme genellikle kolay miktar (son hesaplama için bir 20 x seyreltme faktörü dikkate alarak bir hemasitometre verir ). Bu Trypan ile mavi (hücrelerin) değil hücreleri saymak. Bu karışım çok konsantre veya seyreltilmiş hücre süspansiyon hacmi değişmiş olabilir. Genel olarak, BMM verim hazırlık başına 2 x 107 ve 5 x 107 hücreleri tek bir fare arasında değişmektedir.</li>
	<li>BMM orta istenilen kaplama konsantrasyonu (5 x 105/mL), hücre süspansiyon hazırlamak ve böylece her şey 1 x 106 makrofajlar alır 2 mL orta iyi başına 6 iyi levha için süspansiyon dağıttı. Not: Bu makrofajlar coverslips aynı şekilde karşılamak için yeterli sayıda her şey gets sağlayan kritik bir adımdır. Coverslips Wells değil örtüşen veya ortamda yüzer kontrol edin. Eğer öyleyse, yavaşça bir steril pipet ucu ile ayarlayın.</li>
	<li>Gecede 37 ° C, % 5 CO2kuluçkaya.</li>
</ol>3. infektif formları L. amazonensis arınma
Not: enfeksiyonlar - sabit promastigote kültürler8,13metacyclic promastigotes arındırmak veya kültür promastigotes standart L. amazonensis kullanarak amastigote forma ayırt etmek için LEISHMANIA hazırlamak axenic farklılaşma protokolü6,8.
<ol><li>
 LEISHMANIA metacyclic promastigotes arıtma yoğunluk gradient media(Materials) kullanarak 33<ol>
<li>% 40 hisse senedi çözüm steril, endotoksin ücretsiz su yoğunluğu degrade ortam hazırlamak.</li>
		<li>M199 orta %10 konsantrasyon hazırlamak için (olmadan serum) 10 x M199 Orta yoğunluk degrade çözümde sulandırmak.</li>
		<li>Tüm çözümler 0,22 µm filtreden filtre. Not: Stok çözümleri, 4 oC için artık karanlıkta 1 ay daha saklanabilir.</li>
		<li>2 mL % 40 yoğunluk gradient medya çözeltisi 15 mL konik santrifüj tüpü dibine ekleyin.</li>
		<li>2 mL % 10 yoğunluk degrade medya çözeltisi M199 içinde % 40 yoğunluk gradient medya katman üzerine dikkatli bir şekilde, herhangi bir iki kat arasında karıştırma önlemek için bir Pasteur pipet kullanarak katman.</li>
		<li>1 x 109 parazitler tarafından Santrifüjü 1.900 x g 10 min için de sabit fazlı kültüründen toplamak.</li>
		<li>Hücrelerin içinde 6 mL Dulbecco'nın değişiklik gerekli orta (DMEM) resuspend.</li>
		<li>Katman hücre süspansiyon doğrudan degrade medya katman, yavaşça, Pasteur pipet katmanlar arasında karıştırma önlemek için kullanarak % 10 yoğunluğu üzerine 2 mL.</li>
		<li>Degrade için 1.300 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi. Not: LEISHMANIA türler arasında fiziksel özelliklerindeki farklılıklar nedeniyle Santrifüjü koşulları her biri için biraz maksimum verim sağlamak için ayarlanması gerekebilir.</li>
		<li>Parazitler (metacyclic promastigote formunda zenginleştirilmiş) üst % 10 yoğunluk gradient medya sınır (%0 ve % 10 yoğunluk gradient medya katmanlar arasında arayüz), kurulan grubu toplamak.</li>
		<li>Parazitler DMEM bir hacmi ile sulandırmak ve Santrifüjü (oda sıcaklığında 10 dakika için 1.900 x g) tarafından toplamak.</li>
		<li>500 µL DMEM ortamda resuspend ve bir hemasitometre verim ölçmek için say.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
L. amazonensis amastigotes axenic kültür koşullar altında nesil (düşük pH / yüksek sıcaklık)6,8,13<ol>
<li>Log fazı promastigote kültür (pH 7.4 26 oC de) Mix 5 mL amastigote orta (pH 4.5), eşit bir hacmi ile 25 cm2 şişeler (Toplam 10 mL orta) kullanarak ve 26 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
		<li>Şişeye 26 ° C'den 32 ° C'ye vardiya.</li>
		<li>Kültür 1:5 amastigote medya 32 ° C'de 3-4 gün sonra bölünmüş</li>
		<li>Parazitler önümüzdeki 3-4 enfeksiyonlar kullanıma hazır olup olmadıklarını görmek için gün (en fazla 7 gün) iade edin. Not: Sağlıklı axenic amastigotes görünür kamçı olmadan bir oval şekil olmalıdır. Kısmen farklılaşmış amastigotes kısa kamçı ile büyük bir oval şekil var. Kültür kümeleri çok olmamalıdır - birçok kümeleri sigara-parazitler ölüyor, büyüyen bir göstergesi. Amastigote kültür 1:5 bölünmüş ve en fazla 2 hafta için saklanır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. L. amazonensis enfeksiyonla
<ol><li>Parazit süspansiyonlar göre istenilen MOI (genellikle 3-5 metacyclic promastigotes makrofaj [MOI 1:3 veya 1:5] başına) ve 1 amastigote makrofaj [MOI 1:1] başına oranında seyreltin. LEISHMANIA PBS- / - 50-100 µL hacmine zaten 2 mL orta içeren her şey ekleyin.</li>
	<li>BMMs ile amastigotes ve metacyclic promastigotes, 34 oC enfeksiyonu ile 3 h 1 h için kuluçkaya. Not: Optimum enfeksiyon sıcaklık türün farklılık gösterebilir.</li>
