Name: rare event detection using error-corrected dna and rna sequencing
Uploaded: 2018-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing at JoVE.com

Katılımcılar çocuk Onkoloji grubu AAML1531 çalışma ve hemşirelerin sağlık eğitim hasta numuneleri şeklinde katkılarından dolayı teşekkür ediyoruz. Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri (UM1 CA186107, RO1 CA49449 ve RO1 CA149445), çocukların Discovery Enstitüsü Washington Üniversitesi ve St. Louis Çocuk Hastanesi (MC-II-2015-461) ve Eli Seth Matthews Lösemi Vakfı tarafından finanse edildi.

<ol>
	<li>Hoang, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+quantification+of+rare+somatic+mutations+in+normal+tissues+using+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide quantification of rare somatic mutations in normal tissues using massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113, 9846-9851 (2016).</li><li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporadic+autism+exomes+reveal+a+highly+interconnected+protein+network+of+de+novo+mutations.">Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations.</a> Nature. 485, 246-250 (2012).</li><li>Young, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+ultra-rare+pre-leukemic+clones+via+targeted+error-corrected+sequencing.">Quantifying ultra-rare pre-leukemic clones via targeted error-corrected sequencing.</a> Leukemia. 29 (7), 1608-1611 (2015).</li><li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+harbouring+AML-associated+mutations+is+ubiquitous+in+healthy+adults.">Clonal hematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> NatureCommunications. 7, 12484 (2016).</li><li>Patel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+relevance+of+integrated+genetic+profiling+in+acute+myeloid+leukemia.">Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 366, 1079-1089 (2012).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nature Biotechnology. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li><li>Kohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+residual+disease+by+next-generation+deep-sequencing+of+RUNX1+mutations+can+identify+acute+myeloid+leukemia+patients+with+resistant+disease.">Monitoring of residual disease by next-generation deep-sequencing of RUNX1 mutations can identify acute myeloid leukemia patients with resistant disease.</a> Leukemia. 28, 129-137 (2014).</li><li>Luthra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing-based+multigene+mutational+screening+for+acute+myeloid+leukemia+using+MiSeq:+applicability+for+diagnostics+and+disease+monitoring.">Next-generation sequencing-based multigene mutational screening for acute myeloid leukemia using MiSeq: applicability for diagnostics and disease monitoring.</a> Haematologica. 99, 465-473 (2014).</li><li>Kinde, I., Wu, J., Papadopoulos, N., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+rare+mutations+with+massively+parallel+sequencing.">Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (23), 9530-9535 (2011).</li><li>Schmitt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing.">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (36), 14508-14513 (2012).</li><li>Vander Heiden, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pRESTO:+a+toolkit+for+processing+high-throughput+sequencing+raw+reads+of+lymphocyte+receptor+repertoires.">pRESTO: a toolkit for processing high-throughput sequencing raw reads of lymphocyte receptor repertoires.