이 작품은 노스 웨스트를 건강 그랜트 RO1 AI067979의 국가 학회에 의해 지원 되었다. YK 학부 친목에서 하 워드 휴즈 의학 연구소/대학 메릴랜드 칼리지 파크의 받는 사람입니다.

모든 실험 절차 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 권장 사항에 따라 건강의 국가 학회에 의해 실시 했다 고 메릴랜드 대학 IACUC에 의해 승인 했다. 섹션 1-4에에서 설명 된 모든 단계 생물 층 류 캐비닛 안으로 밖으로 aseptically 실행 한다. 개인 보호를 사용 해야 합니다, 그리고 실험의 모든 단계에 걸쳐 라이브 Leishmania 기생충의 처리 하는 동안 주의 행사 한다.
1. 격리와 골 수 유래 세포 (BMMs)8,,3031 의 차별화
<ol><li>
0: 4-6 주 된 여성 C57BL/6 또는 CO2 챔버에 BALB/c 마우스를 희생 하 고 자 궁 경부 전위를 통해 죽음을 확인 합니다. 70% 에탄올에 배어 그들을 유지 하 여가 위, 집게의 살 균을 확인 합니다. 골 수 세포 격리 프로세스를 통해 처리 살 균 수 있도록 70% 에탄올과 장갑 스프레이.</li>
	<li>그 앞 발을 고정 하 여 희생된 마우스 해 부 보드를 장악 하 고 70% 에탄올 copiously 살포 하 여 소독.</li>
	<li>엉덩이 관절 근처가 위로 작은 절 개 (약 1cm)을 확인 합니다. 신중 하 게가 위 기본 근육을 분리 하 여 고관절 주위의 모든 방법을 피부를 잘라 피부 아래 삽입 합니다. 주: 해 부 보드 엉덩이 관절에 대 한 향상 된 액세스를 허용 하도록 회전할 수 있습니다.</li>
	<li>신중 하 게 발목 쪽으로 당겨 다리에서 피부를 deglove 하 고 제거 합니다. 경골을 완전히 그대로 공동 또는 발목 아래를 잘라 아주 조심 발목에서 다리를 잘라. 참고:이 단계에서 비 골 및 느슨하게 연결 된는 집게와 쉽게 분리 될 수 있다.</li>
	<li>수동으로 회전 지점을 식별에 대 퇴 골을 조작 하 여 고관절을 찾습니다. 신중 하 게가 위를 사용 하 여 대 퇴 골의 근 위 머리를 그대로 두고 고관절 위의 다리를 끊을 수 있습니다.</li>
	<li>많은 근육과 결합 조직으로 제거 가능한 다리에서가 위. 발목 및 고관절 위에 초과 뼈 자료에서 남아 있는 피부를 제거 합니다.</li>
	<li>얼음에 페 트리 접시에 페니실린/스 (최종 농도 1%)으로 보충 하는 살 균 RPMI에 청소 다리 뼈를 배치 합니다.</li>
	<li>1.4 1.6 다른 뒷 다리에서 대 퇴 골과 경골을 통해 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>모든 나머지 근육 및 결합 조직 RPMI 집게를 소독된 및 살 균 #10 블레이드를 사용 하 여에 몸을 담글 뼈에서 제거 합니다.</li>
	<li>Petri 접시 뚜껑에 뼈를 놓습니다. 바로 골 수 액세스할 수 발목 관절 위에 블레이드와 경골을 신중 하 게 잘라. 바로 아래는 무릎 관절을 절단 하 여 경골은 다리의 나머지 부분에서 제거 합니다.</li>
	<li>10 mL 살 균 RPMI 10 mL 주사기로 페니실린/스 (최종 농도 1%)로 보충 하 고 25g 바늘을 연결을 그립니다.</li>
	<li>잡고 경골 단단히 집게와 수직으로 얼음에 50 mL 원뿔 튜브에. 주사기를 사용 하 여 부드럽게 RPMI 약 5 mL 원뿔 관으로 다른 쪽으로 골 수를 뼈의 끝에 삽입. 뼈 흰색 변할 때까지 총 10 mL RPMI 골을 플러시. 참고: 후 철저 한 홍 조, 뼈 해야 차례 흰색. 그렇지 않은 경우에 골 수를 제거 하는 홍 조 계속. 경골의 선단부 너무 좁은 바늘을 삽입 하는 경우는 블레이드와 함께 다시 손질 해야 합니다.</li>
	<li>무릎 관절 위와 바로 아래 노출 액세스 골 수 뼈의 양쪽 끝을 고관절 바로 대 퇴 골을 잘라. 총 10 mL RPMI 동일한 방식으로 경골에 대 퇴 골에서 골을 플러시.</li>