	<li>Kuluçka, takip iyice silsin- / - ücretsiz parazitler her şey 3 x 2 mL PBS ile önceden 37 ° C'ye ısıtılmış Not: hafifçe coverslips üst üste float değil emin olmak için PBS dağıtmak. Yavaşça plaka girdap ve sıvı Aspire edin. Ayrı alıyorum ipucu birden fazla suşları parazitler ve Çapraz bulaşma kaçınmak için kullanıyorsanız kullanın.</li>
	<li>1 h veya 3 h her kuluçka süresi-noktası örnekleri düzeltmek de ile 1.5-2 mL % 2 PFA PBS- / - 10 dakika süreyle yıkayın PBS- / - 3 x. Son yıkama Aspire edin ve boyama kadar PBS coverslips içeren plakaları soğutmak değil.</li>
	<li>Daha fazla zaman-puan için her şey plakaları 2 mL taze BMM orta eklemek ve 34 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Düzeltme kalan zaman-Puan istediğiniz gibi açıklandığı gibi 4.3 adım ve tabak boyama kadar buzdolabında bekletin.</li>
</ol>5. DAPI boyama ve Coverslip montajı
<ol><li>PBS coverslips içeren kuyulardan Aspire edin ve 1,5 mL PBS- / - %0,1 non-iyonik deterjan ile ekleyin. 3 x yıkama tarafından ile 2 mL PBS- / - takip oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.</li>
	<li>1 mL PBS- / - 2 µg/mL (5 mg/mL stok çözümden suda seyreltilmiş) DAPI olarak coverslips içeren wells ekleyin ve başka bir 1 saat oda sıcaklığında için kuluçkaya. Not: DAPI kuluçka zamanla hücre içi LEISHMANIA parazitler doğru görselleştirme için önemlidir. Makrofaj hücre çekirdeği hızla leke, onların daha büyük boyutta ve DNA nedeniyle içerik ancak intrasellüler parazit çekirdekleri boyama daha yavaş. Böylece, kuluçka zaman ne BMM çekirdeği görselleştirmek için gereklidir ötesinde genişletme DAPI üzerinden nüfuz ve parazit plazma zarı ve parazit nükleer membran izin vermek gereklidir. Uygun DAPI leke ile parazit kamçılı cep yakınındaki DNA Mitokondrial kinetoplast Ayrıca, nükleer DNA ek olarak görüntülenmeyecektir.</li>
	<li>Her şey coverslips 3 içeren yıkama x 2 mL PBS- / - ve sonra Asansör ile ve hücre yan yerleştirin ve cam mikroskobunun monte Forseps ile fiske vurmak coverslips slaytlar ile piyasada bulunan antifade montaj reaktif. Not: Coverslips son derece kırılgan ve dikkatli işleme gerekir. Basınç onları, özellikle ne zaman kaldırma wells kenarındaki karşı koyarak kaçının. PBS- / - birkaç damla ekleme coverslip ve iyi arasındaki yüzey gerilimini azaltır ve kaldırma işlemini kolaylaştırır. İyi ölçer iğneyle kuyu dibinden coverslips meraklı yardımcı olmak için kullanılabilir. Slayt üzerinde bir coverslip koyduktan sonra yavaşça aşağı Forseps ile montaj medya herhangi bir hava kabarcıkları dışarı itmek için tuşuna basın. Bir coverslip bozuldu veya muhtemelen kaldırma işlemi sırasında saygısız, yeniden bağlayın değil; Sadece yedek dördüncü coverslip kullanın.</li>
	<li>Slaytlar miktar kadar buzdolabında bekletin.</li>
</ol>6. enfeksiyon miktar
<ol><li>Daldırma yağ ile 100 X objektif lens kullanarak makrofajlar üzerinde odaklanarak DAPI lekeli slaytları floresan mikroskop altında incelemek (358, uyarma nm; 461, en iyi emisyon nm). Odak makrofajlar cam slayt ve coverslip arasında tabakası açık olduğundan emin olun.</li>
	<li>Makrofajlar (büyük çekirdekler DAPI ile lekeli) sayısını ve her makrofaj çekirdeği kümelenmiş daha küçük amastigote çekirdeği sayısını ölçmek (bkz. şekil 2A, DAPI) görüş her alan için el ile bir sayaç kullanarak. Not: Amastigote çekirdeği tüm odak kendi küçük boyutu nedeniyle bir düzlemde görünür olabilir. Makrofaj hücre çekirdeği üzerinde odaklanmış zaman görünür olan saymak ve iyi odak parazit çekirdeklerin üstünde ve altında makrofaj hücre çekirdeği uçaklarda denetlemek için kullanın.</li>
	<li>Başka bir görme alanı için miktar tekrarlamak için hareket ettirin. Ayrı counter anahtar sayılan alanların sayısını izlemek için kullanın. Hareket ile visual alanlar paralel satırlardaki her coverslip arasında önlemek için örtüşme sayma.</li>
	<li>Coverslip başına 200 makrofajlar en az ölçmek. Her zaman noktası nüsha (3 coverslips) enfeksiyon ölçmek. Bir önceki sayımı nedeniyle coverslip örtüşme, zavallı montaj, cam kırılması, vb için uygun değilse dördüncü coverslip saymak Not: 200 makrofajlar herhangi bir bir coverslip sayılır, yedek lastik dördüncü saymak.</li>
	<li>Enfeksiyon oranları amastigotes/makrofaj veya amastigotes/100 makrofaj olarak hesaplamak ve ham miktar verilerden yüzde virüslü makrofajlar belirlemek.</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirmek,