</a> Bioinformatics. 30 (13), 1930-1932 (2014).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+digital+error+suppression+for+improved+detection+of+circulating+tumor+DNA.">Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA.</a> NatureBiotechnology. 34, 547-555 (2016).</li><li>Shugay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAGERI:+Computational+pipeline+for+molecular-barcoded+targeted+resequencing.">MAGERI: Computational pipeline for molecular-barcoded targeted resequencing.</a> PLOSComputationalBiology. 13 (5), e1005480 (2017).</li><li>Wong, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+TP53+mutations+in+the+origin+and+evolution+of+therapy-related+acute+myeloid+leukaemia.">Role of TP53 mutations in the origin and evolution of therapy-related acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 518, 552-555 (2014).</li><li>Krimmel, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-deep+sequencing+detects+ovarian+cancer+cells+in+peritoneal+fluid+and+reveals+somatic+TP53+mutations+in+noncancerous+tissues.">Ultra-deep sequencing detects ovarian cancer cells in peritoneal fluid and reveals somatic TP53 mutations in noncancerous tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (21), 6005-6010 (2016).</li><li>Phallen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+of+early-stage+cancers+using+circulating+tumor+DNA.">Direct detection of early-stage cancers using circulating tumor DNA.</a> ScienceTranslationalMedicine. 9, eaan2415 (2017).</li><li>Egorov, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+immune+repertoires+for+minor+lymphocyte+counts+using+unique+molecular+identifiers.">Quantitative profiling of immune repertoires for minor lymphocyte counts using unique molecular identifiers.</a> The Journal of Immunology. 194 (12), 6155-6163 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, biz mutasyonlar farklı hastalıklarda düşük VAFs ile çalışmaya kolayca uygulanabilir sıralama hatası düzeltildi protokol paketi olan göstermek. Hata düzeltme, ham okuma seçeneğini etkinleştirin UMIs birleşme sıralama önce her molekül ile en önemli faktör olduğunu. Yöntem tanımlamak burada araştırmacılar için piyasada bulunan gen panelleri ve kendi kendine tasarlanmış gene özgü oligos özelleştirilmiş UMIs dahil etmek izin verir.
Standart NGS protokol nedeniyle sıralama hata oranı % 2'in altında VAF ile mutasyonlar algılanmasını önler ve bu NGS uygulama nadir türevleri algılanması çok önemli nerede çalışmalarda sınırlar. Standart NGS hata oranı engellemeyi tarafından ECS hassas bu ham çeşitleri tespiti sağlar. Örneğin, Bu mutasyonlar ilk (Bu nedenle düşük VAF sahip) ortaya çıkan zaman patojenik mutasyon tespiti hastalığı14,15erken müdahale bilgi vermeleri zorunludur. Lösemi araştırma, çok az kalıntı tespiti hastalığı (rezidüel lösemi hücreleri tedavi sonrası) risk stratifikasyon bilgilendirir ve tedavi seçenekleri ikili akış sitometrik değerlendirmeler cant bir şekilde bilgilendirmek için kullanılabilir. Buna ek olarak, ECS dolaşımdaki tümör nükleik asit algılamaya ve varlığı/olmaması için hem de birincil özellikleridir belirli mutasyonların varyant yük değerlendirmek tarafından solid tümör hastalarda metastatik potansiyeli değerlendirmek için geçerlidir tümör16.