	<li>청소 및 단계 나머지 뼈 1.13 통해 1.6 홍 조를 반복 하 고 단일 50 mL 원뿔 튜브에 플러시 하는 골 수 세포 수집 참고: 경우 뼈 뼈 홍 조 전에 절 개 하는 동안 언제 든 지 휴식,이 뼈에서 골 수는 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>원심 골 수 수집 하는 데 사용 하는 원뿔 튜브 x 300g에 4 ° C에서 10 분에 대 한 모든 4 개의 뼈에서 플러시됩니다.</li>
	<li>장소 살 균 BMM 매체의 60 mL (마지막 20% 농도로 RPMI FBS, 1% 페니실린/스, 1.2 m m 나-pyruvate, 25 µ g/mL 인간의 M-CSF) 필터 캡 175 cm2 셀 문화 플라스 크로.</li>
	<li>표면에 뜨는 다음 원심 분리를 삭제 하 고 셀 펠 릿 BMM 매체의 5 mL을 사용 하 여 플라스 크에서 pipetting 위아래로 부드러운 여 resuspend.</li>
	<li>문화 플라스 크에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 최대한 셀 복구 되도록 문화 플라스 크에서 두 번 BMM 매체와 원뿔 튜브를 헹 굴. 세포 현 탁 액은 매체에 혼합 철저 하 게 확인 하 고 두 번째 175 cm2 셀 문화 플라스 크 필터 캡을 초기 175 cm2 셀 문화 플라스 크에서 30 mL를 배포.</li>
	<li>포함 30 mL 세포 현 탁 액에서 37 ° C, 5% CO2 어떤 오염 fibroblasts, 상주 대 식 세포와 다른 부착 세포 분리 수 있도록 각 숙박 모두 플라스 크를 품 어.</li>
	<li>
주 1: 100 m m x 15 m m TC 치료 비 폴리스 티 렌 접시에 약 10 mL를 플라스 크에서 undifferentiated 골 수 세포를 포함 하는 상쾌한 전송/요리 하 고 37 ° C, 5% CO2. 에서 품 어 플라스 크를 삭제 합니다.</li>
	<li>
3 또는 4: 각 페 트리 접시에는 추가 5 mL BMM 매체 (37 ° C에 미리 예 열)를 추가 하 고 37 ° c, 5% CO2배양을 계속.</li>
</ol>2. 감염 (7 또는 8 주)에 대 한 Coverslips에 BMMs 도금
<ol><li>각 빈의 하단에 4 (4) 살 균 12 m m 유리 coverslips (압력가 마로 소독 하 고 닫힌된 유리 컨테이너에 저장)을 잘 배치 하 여 6 잘 조직 배양 접시를 준비 합니다. 참고: 데리 러 각 살 균 12 mm coverslip 진공 라인에 장착 하는 aspirating 팁. 중복, 진공을 방해 하는 튜브를 곤란 하 게 하 여 원하는 위치에 해제 없이 우물에 coverslips를 놓습니다.</li>
	<li>Aspirate 미디어 (및 어떤 비 부착 한 세포) 부착 골으로 코팅 접시에서 파생 된 대 식 세포와 부드럽게 린스 점착 세포 칼슘 및 마그네슘 염화 물 (PBS-/-) 미리 예 열 없이 살 균 Dulbecco 인산 염 버퍼 식 염 수를 2 배 37 ° c</li>
	<li>5 mL 살 균 1 각 페 트리 접시에 1 mM EDTA의 최종 농도 함께-/-PBS x dropwise, 추가 하 고 점착 BMMs. 확인 세포는 현미경을 사용 하 여 분리는 분리를 37 ° C에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>1 x PBS-/-50 mL 원뿔 튜브에 1 mM EDTA와 보완에 모든 분리 된 세포를 수집 합니다. 린스 각 접시 5 mL PBS-/-2 x 그리고 셀 서 스 펜 션 수영장에 추가. 참고: 추가 PBS-/-수집 프로세스 동안 EDTA 독성에서 세포를 보호 하기 위해 세포 현 탁 액 희석 될 수 있습니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 분리기 상쾌한 무시 하 고 pipetting으로 5-10 mL BMM 매체에서 대 식 세포를 resuspend. 장소는 첨부 파일 튜브 및 응집을 방지 하기 위해 얼음에 셀 resuspended.</li>