Yukarıda açıklanan BMM enfeksiyon tahlil tarafından üretilen Nicel veri sağlar müfettişler enfeksiyon oranları ve güvenilir belirlenmesi virülans yapılan değişikliği (en fazla 2 2 ile karşılaştırıldığında hafta, nispeten daha kısa bir zaman dilimi içinde elde etmek için ay) içinde vivo deneyler için gerekli. Bu yöntem DNA belirli boya DAPI, özellikle makrofaj ve parazit çekirdeği lekeleri ve hızlı kimlik ve enfekte hücreleri miktar sağlayan dayanır. Buna karşılık, Giemsa g...

Leishmaniasis insan hastalıkları protozoon parazit türü LEISHMANIAtarafından neden olduğu geniş bir yelpazede anlamına gelir. Yaklaşık 12 milyon kişi şu anda LEISHMANIA ile dünya çapında bulaşmış ve 350 milyondan fazla risk altındadır. Hastalık patoloji LEISHMANIA türler ve ana faktöre bağlıdır ve belirtiler zararsız kendi kendini iyileştirme deri lezyonları ölümcül visceralizing formları için değişir. Tedavi edilmezse, viseral leishmaniasis ölümcül ise, en ölümcül insan hastalık olarak sıtma sonra sıralama neden olduğu enfeksiyon protozoon parazit1. Hastalık patoloji ve belirtiler geniş kapsamlı görüş farklılıklarına rağmen tüm LEISHMANIA tür bir digenic sırasıyla promastigote ve amastigote aşamaları içinde böcek ve omurgalı ana bilgisayarlar arasında değişen ömrü var. İç omurgalılar, LEISHMANIA ana bilgisayar makrofajlar işgali için hedef ve parasitophorous boşluklar (PVs), nerede son derece öldürücü amastigote formları çoğaltmak asidik bölmeleri ile phagolysosomes özelliklerini oluşumu teşvik. Amastigotes ana bilgisayar dokularda kronik enfeksiyonlar sırasında kalıcı ve bulaşmamış olduğu için ileri sandflies, iletim döngüsü tamamlanıyor geçirilebilir. Bu nedenle, insan hastalığı geliştirme bağlamında, amastigotes en önemli LEISHMANIA yaşam döngüsü formu2vardır. Nasıl amastigotes içinde makrofaj PVs çoğaltmak araştıran ve anlayış LEISHMANIA virülans3,4,5,6,7 için kritik roman etkili tedaviler geliştirilmesi.
Biz burada düzenli olarak LEISHMANIA enfeksiyon ve hücre içi LEISHMANIA sayısı kantitatif değerlendirilmesi zamanla içeren makrofajlar (BMMs), kemik iliği türevi çoğaltmasında çalışmaya bizim laboratuvar tarafından kullanılan bir yöntem açıklanmaktadır. Fare kemik iliği ve farklılaşma monosit kültür makrofajlar, vitro enfeksiyon infektif formları (metacyclic promastigotes veya amastigotes) ile LEISHMANIA ve miktar, hasat işlemi içerir 72-96 h enfeksiyon sonrasında bir süre için her 24 saat aralıklarla intrasellüler parazit sayısı. Bu tahlil çeşitli çevresel faktörler ve parazit genler daha da footpad tarafından doğrulandı L. amazonensis virülans teşvik demir kritik rol kimliği de dahil olmak üzere, etkisini belirlemek için bizim laboratuvar olarak kullanılmıştır lezyon belirleme çalışmaları, fareler6,8,9,10,11,12,13,-14,15 . Bütün patojenik LEISHMANIA türlerin ana bilgisayar makrofajlar içinde ikileştirici onların niş kurmak, bu tahlil evrensel olarak tüm LEISHMANIA türlerin virülans tespitler için kullanılabilir.
BMM enfeksiyonlar yapmadan tek hücre düzeyinde ana bilgisayar-parazit etkileşimlerin analizi ve böylece nasıl LEISHMANIA parazitler makrofajlar PVs onların tercih edilen ana microenvironment ile etkileşim daha kapsamlı bir anlayış olanağı sağlar. Makrofaj enfeksiyon deneyleri başarılı bir şekilde birden çok grupları16,17,18,19,20,21,22 tarafından keşfetmek için kullanılmıştır işlevleri hem ana bilgisayar makrofaj ve LEISHMANIA belirli genler ve hücre içi enfeksiyon karakterize karmaşık etkileşim potansiyel onların katılımı. Miktar microbicidal nitrik oksit üretimi, Reaktif oksijen türleri nesil ve diğer olumsuz koşullar gibi hücre içi hayatta kalma etkileyen ana faktörler etkisinin bir okuma olarak parazit büyümenin BMM enfeksiyonlar izin içinde lysosome benzeri PVs23karşılaştı. Makrofaj enfeksiyon deneyleri de potansiyel anti-leishmanial uyuşturucu müşteri adayları terapötik geliştirme13,24tanımlamak için kullanılmıştır.