Tablo 1' de gösterildiği gibi türevlerini aramak için konum özgü hata binom dağılımı tabanlı modeli kullanarak güç büyük ölçüde sıralı kitaplıkları sayısı gibi yanı sıra hata model oluşturmak için kullanılan sıralama derinliği bağlıdır. Hata modeli sağlamlık daha yüksek sayıda örnekleri ve daha fazla sıralama derinliği artar. Her örnek için bir hata profili oluşturmak için Ortalama hata düzeltilmiş örnek başına 3000 x okuma kapsamını ile en az 10 sıralı örnekleri kullanmak için tavsiye edilir. Pozisyon özel yaklaşım benzer MAGERI, ancak tüm altı farklı ikame türler için bir toplama hata oranı kullanarak yerine (A > C/T > G, A > G/T > C, A > T/T > A, C > A/G > T, C > G/G > C C > T/G > A)13, her konumda bağımsız olarak her ikame modeli. Örneğin, bir hata oranı c > T belirli bir genomik pozisyonda başka bir konumdan farklı. Gibi bir sıralama vadede gözlenen temel ikame oranı çalıştırmak diğerinden farklı olabilir bizim yaklaşım bir sıralama toplu etkisi de dikkate alır. Bu nedenle özellikle farklı sıralama çalıştırır örnekleri model oluşturmak için havuza zaman her pozisyon için tüm yerine koyma türleri modellemek önemlidir.
Ne zaman bir ECS deney tasarımı önemli bir göz istediğiniz algılama eşik var. NGS çalışmaların onlar kolayca genler/hedefleri açısından faiz, algılama eşiği (sıralama derinliği tarafından dikte) ve sorgulanan sayisi ölçeklendirilebilir güzelliktir. Araştırmacılar 0,0001 bir algılama eşiği ile iki amplicons nadir mutasyonlar bulmak istiyorsanız, örneğin, onlar sonuna kadar 75 örnekleri 15 milyon okuma çıkarır MiSeq V2 Kimya'yı kullanarak çalışacak tek bir sıralama havuz (2 amplicons * 10.000 molekülleri * 10 okur hata düzeltme için * 75 örnekleri 15 milyon sıralama okuma =). Araştırmacılar, sıralama veya algılama eşik ayarlamak için çalıştırmak tek bir sıralama içinde havuza alınan örnek sayısına içine gidip moleküllerin bu sayı değişebilir. Çalışmalarımız, biz 0.0001 VAF (1:10, 000) ile bir algılama eşiği mutasyonlar bulmaya yönelik Illumina gen panelini kullanarak. Biz düzenli olarak 250 kullanmak yeterli molekülleri yukarıda belirtilen algılama eşik ulaşmak için yakalanır emin olmak için DNA başlatma ng. Araştırmacılar daha düşük miktarda DNA ile başlatmak için tercih (50 ng önerilir) istenen algılama sınırı ise > 0,001 VAF.
UMIs i5 dizinler eklenir gibi sıralama ayarları buna göre değiştirilmesi gerekir. Örneğin, 16 N UMIs kullandık ve sıralama ayarlarını 2 x 144 eşleştirilmiş son okuma, Dizin 1 8 döngüleri ve 16 döngüleri dizin 2 dizin 2 her zamanki 8 döngüleri karşı vardı. Dizin 2 döngüsü artış döngüsü okur için ayrılan toplam sayısı bir düşüş eşitlenmektedir. Araştırmacılar 12N UMIs10,17kullanmayı seçerseniz, dizin 2 12 döngüleri ayarlarının değiştirilmesi gerekir.
Bu UMI tabanlı sıralama yöntemi sıralama hatalarını düzeltmek için optimize edilmiştir. Suboptimal PCR jackpotting ile ilgili olan tüm amplifikasyon tabanlı yöntemi için bir sorun olduğunu kalır. Biz sonrası sıralama ve post-Biyoinformatik doğrulama ddPCR kullanarak gerçekleştirilen ve neredeyse herhangi bir yanlış pozitif PCR jackpotting nedeniyle tespit. Bununla birlikte, araştırmacılar düşük amplifikasyon hataları emin olmak için yüksek sadakat polimeraz kullanarak deneyler yapmak önerilir.