	<li>실행 가능한 세포는 hemocytometer Trypan 블루 제외를 사용 하 여 계산 합니다. 참고: 5 mL 매체에 resuspended BMM 셀의 개수, 25 µ L 세포 현 탁 액-/-445 µ L PBS에 30 µ L 0.4 %Trypan 블루 솔루션의 희석 혼합 일반적으로 수 있습니다 쉽게 정량화를 hemocytometer (고려 최종 계산에 대 한 20 배 희석 요인에 ). Trypan 블루 (가능한 셀)로 얼룩진 얻을 하지 않았다 셀만을 계산 합니다. 이 혼합물은 너무 집중 또는 희석 하는 경우 셀 서 스 펜 션의 볼륨을 변경할 수 있습니다. 일반적으로, 준비 당 BMM의 수익률 2 x 107 , 5 x 107 셀 단일 마우스에서 사이 변화 한다.</li>
	<li>원하는 도금 농도 (5 x 105/mL)에서 BMM 매체에 세포 현 탁 액을 준비 하 고 각 잘 1 x 106 세포 받도록 잘 당 2 mL 매체에 6 잘 플레이트에 정지를 분산. 참고: 이것은 중요 한 단계는 모든 잘 되 면 대 식 세포는 coverslips를 균일 하 게 커버의 적절 한 번호입니다. 그 우물에 coverslips 하지 중복 또는 매체에 떠 있는 확인 하십시오. 그렇다면, 부드럽게 살 균 피 펫 팁으로 조정 합니다.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2에서 밤새 품 어.</li>
</ol>3. 감염 형태의 L. amazonensis 의 정화
참고: 준비 Leishmania 감염-정화 고정 promastigote 문화8,13에서 metacyclic promastigotes 또는 promastigotes 문화에 표준 나 amazonensis를 사용 하 여 amastigote 형태로 차별화 axenic 차별화 프로토콜6,8.
<ol><li>
 Leishmania metacyclic promastigotes 사용 하 여 밀도 그라데이션 media(Materials) 33<ol>
<li>살 균, 내 무료 물에서 밀도 그라데이션 미디어의 40% 재고 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>M199 매체에 10% 농도 준비 하 밀도 (혈 청) 없이 10 x M199 매체에 그라데이션 솔루션을 희석.</li>
		<li>모든 솔루션 0.22 μ m 필터를 통해 필터링. 참고: 재고 솔루션 4 oC 이상에 대 한 어둠 속에서 1 달에 저장할 수 없습니다.</li>
		<li>15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브의 하단에 있는 40% 밀도 그라데이션 미디어 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>레이어 2 mL의 10% 밀도 그라데이션 미디어 솔루션 40% 밀도 그라데이션 미디어 레이어 위에 M199 신중 하 게, 2 개의 층 사이 어떤 혼합을 피하기 위해 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여.</li>
		<li>10 분 동안 1900 x g에서 원심 분리 하 여 고정 위상 문화에서 1 x 109 기생충을 수집 합니다.</li>
		<li>셀에 6 mL Dulbecco의 수정 필수 매체 (DMEM) resuspend</li>
		<li>계층의 그라데이션 미디어 레이어, 부드럽게, 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 레이어 간 혼합을 피하려고 10% 밀도 위에 직접 세포 현 탁 액 2 mL.</li>