Vitro doğa BMM enfeksiyonların LEISHMANIA virülans değerlendirmek için diğer yöntemleri çeşitli avantajlar sağlar. Ancak, zamanla intrasellüler parazit kurtulma mekanizmaları incelerken birkaç önceki çalışmalarda enfeksiyon oranı20,21,24olarak ölçmek değil. Ayrıca, birçok çalışma zamanla vivo içinde enfeksiyonları takip duruldu kutanöz bir lezyon boyutu ve parazit çoğaltma25,-26 yalnızca dolaylı olarak ilgili diğer fizyolojik belirtiler ölçerek yaptım , 27. vivo içinde enfeksiyon parazit virülans değerlendirmek için sıkı bir yaklaşım olmakla birlikte, lezyon boyut ölçüleri footpad yalnız şişme tabanlı çoğu zaman yetersiz, enfekte dokularda inflamatuar yanıt yansıttıkları gibi değil parazitler mutlak sayısı. Bu nedenle, footpad lezyon geliştirme deneyleri, enfekte dokular, parazit seferdeki miktar tarafından takip edilmesi gerek uzun sınırlayıcı seyreltme gerektiren yordamı28deneyleri. Ayrıca, in vivo genellikle farklı noktalarda birden fazla hayvan dokuları faiz6,8,9,10, ayıklamak için zamanında ödün dahil çalışmaları 11 , 13. buna ek olarak, çok sayıda BMMs bir hayvandan elde edilebilir ve bu hücreler enfeksiyonu değerlendirilmesi çeşitli noktalarda zamanında izin koşullar altında kaplama. Ayrıca, in vivo çalışmalar için karşılaştırıldığında, vitro BMM enfeksiyonlar yapmadan deneysel koşullar üzerinde daha fazla denetim olanağı sağlar. Parazitler kendileri ile birlikte bulaşması için makrofajlar miktarının çokluğu enfeksiyon (MOI) ve kültür koşullardan hassas kontrol sağlar. Bu faktörler üzerinde daha iyi denetim anahtar içinde ayrı hücresel yollar özelliklerinin belirlenmesi ve enfeksiyon sahası üzerindeki etkilerini anlamak olabilir.
Bu avantajları göz önüne alındığında, çok az sayıda gruplar LEISHMANIA virülans eğitim defa makrofajlar hücre içi çoğaltma kantitatif değerlendirilmesi tüm avantajlarından almış biraz şaşırtıcıdır. Bu makalede, biz bu tahlil daha kapsamlı kullanımını engelleyici, ve onun düzgün şekilde uygulanmasını kolaylaştırmak için adım adım bir protokol sağlar ortak tuzaklar tartışıyorlar. Onun hassas ve çok yönlülük göz önüne alındığında, biz burada tarif BMM enfeksiyon tahlil, yalnızca ana bilgisayar-patojen etkileşimleri LEISHMANIA virülans etkileyen keşfetmek için aynı zamanda içinde çoğaltma diğer mikroorganizmalar çalışmaya yararlı olabilir değil makrofajlar29. Önemlisi, bu tahlil anti-leishmanial ilaç geliştirme için hızlı ve ekonomik önceden klinik tarama yöntemi olarak da geliştirilebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC147440250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10</td>
			<td>Aspen Surgical</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide Needle, 25G&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>627 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flask</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses: 12 mm circles</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Biotin</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>C272-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Texas red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry Co. LTD</td>
			<td>H0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoton II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (-/-)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14200166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Lamp-1 antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Bright-Line&#160; Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 Surfactant</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TX1568-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Scissors, 4 1/2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps, Fine Tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605699</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of intracellular growth inside macrophages is a fast and reliable method for assessing the virulence of leishmania parasites