Biz yaş, mutajen ve somatik aberasyonları genom ve bu birikimi sonucunda hücre bölünmesi sırasında Stokastik hataları maruz altında yatan malign transformasyon, temel patogenezinde nöro-gelişimsel hastalıkları, pediyatrik bozuklukları ve normal yaşlanma1,2. Somatik mutasyon hastalık sürüş potansiyeli olan erken teşhis ve risk yönetimi3,4,5önemli tanılama ve prognostik biyolojik vardır. Fizyolojik clonogenesis daha iyi anlamak için hangi klinik bilgilendirmek ve kararları, doğru miktar ve bu mutasyonlar karakterizasyonu araştırma birincil önem taşımaktadır. Yeni nesil sıralama (NGS) Şu anda türdeş olmayan DNA örnekleri klonal mutasyonların incelemek için kullanılır; Ancak, NGS mutasyonlar, belirlenmesi için sınırlıdır > 0,02 varyant alleli kesir (VAF) — nedeniyle 0.5-2.0 içsel hata oranını % sıralama platformları6,7,8. Sonuç olarak, takip eden ve prognostically önemli somatik değişik alt VAF adlı standart NGS kullanarak elde edilemez.
Son zamanlarda, hata oranı NGS8,9,10,11aşmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemleri kullanmak moleküler etiketleme, hata düzeltme sonra sıralama sağlar. Her molekül veya sıralama kitaplığı'genomik parça ile bir rasgele benzersiz moleküler tanımlayıcı (Bu molekül özgü UMI) etiketlenir. UMIs bir dizi randomize nükleotit (8-16 H) permütasyon tarafından inşa edilir. İkinci bir örnek özgü barkod Ayrıca birden fazla örnekleri çalıştırmak aynı NGS sıralama içine çoğullama sağlar iş akışı içine entegre edilmiştir. PCR güçlendirme tatlı öğesini Kütüphane üzerinde gerçekleştirilir ve daha sonra kütüphane sıralama için gönderilir. Kütüphane hazırlık sırasında bu hata rastgele genomik parçası PCR güçlendirme ve sıralama8sırasında tanıtılacaktır bekleniyor. Rasgele sıralama hatalarını kaldırmak için ham sıralama okuma UMI göre gruplandırılır. Sıralama yapılardan ise gerçek bir değişken sadakatle güçlendirilmiş ve aynı UMI paylaşan tüm okur sıralı konumunda aynı genomik Stokastik olması nedeniyle giriş, aynı UMI ile tüm okuma bulunması beklenen değil. Eserleri kaldırıldı bioinformatically vardır. Burada, biz üç yöntem, hata düzeltilmiş sıralama (Laboratuvar tek nükleotid türevleri (SNVs) ve küçük ekleme-silme (Indels) tanımlamak DNA ve RNA gen ifade aşağıdaki miktar kolaylaştırmak en iyi duruma getirilmiş ECS) tarif NGS hata eşiği.
İlk yöntem nadir somatik olay araştırmacılar tarafından tasarlanmış gen belirli primerler kullanılarak aramak için bir yol anlatılmaktadır. Kütüphane hazırlık önce araştırmacılar faiz parçaları hedeflemek için astar tasarlamalısınız. Biz web-app Primer3 kullanılan (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). UMIs dahil edilmiştir bir kez bunlar olacak gibi Amplicons 200-250 BP polimeraz zincir tepkimesi (PCR) için ideal, eşleştirilmiş uç okuma 150 bp eşleştirilmiş uç okuma ile örtüşen oluşturmak. Kullanılacak en uygun astar tasarım koşullar: en az astar boyutu = 19; En uygun astar boyutu = 25; Maksimum astar boyutu = 30; En az Tm = 64 ° C; Optimum Tm = 70 ° C; Maksimum Tm = 74 ° C; En fazla Tm farkı = 5 ° C; En az GC içerik = 45; Maksimum GC oranı = 80; Dönmek için sayı = 20; En fazla 3' sonunda istikrar = 100.
Yöntem 2'de, Illumina Kimya klonal SNVs ve küçük Indels gibi amplicons yüzlerce içerir ticari olarak mevcut Gen panellerini kullanarak 0.0001 VAF nadir için anket için ECS-DNA Protokolü birleştiren bir yöntem açıklanmaktadır. Biz TruSight Myeloid sıralama paneli (Illumina) bizim deneme için kullanılan ve genişletilmiş bir masası çocuk miyeloid hastalıkları için ilgi ek genler dahil etmek için tasarlanmış. Bu paneller biz bu paneller için bağdaştırıcı stratejimiz ekledik böylece hata düzeltme, kolaylaştırmak moleküler benzersiz tanımlayıcıları (UMIs) teklif değil. ECS-meli iş herhangi bir farklı hastalıklar ile ilişkili genler için zenginleştirmek için tasarlanmış diğer paneller ile eşit derecede iyi. DNA izolasyon ve sonraki miktar doku veya örnek ilgi önerilir en az 500 için ng stok numune DNA. Biz düzenli olarak 250 kullanarak bir tek sıralama kitaplığı yapmak için mümkün olduğunca çok benzersiz genomik parçası olarak aşağı yakalamak için DNA'ın ng okur de-çoğaltma ve VAF hesaplama. Bir isteğe bağlı çoğaltma sıralama kitaplığı kalan 250 ile yapılan DNA'ın ng. Biz her zaman örnek başına iki Çoğalt kitaplık yapmak ve biz bağımsız olarak her iki çoğaltır gerçek pozitif olarak tespit olayları düşünün. Ayrıca değişken4,13arama doğruluğunu artırmak için genomik pozisyon özgü binom hata modeli uygulanır.
Son olarak, biz kapalı QIAseq hedef RNA panelleri (QIAGEN) kullanarak transkript miktar için RNA sıralama için ECS kaplin bir yöntem açıklanmaktadır. UMIs de-çoğaltma için gerekli ve hata düzeltme kitleri dahil ve araştırmacılar kitaplıkları üreticinin önerilerini takip yapabilirsiniz. Bioinformatically, araştırmacılar Protokolü bölümünde ayrıntılı olarak açıklanacaktır ECS-DNA için özetlenen boru hattı takip edebilirsiniz.