		<li>상 온에서 1300 x g에서 10 분 동안 그라데이션 원심 참고: Leishmania 종 간의 물리적 특성 차이, 때문 각 원심 분리 조건 최대 수익률을 보장 하기 위해 약간 조정 해야 할 수도 있습니다.</li>
		<li>상위 10% 밀도 그라데이션 미디어 경계 (0%와 10% 밀도 그라데이션 미디어 계층 간의 인터페이스)에서 결성 된 밴드에서 기생충 (metacyclic promastigote 형태로 농축)를 수집 합니다.</li>
		<li>DMEM의 하나의 볼륨으로 기생충을 희석 하 고 원심 (실 온에서 10 분 동안 1900 x g)에 의해 수집 합니다.</li>
		<li>500 µ L DMEM 매체에 resuspend과 hemocytometer 수익률을 계량 하기에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
L. amazonensis amastigotes axenic 문화 조건 하에서 세대 (낮은 pH / 온도 상승)6,,813<ol>
<li>amastigote 매체 (pH 4.5), 동등한 양으로 로그 단계 promastigote 문화 (26 oC에서 pH 7.4)의 혼합 5 mL 25 c m2 플라스 크 (총 10 mL 매체)를 사용 하 고 밤새 26 ° C에서 품 어.</li>
		<li>26 ° C에서 32 ° c.에 플라스 크를 이동</li>
		<li>3 ~ 4 일 후에 32 ° c.에의 amastigote 미디어 문화 1:5 분하시오</li>
		<li>기생충 감염에 사용 하기 위해 준비가 되어 있는지 확인 하기 위해 다음 3-4 일 (최대 7 일)에서 확인 합니다. 참고: 건강 한 axenic amastigotes는 타원형 모양, 보이는 flagella 없이 있어야 합니다. 부분적으로 차별화 된 amastigotes 짧은 flagella 큰 타원형 모양이 있다. 문화 없는 덩어리의 많은-많은 덩어리 비-성장, 죽어 기생충의 표시. Amastigote 문화 1: 5을 분할 하 고 3 주 최대 유지 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. 감염 L. amazonensis
<ol><li>(일반적으로 3-5 metacyclic promastigotes 대 식 세포 [나의 1:3 또는 1:5] 당)와 대 식 세포 [나 1:1] 당 1의 amastigote 원하는 나에 따라 기생충 정지 희석. 이미 2 mL 매체를 포함 하는 각 음에 Leishmania PBS-/-50-100 µ L의 볼륨에 추가 합니다.</li>
	<li>1 h amastigotes와 3 h 34 oC 감염에서 metacyclic promastigotes와 BMMs를 품 어. 참고: 최적의 감염 온도 종에 의해 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>다음 화, 철저 하 게 씻어-/-각 잘 3 x 2 mL PBS와 함께 무료 기생충 37 ° c에 미리 데워 참고: 분산 coverslips 서로 떠 있 하지 않습니다 수 있도록 부드럽게 PBS. 부드럽게 접시 소용돌이 그리고 액체 밖으로 발음. 기생충의 여러 종자를 사용 하 여 교차 오염을 피하기 위해 별도 발음 팁을 사용 합니다.</li>
	<li>1 h 또는 h 3을 각각 배양 하 여 시간-포인트 샘플 수정 2%의 1.5-2 mL와 잘 PFA PBS-/-10 분에 대 한 PBS-/-를 가진 3 배 세척. 마지막 세척을 발음 하지 고 얼룩까지 PBS에 coverslips를 포함 하는 접시를 냉장 보관.</li>
	<li>추가 시간 포인트 접시에 각 음을 2 mL 신선한 BMM 매체를 추가 하 고 34 ° c.에 품 어</li>
	<li>원하는 대로 수정 남은 시간-포인트에 설명 된 대로 단계 4.3과 얼룩까지 플레이트를 냉장 보관.</li>
</ol>5. DAPI 얼룩 및 Coverslip 장착