LEISHMANIA, hastalığının leishmaniasis, yaşam döngüsü içinde böcek promastigote ve amastigote aşamaları ile omurgalı ana bilgisayarları arasında sırasıyla geçiş yapar. Patojenik leishmaniasis belirtileri çok, son derece ölümcül visseral hastalık formlara infektif tür bağlı olarak benign Kutanöz lezyonlarin üzerinden değişebilir iken tüm LEISHMANIA tür omurgalı aşaması sırasında ana bilgisayar makrofajlar içinde bulunan onların yaşam döngüsü. LEISHMANIA infektivite bu nedenle işgal, hayatta kalmak ve makrofajlar içinde parasitophorous boşluklar (PVs) içinde çoğaltmak için onun yetenek için doğrudan ilgilidir. Böylece, asıl olayın asalağın intracellularly çoğaltmak yeteneği değerlendirmek virülans belirlemek için güvenilir bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Hayvan modelleri kullanarak leishmaniasis geliştirme eğitim zaman alıcı, sıkıcı ve çoğu zaman zor, özellikle pathogenically önemli visseral formlarla. Biz burada makrofajlar (BMMs) kemik iliği elde edilen hücre içi LEISHMANIA gelişiminde izlemek için bir metodoloji açıklayın. İntrasellüler parazit numaraları, 72-96 h enfeksiyonu takip için 24 saat aralıklarla belirlenir. Bu yöntem güvenilir bir tayin edilmesi LEISHMANIA virülans çeşitli genetik faktörlerin etkilerini tanır. Örnek olarak, biz nasıl bozar tek gen silme LEISHMANIA mitokondrial demir taşıyıcı gen (LMIT1) LEISHMANIA amazonensis mutant suşu LMIT1/ΔLmit1 yetenek BMMs içinde büyümeye göstermek, sert bir düşüş vahşi-türüne göre virülans yansıtan. Bu tahlil de ayrı ayrı ana bilgisayar-patojen etkileşim çeşitli faktörler (besin, Reaktif oksijen türleri, vb) etkisi analiz etmek için manipüle edilebilir deneysel koşullar hassas kontrol sağlar. Bu nedenle, uygun yürütme ve miktar BMM enfeksiyon çalışmaların geleneksel hayvan modeli çalışmaları için non-invaziv, hızlı, ekonomik, güvenli ve güvenilir bir alternatif sağlar.