<table><tbody><tr><td>Q5 High Fidelity Hot Start Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Truseq Custom Amplicon Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td></td></tr><tr><td>UMI i5 adapter sequences</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7442S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Ligation Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7595S</td><td></td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864034</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864005</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Digital PCR System</td><td>Bio-Rad</td><td>1864001</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96-Well Plates</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>TruSight Myeloid Sequencing Panel</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1010</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie 2</td><td>Johns Hopkins University</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Customized QIAseq Targeted RNA Panel</td><td>Qiagen</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Plus Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr></tbody></table>

rare event detection using error-corrected dna and rna sequencing

Geleneksel yeni nesil sıralama teknikleri (NGS) için bir on yıl içinde muazzam genomik karakterizasyonu için izin vermiş. Özellikle, NGS klonal mutasyonlar spektrum malignite çözümlemek için kullanılan. Yine de çok daha verimli geleneksel Sanger yöntemleri, nadir klonal ve subclonal mutasyonlarının ~0.5–2.0 oranında onun yüksek hata nedeniyle belirlenmesi ile NGS mücadele daha. Böylece, standart NGS algılaması olan mutasyonlar için bir sınırı vardır > 0,02 varyant alleli kesir (VAF). Bilinen hastalık belirsizdir olmadan artık hastalık olduğunda mutasyonlar bu hastalarda nadir için klinik önemi ise lösemi için tedavi edilen hastaların önemli ölçüde sonuçlar iyileştirilmiştir < 0,0001 akış sitometresi tarafından. NGS artefactual bu arka plan azaltmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Burada hata düzeltilmiş DNA ve RNA sıralama (hata düzeltme için 16 bp rasgele dizindeki ve çoğullama için 8 bp hastaya özgü dizin ile bireysel moleküllerin etiketleme içerir ECS), için bir yöntem açıklanmaktadır. Bizim Yöntem algılamak ve varyant alleli kesirler (VAFs) iki büyüklük NGS algılama sınırı daha düşük ve 0.0001 VAF gibi nadir, klonal mutasyonlar izlemek.