<ol><li>Coverslips를 포함 하는 우물에서 PBS를 발음 하 고 0.1% 비 이온 세제 1.5 mL PBS-/-를 추가 합니다. 2 mL PBS-/-3 배 세척 뒤 실 온에서 10 분 동안 품 어.</li>
	<li>Coverslips를 포함 하는 웰 스에 2 µ g/mL DAPI (물에서 5 mg/mL 재고 솔루션에서 희석)와 함께 1 mL PBS-/-을 추가 하 고 또 다른 1 시간 실 온에서 품 어. 참고: DAPI와 보육 시간은 세포내 Leishmania 기생충의 적절 한 시각화에 대 한 중요 합니다. 대 식 세포 핵 얼룩 급속 하 게, 그들의 큰 크기 및 DNA 콘텐츠 하지만 세포내 기생충의 핵의 얼룩 느립니다. 따라서, BMM 핵을 시각화 하는 데 필요한 무엇 넘어 보육 시간 연장 DAPI 통해 침투와 기생충 원형질 막 및 기생충 핵 막을 필요가 있다. 적절 한 DAPI 얼룩과 기생충의 flagellar 주머니 근처 미토 콘 드리 아 kinetoplast DNA 수 또한 구상 될, 핵 DNA 이외에.</li>
	<li>각 잘 coverslips 3를 포함 하는 워시 x 2 mL PBS-/-와 다음 리프트 및 셀 측면 내려 놓고 유리 현미경에 장착 하는 집게와 플립 coverslips 상용 antifade 장착 시 약으로 슬라이드. 참고: Coverslips는 충격에 약 하 고 신중한 처리가 필요. 특히 운동 할 때 우물의 측 벽에 대하여 그들에 압박 하지 마십시오. -/-PBS의 몇 방울을 추가 coverslip 잘 사이 표면 장력을 감소 시킨다 고 드는 프로세스. 정밀한 계기 바늘 캐 잘 아래쪽에서 coverslips을 지원 하기 위해 사용할 수 있습니다. 슬라이드에는 coverslip 후, 부드럽게 눌러 집게와 설치 미디어에서 모든 기포를 밖으로 밀어. 경우는 coverslip 고장 또는 드는 과정 성을 상실 가능성이 있다, 다시 탑재 하지 마십시오; 예비 4 coverslip을 사용 합니다.</li>
	<li>부 량까지 슬라이드를 냉동.</li>
</ol>6. 감염 정량화
<ol><li>침수 기름으로 100 X 렌즈를 사용 하 여 대 식 세포에 초점을 맞춤 으로써 DAPI 스테인드 슬라이드 형광 현미경 검사 (358에서 여기 nm; 461에 최적의 방출 nm). 초점 유리 슬라이드와 coverslip 사이 세포의 층에 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>대 식 세포 (큰 핵 DAPI 물)의 수 및 작은 amastigote 핵 각 대 식 세포 핵 주변 수 계량 ( 그림 2A, DAPI 참조) 각 분야의 비전에 대 한 수동 카운터를 사용 하 여. 참고: Amastigote 핵 모두 볼 수 있습니다 그들의 작은 크기로 인해 초점의 1 개의 비행기에. 그 때 대 식 세포 핵에 집중 되 고 정밀한 초점을 사용 하 여 평면 위에 그리고 대 식 세포 핵 아래에 기생충 핵에 대 한 확인.</li>
	<li>정량화를 반복 다른 시야를 이동 합니다. 별도 카운터의 키를 사용 하 여 계산 하는 필드 수를 추적 하. 방지 하기 위해 각 coverslip 걸쳐 병렬 행에서 시각 필드를 통해 이동 중복 계산.</li>
	<li>계량 coverslip 당 200 대의 최소. 각 시간-포인트 3 (3 coverslips) 중에서 감염의 계량. 이전 중 coverslip 중복, 불 쌍 한 설치, 유리 파손, 등 계산에 적합 하지 않으면 4 coverslip 계산 참고: 200 대 식 세포는 어떤 하나의 coverslip에 계산 될 수 없습니다, 경우 계산 여분 4.</li>
	<li>Amastigotes/100 amastigotes/대 식 세포 또는 대 식 세포로 감염 속도 계산 하 고 원시 정량화 데이터로 % 감염 된 세포를 결정 합니다.</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언