LEISHMANIA iki infektif - procyclic promastigotes kültür durağan faz ayırt metacyclic promastigotes ve hücre içi aşamaları (şekil 1) amastigotes vardır. L. amazonensisgibi bazı LEISHMANIA türler içinde amastigotes da axenic kültürü promastigote daha düşük pH (4.5) ve yüksek sıcaklık (32 ° C), koşullar BMM PVs içinde bulunan hücrelere ilerletmeniz ayrıştırılan 8 , <sup ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites at JoVE.com

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Bütün patojenik LEISHMANIA türler bulunur ve omurgalı onların ana makrofajlar içinde çoğaltmak. Burada, fare kemik iliği türevi makrofajlar kültür ile hücre içi büyüme Kinetik kesin miktar tarafından takip LEISHMANIA, bulaştırmak için bir protokol mevcut. Ana bilgisayar-patojen etkileşim ve LEISHMANIA virülans etkileyen bireysel faktörler eğitim için yararlı bir yöntemdir.

Hızlı ve güvenilir yöntem LEISHMANIA parazit virülans değerlendirmek için hücre içi büyüme makrofajlar içinde miktar olduğunu

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

quantification-intracellular-growth-inside-macrophages-is-fast

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

10.4K Görüntüleme.  University of Maryland. Bütün patojenik LEISHMANIA türler bulunur ve omurgalı onların ana makrofajlar içinde çoğaltmak. Burada, fare kemik iliği türevi makrofajlar kültür ile hücre içi büyüme Kinetik kesin miktar tarafından takip LEISHMANIA, bulaştırmak için bir protokol mevcut. Ana bilgisayar-patojen etkileşim ve LEISHMANIA virülans etkileyen bireysel faktörler eğitim için yararlı bir yöntemdir.

Video: Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

Canlı bir Host Transgenik Leishmania Parazitlerinin in vivo Imaging

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Kemirgen Sıtma Parazitler Genetik Haç üretimi için protokol

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

Hücre içi Karşı Antileishmanial Tarama için Parasite Kurtarma ve Dönüşüm Testi<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 İnsan Akut Monositik Lösemi Hücre Hattı&gt; Amastigotes

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag: Yüksek verim Colony Büyüme niceliksel ve Zaman Lag

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

Mycobacterium abscessus virülans işaretleri tanımlaması fagositler hücre içi çoğaltma için

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...