Targeted Error-corrected sıralama ile DNA'ın, mutant hasta DNA ticari genomik DNA'sında sulandrarak prensibi deneyi bir kanıtı gerçekleştirdiniz. Hasta bir mutasyon GATA1 vardı (chrX:48650264, C > G) orijinal VAF 0.19 ile. Şekil 1 ' de ECS 1:10,000 tek nükleotid varyant için bir seviye için nicel olduğunu ispat.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig1.jpg"> Şekil 1: ECS 1:10,000 seviyeye nicel GATA1 SNV gösteren seyreltme dizi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Biz de ECS-DNA güvenilir içinde yetişkin akut miyeloid lösemi (AML) sağlıklı yaşlı bireylerin4yerleştirilmiştir genlerinde klonal mutasyonlar nadir algılar gösterir. Biz 20 sağlıklı bireyler hemşirenin sağlık kabaca ~ 10 yıl arayla banked çalışmada buffy ceket örnekleri aldı. Biz bu örnekler üzerinde ECS-DNA paneli iletişim kuralı uygulanır. Bu deneme için Illumina TruSight Myeloid sıralama 568 amplicons (https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html gen listesi hakkında daha fazla bilgi) oluşan Panel uyarlanmış ve sıralı 20 bireylerin 80 kitaplıkları (2 koleksiyon farklı zaman noktalarda bağımsız birim zamanda başına 2 çoğaltır işaret ederek) 47,7 milyon eşleştirilmiş uç okuma ortalama ve ortalama 3.4 milyon hata düzeltilmiş oluşturulan Illumina NextSeq platformu kullanarak her kütüphane4için fikir birliği serileri. Kütüphane başına ortalama nükleotit kapsama yaklaşık 6.000 x (3.4 milyon 568 tarafından bölünmüş) yapıldı. Her örnek için bir pozisyon özgü hata profil aynı örnekten olmayan sıralı kitaplıklarını kullanma inşa. En az bir koleksiyon zaman noktası her iki çoğaltır içinde mevcut 109 klonal somatik mutasyon bulduk. Bu mutasyonlar VAF 0,0003-0.1451 değişen var. Biz bilinen kozmik temsilcilikleri ile 21 mutasyonlar seçili ve ddPCR kullanarak bir ya da iki koleksiyon zaman noktalarının tüm 21 mutasyonların doğrulanmış (n = 34, Şekil 2, Genç ve ark. 20164den uyarlanmıştır).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig2.jpg"> Şekil 2: ECS tarafından tanımlanan mutasyonlar ddPCR ile son derece uyumlu VAFs üzerinden doğrulanmadı. (n = 34, Genç ve ark. 20164modifiye). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
ECS-RNA protokolünü kullanarak hata düzeltilmiş ifade düzeyi ile ilgili çeşitli kanserler (QIAseq insan kanser Transcriptome Masası'ndan uyarlama) ve biz ile ilişkili olduğu bilinen 416 genler oluşur QIAseq kimya kullanarak bir gen panel özelleştirilmiş belirli bir gen ( ek malzeme 1gen listesinde) en sık ifade exon güçlendirilmiş. Biz Kütüphane ortalama 8.3 milyon okur verdi eşleştirilmiş uç biçiminde Illumina MiSeq platformu kullanarak kitaplıkları sıralı ve 0.417 milyon hata düzeltilmiş fikir birliği dizileri ortalama yakalamak başardı. Biz gösterdi ki düşük bereket transkript ifade düzeyini (< 1.000 transkript sayısı 50 ng toplam RNA) çoğaltır arasında son derece tekrarlanabilir (veri noktası n = 300, Şekil 3). DdPCR (ifade değişen ölçüde altı seçili genler) doğrulanması bu genlerin ifade düzeyini doğru şekilde normalleştirme için gerek kalmadan ECS protokolü tarafından ele geçirilen gösterdi.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig3.jpg"> Şekil 3: Top, transkript korelasyon sayar ECS-RNA tarafından aynı örnek çoğaltır arasında (n = 300). Alt, sayıları ECS tarafından tespit ddPCR tarafından doğrulanmadı transkript (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing at JoVE.com

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Yeni nesil sıralama (NGS) platformu (~0.5–2.0%) yüksek hata oranı tarafından sınırlı genomik karakterizasyonu için güçlü bir araçtır. NGS hata oranı önlemek ve mutasyonlar varyant alleli kesirler 0,0001 nadir, tespit etmemize izin bizim hata düzeltilmiş sıralama yöntemleri açıklanmaktadır.

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

rare-event-detection-using-error-corrected-dna-and-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Genetics

11.9K Görüntüleme.  Washington University School of Medicine. Yeni nesil sıralama (NGS) platformu (~0.5–2.0%) yüksek hata oranı tarafından sınırlı genomik karakterizasyonu için güçlü bir araçtır. NGS hata oranı önlemek ve mutasyonlar varyant alleli kesirler 0,0001 nadir, tespit etmemize izin bizim hata düzeltilmiş sıralama yöntemleri açıklanmaktadır.