위에서 설명한 BMM 감염 분석 결과 의해 생성 하는 양적 데이터 수 감염 속도 상대적으로 짧은 기간 (최대 2 주, 2에 비해 독성 속성에서 변경의 신뢰할 수 있는 결정을 조사 개월 vivo에서 실험에 필요한). 이 방법은 DNA 특정 염료 DAPI는 특히 대 식 세포 및 기생충 핵, 얼룩 및 신속한 식별 및 감염 된 세포의 정량화를 허용에 의존 합니다. 비교, Giemsa 같은 다른 얼룩 시각적 분석37</su...

Leishmaniasis는 protozoan 기생충 종의 속 Leishmania로 인 한 인간의 질병의 광범위 한 스펙트럼을 말합니다. 약 12만 명이 현재 감염 된 Leishmania 전세계, 그리고 350만 이상의 위험이 있습니다. 질병 병리학 Leishmania 종에 고 호스트 요인에 따라 그리고 증상 무해 한 자기 치유 피부 병 변에서 치명적인 visceralizing 형태 다. 최악의 인간 질병으로 말라리아 후 순위 protozoan 기생충1감염에의 한 치료, 내장 leishmaniasis 치명적인 경우. 질병 병 리와 증상에 광범위 한 차이도 불구 하 고 모든 Leishmania 종 digenic 수명-주기 promastigote의 amastigote 곤충 내부 단계와 척추 호스트를 각각 교대로 있다. 내부 척추 동물, Leishmania 침공에 대 한 호스트 세포를 대상 하 고 parasitophorous 그들 (PVs), 높은 악성의 amastigote 형태의 복제 속성 phagolysosomes의 산 성 구획의 형성을 유발. Amastigotes 만성 감염 시 호스트 조직에서 유지 하 고 전달 될 수 있는 감염 되지 않은 앞으로 sandflies, 전송 주기를 완료. 따라서, 인간의 질병 개발의 맥락에서 amastigotes는 가장 중요 한 Leishmania 생명주 기 양식2. Amastigotes 대 식 세포 증후군 내부 복제 하는 방법을 조사 하는 것이 중요 이해 Leishmania 독성3,,45,,67 와 새로운 효능 요법의 개발입니다.
여기 정기적으로 Leishmania 감염 및 시간이 지남에 세포내 Leishmania 수의 양적 평가 포함 하는 골 수 유래 세포 (BMMs)에서 복제 연구를 우리의 실험실에 의해 사용 되는 방법을 설명 합니다. 과정 포함 Leishmania 그리고 부 량의 문화에서 대 식 세포, 생체 외에서 감염 감염 형태 (metacyclic promastigotes 또는 amastigotes)와 마우스 골 수에서 분화 monocytes의 수확은 세포내 기생충 감염 다음 72 96 h의 기간에 대 한 모든 24 시간 간격의 수입니다. 이 분석 결과 여러 환경 요인 및 기생충의 유전자, 노상 강도 의해 더 확인 되었다 L. amazonensis 독성을 홍보에 철의 중요 한 역할의 식별을 포함 하 여 영향을 확인 하기 위해 우리의 실험실에서 사용 되었습니다. 마우스6,,89,10,11,12,13,14,15 병 변 개발 연구 . 때문에 모든 병원 성 Leishmania 종 설정할 호스트 세포 안에 그들의 일차 틈새,이 분석 결과 모든 Leishmania 종에서 독성 결정에 대 한 보편적으로 사용할 수 있습니다.
BMM 감염 수행 단일 세포 수준에서 호스트-기생충 상호 작용의 분석 및 따라서 Leishmania 기생충 그들의 기본 설정된 호스트 microenvironment, 대 식 세포의 PVs 상호 작용 하는 방법에 대 한 더 광범위 한 이해를 수 있습니다. 대 식 세포 감염 분석 실험 성공적으로 사용 되었습니다 여러 그룹16,17,18,19,20,,2122 탐험 호스트 macrophage Leishmania 특정 유전자와 세포내 감염 특징 복잡 한 상호 작용에 있는 그들의 잠재적인 관련 기능. BMM 감염 microbicidal 산화 질소 생산, 반응성 산소 종의 생성 및 다른 조건 같은 세포내 생존에 영향을 주는 호스트 요인의 영향에의 한 읽기로 기생충 성장의 정량화를 허용 리소좀-같은 PVs23내부 발생 했습니다. 대 식 세포 감염 분석 치료 개발13,24에 대 한 잠재적인 안티 leishmanial 마약 단서를 식별 하도 이용 되어 있다.
BMM 감염의 생체 외에서 특성 Leishmania 독성을 평가 하기 위해 다른 방법에 비해 몇 가지 이점이 있습니다. 그러나, 시간이 지남에 세포내 기생충 생존의 메커니즘을 검토 하는 여러 이전의 연구 속도20,,2124로 감염을 계량 하지 않았다. 또한, 시간이 지남에 vivo에서 감염 다음에 초점을 맞춘 많은 연구 그렇게 피부 병 변의 크기와 직접 관련 없는 기생충 복제25,26 다른 생리 적인 증상을 측정 하 여 , 27. vivo에서 감염 기생충 독성 평가에 대 한 엄격한 접근 이지만 혼자 붓기 노상 강도에 따라 병 변 크기 측정은 종종 적절 한, 그들은 감염 된 조직에서 염증 반응을 반영 하지는 기생충의 절대 수입니다. 따라서, 노상 강도 병 변 개발 분석 뒤에 감염 된 조직, 기생충 부하의 정량화 해야 긴 제한 희석을 요구 하는 절차는28분석 실험. 또한, vivo에서 연구는 종종 포함 관심6,,89,10, 의 조직 추출 하는 시간에 서로 다른 지점에서 여러 동물을 희생 11 , 13. 대조적으로, BMMs의 다 수는 단지 하나의 동물에서 얻어질 수 있다 고이 세포는 다양 한 지점에서 시간에 감염의 평가 허용 하는 조건에서 도금 될 수 있다. 또한, vivo에서 연구에 비해, 실험 조건 제어가 있습니다 BMM 감염 체 외에서 수행. 스스로 기생충 함께 감염 되는 세포를 측정 복합성 감염 (MOI)의 문화 조건 정확 하 게 제어할 수 있습니다. 이러한 요소를 세밀 하 게 제어 키 이산 세포질 통로의 특성을 식별 하 고 감염의 과정에 미치는 영향을 이해 하실 수 있습니다.
이러한 이점을 감안할 때, 그것은 다소 놀라운 Leishmania 독성을 공부 하는 아주 몇몇 그룹 세포에서 세포내 복제의 양적 평가의 활용을 찍은 지금까지 있다. 이 문서에서는, 우리는이 분석 결과의 더 광범위 한 이용을 저해 하 고 적절 한 구현을 촉진 하기 위하여 단계별 프로토콜을 제공 수 있습니다 일반적인 함정 토론. 정밀도 및 다양성을 고려 하면 우리가 여기 설명 BMM 감염 분석 결과 하지만 이용 될 수 있다 탐험 Leishmania 독성에 영향을 미치는 호스트 병원 체 상호 작용 뿐만 아니라 내부 복제 하는 다른 미생물을 공부 하 대 식 세포29 중요 한 것은,이 분석 결과 또한 안티-leishmanial 약물 개발에 대 한 신속 하 고 경제적인 전 임상 스크리닝 방법으로 개발할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC147440250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10</td>
			<td>Aspen Surgical</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide Needle, 25G&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>627 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flask</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses: 12 mm circles</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Biotin</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>C272-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Texas red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry Co. LTD</td>
			<td>H0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoton II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (-/-)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14200166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Lamp-1 antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Bright-Line&#160; Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 Surfactant</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TX1568-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Scissors, 4 1/2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps, Fine Tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605699</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of intracellular growth inside macrophages is a fast and reliable method for assessing the virulence of leishmania parasites