Video: Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging resistance mutations during therapy, or when patients have few circulating tumor cells. Wild-type blocking PCR followed by sequencing analysis offers high sensitivity, flexibility, and simplicity as a methodology for detecting these low frequency mutations. By adding a custom designed locked nucleic acid oligonucleotide to a new or previously established conventional PCR based sequencing assay, sensitivities of approximately 1 mutant allele in a background of 1,000 WT alleles can be achieved (1:1,000). Sequencing artifacts associated with deamination events commonly found in formalin fixed paraffin embedded tissues can be partially remedied by the use of uracil DNA glycosylase during extraction steps. The optimized protocol here is specific for detecting MYD88 mutation, but can serve as a template to design any WTB-PCR assay. Advantages of the WTB-PCR assay over other commonly utilized assays for the detection of low frequency mutations including allele specific PCR and real-time quantitative PCR include fewer occurrences of false positives, greater flexibility and ease of implementation, and the ability to detect both known and unknown mutations.

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Yabani tip PCR Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonlar Tespiti için oldukça hassas bir yöntem olarak doğrudan bölme imkanı Kombine Engelleme

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Genetik

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). It provides accurate, sensitive, reliable, and reproducible results. Several factors can affect the sensitivity and specificity of RT-qPCR. Residual genomic DNA (gDNA) contaminating RNA samples is one of them. In gene expression analysis, non-specific amplification due to gDNA contamination will overestimate the abundance of transcript levels and can affect the RT-qPCR results. Generally, gDNA is detected by qRT-PCR using primer pairs annealing to intergenic regions or an intron of the gene of interest. Unfortunately, intron/exon annotations are not yet known for all genes from vertebrate, bacteria, protist, fungi, plant, and invertebrate metazoan species.
Here we present a protocol for detection of gDNA contamination in RNA samples by using ribosomal DNA (rDNA)-based primers. The method is based on the unique features of rDNA: their multigene nature, highly conserved sequences, and high frequency in the genome. Also as a case study, a unique set of primers were designed based on the conserved region of ribosomal DNA (rDNA) in the Poaceae family. The universality of these primer pairs was tested by melt curve analysis and agarose gel electrophoresis. Although our method explains how rDNA-based primers can be applied for the gDNA contamination assay in the Poaceae family,&#160;it could be easily used to other prokaryote and eukaryote species

Here, we present a protocol for tracing genomic DNA (gDNA) contamination in RNA samples. The presented method utilizes primers specific for the internal transcribed spacer region (ITS) of ribosomal DNA (rDNA) genes. The method is suited for reliable and sensitive detection of DNA contamination in most eukaryotes and prokaryotes.

DNA kirlenme ribozomal DNA tabanlı RNA örneklerinde değerlendirilmesi

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Kanser Araştırmaları

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Naked-Eye Detection of Rare Point Mutations in DNA

The protocol describes a naked-eye colorimetric test for the detection of somatic point mutations in an excess of wild type DNA. The future foreseen application of the method is the identification of rare mutations in circulating cell-free DNA from liquid biopsies, with a relevance in cancer diagnostics and stratification of oncological patients for personalized therapy. As a proof of concept, the test has been designed to detect the BRAFV600E mutation in the BRAF gene, which is important to identify the sub-group of melanoma patients that can benefit from targeted therapies with BRAF inhibitors. However, this colorimetric test can be easily generalized to other somatic mutations of clinical relevance due to the use of universal detection probes, thus providing strong potential in oncological diagnostics.
The test detects 0.5% of BRAFV600E in an excess of BRAFWT DNA, which matches the sensitivity of some commercial instrumental assays. Such sensitivity is clinically relevant for diagnostic purposes, allowing the early identification of drug-sensitive patients. In contrast to commercial assays based on real-time PCR, this test requires minimal instrumentation and processing, as it can be performed on DNA amplified with a standard PCR (or isothermal techniques) and provides a naked-eye readout with a one-tube reaction of a few steps in only one hour. At present, the test has been used only on synthetic DNA samples. However, the latter have been designed to mimic a real sample amplified from circulating cell-free DNA, to favor the translation of the test to clinical diagnostics.

This protocol permits the naked-eye identification of point mutated DNA in a 200-fold excess of wild type DNA molecules, by exploiting gold nanoparticles and paramagnetic microparticles.

The protocol describes a naked-eye colorimetric test for the detection of somatic point mutations in an excess of wild type DNA. The future foreseen ...