Leishmania, leishmaniasis의 원인이 되는 에이전트의 수명 주기는 promastigote의 amastigote 곤충 내부 단계와 척추 호스트 간에 각각 대체 항목입니다. 모든 Leishmania 종의 척 추가 있는 단계 호스트 세포 안에 있는 leishmaniasis의 병원 성 증상이 널리, infective 수 종에 따라 매우 치명적인 내장 질병 형태에 양성 피부 병 변에서 다를 수 있습니다. 그들의 수명 주기입니다. Leishmania infectivity은 따라서 직접 관련이 침공, 생존과 parasitophorous 그들 (PVs) 대 식 세포 내에서 복제 하는 기능. 따라서, 독성을 결정 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법으로 제공 침 복제 하는 기생충의 능력을 평가 합니다. Leishmaniasis 개발 동물 모델을 사용 하 여 공부 하는 것은, 지루한 자주 하기가 어렵고, 특히 pathogenically 중요 한 내장 형태 와입니다. 여기 골 수 유래 세포 (BMMs)에 세포내 Leishmania 개발을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 세포내 기생충 숫자 72 96 h 다음 감염에 대 한 24 시간 간격에 따라 결정 됩니다. 이 메서드는 Leishmania 독성에 다양 한 유전적 요인의 영향의 신뢰할 수 있는 결정에 대 한 수 있습니다. 예를 들어, 우리가 어떻게 Leishmania 미토 콘 드리 아 철 운송업 자 유전자 (LMIT1)의 단일 대립 유전자 삭제 손상 수 Leishmania amazonensis 돌연변이 스트레인 LMIT1/ΔLmit1 의 BMMs, 내부 성장 보여 야생-타입에 비해 독성에서의 급격 한 감소를 반영 합니다. 이 분석 결과 또한 호스트 병원 체 상호 작용에 다양 한 요인 (영양소, 반응성 산소 종 등)의 영향을 분석을 개별적으로 조작할 수 있습니다 실험 조건 정확 하 게 제어할 수 있습니다. 따라서, 적절 한 실행 및 BMM 감염 연구의 정량화 기존의 동물 모델 연구에 대 한 비-침략 적, 급속 한, 경제, 안전 하 고 안정적인 대안을 제공합니다.

Leishmania 는 두 감염 양식-문화, 고정 단계에서 procyclic promastigotes에서 차별화 하는 metacyclic promastigotes 및 amastigotes, 세포내 단계 (그림 1). L. amazonensis같은 일부 Leishmania 종, amastigotes 또한 분화 될 수 있다 axenic 문화에 낮은 pH (4.5)과 온도 (32 ° C) 조건 BMM PVs 안에서 발견 된 것과 유사한 promastigote 셀을 이동 하 여 8 ...

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Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

모든 병원 성 Leishmania 종 있으며 그들의 척추 호스트의 세포 내부 복제. 여기, 선물이 Leishmania, 세포내 성장 속도의 정확한 정량화 다음으로 문화 murine 골 수 유래 세포를 감염 하는 프로토콜. 이 메서드는 호스트 병원 체 상호 작용 및 Leishmania 독성에 영향을 미치는 개별 요소를 공부 하는 데 유용.

대 식 세포 안의 세포내 성장의 정량화는 빠르고 Leishmania 기생충의 독성을 평가 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

10.4K 조회수.  University of Maryland. 모든 병원 성 Leishmania 종 있으며 그들의 척추 호스트의 세포 내부 복제. 여기, 선물이 Leishmania, 세포내 성장 속도의 정확한 정량화 다음으로 문화 murine 골 수 유래 세포를 감염 하는 프로토콜. 이 메서드는 호스트 병원 체 상호 작용 및 Leishmania 독성에 영향을 미치는 개별 요소를 공부 하는 데 유용.

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In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

라이브 호스트에 트렌스 제닉 Leishmania의 기생충의 생체내 이미징에서

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

연구

면역학 및 감염병학

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

세포에 붙어 Antileishmanial 검사에 대한 기생충 구조 및 변화 분석<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 인간 급성 백혈병 Monocytic 셀 라인에서&gt; Amastigotes

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

설립<em&gt; 체외</em&gt; 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em&gt; 칸디다 글라 브라</em&gt; 인간 THP-1 식세포에

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag : 높은 처리량 식민지 성장의 정량화 및 시간 지연

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

식 세포에서 세포내 복제에 대 한의 진 균 abscessus 독성 마커의 식별

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...