Biyokimya

<meta charset="utf8"></head><body>Vahşi Tip Engelleme PCR ile Düşük Frekanslı Mutasyon Tespitini Optimize Etme

Wild-type Blocking PCR Combined with Sanger Sequencing for Detection of Low-frequency Somatic Mutation

When monitoring minimal residual disease (MRD) after tumor treatment, there are higher requirements of the lower limit of detection than when detecting for drug resistance mutations and circulating tumor cell mutations during therapy. Traditional Sanger sequencing has 5%-20% wild-type mutation detection, so its limit of detection cannot meet the corresponding requirements. The wild-type blocking technologies that have been reported to overcome this include blocker displacement amplification (BDA), non-extendable locked nucleic acid (LNA), hot-spot-specific probes (HSSP), etc. These technologies use specific oligonucleotide sequences to block wild-type or recognize wild-type and then combine this with other methods to prevent wild-type amplification and amplify mutant amplification, leading to characteristics like high sensitivity, flexibility, and convenience. This protocol uses BDA, a wild-type blocking PCR combined with Sanger sequencing, to optimize the detection of RHOA G17V low-frequency somatic mutations, and the detection sensitivity can reach 0.5%, which can provide a basis for MRD monitoring of angioimmunoblastic T-cell lymphoma.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Gündemi: Kanser Dokularında Düşük Frekanslı Mutasyonların Tespitini İlerletmek

This article introduces the application of a low-frequency detection method based on Sanger sequencing in angioimmunoblastic lymphoma. Provide a basis for applying this method to other diseases.

Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonun Tespiti için Sanger Dizilimi ile Birleştirilmiş Vahşi Tip Bloke Edici PCR

When monitoring minimal residual disease (MRD) after tumor treatment, there are higher requirements of the lower limit of detection than when detecting ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any two individuals is greater than previously thought3. In contrast, array-based genotyping has failed to identify a significant contribution of common sequence variants to the phenotypic variability of common disease4,5. Taken together, these observations have led to the evolution of the Common Disease / Rare Variant hypothesis suggesting that the majority of the "missing heritability" in common and complex phenotypes is instead due to an individual's personal profile of rare or private DNA variants6-8. However, characterizing how rare variation impacts complex phenotypes requires the analysis of many affected individuals at many genomic loci, and is ideally compared to a similar survey in an unaffected cohort. Despite the sequencing power offered by today's platforms, a population-based survey of many genomic loci and the subsequent computational analysis required remains prohibitive for many investigators.
To address this need, we have developed a pooled sequencing approach1,9 and a novel software package1 for highly accurate rare variant detection from the resulting data. The ability to pool genomes from entire populations of affected individuals and survey the degree of genetic variation at multiple targeted regions in a single sequencing library provides excellent cost and time savings to traditional single-sample sequencing methodology. With a mean sequencing coverage per allele of 25-fold, our custom algorithm, SPLINTER, uses an internal variant calling control strategy to call insertions, deletions and substitutions up to four base pairs in length with high sensitivity and specificity from pools of up to 1 mutant allele in 500 individuals. Here we describe the method for preparing the pooled sequencing library followed by step-by-step instructions on how to use the SPLINTER package for pooled sequencing analysis (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). We show a comparison between pooled sequencing of 947 individuals, all of whom also underwent genome-wide array, at over 20kb of sequencing per person. Concordance between genotyping of tagged and novel variants called in the pooled sample were excellent. This method can be easily scaled up to any number of genomic loci and any number of individuals. By incorporating the internal positive and negative amplicon controls at ratios that mimic the population under study, the algorithm can be calibrated for optimal performance. This strategy can also be modified for use with hybridization capture or individual-specific barcodes and can be applied to the sequencing of naturally heterogeneous samples, such as tumor DNA.

Pooled DNA sequencing is a fast and cost-effective strategy to detect rare variants associated with complex phenotypes in large cohorts. Here we describe the computational analysis of pooled, next-generation sequencing of 32 cancer-related genes using the SPLINTER software package. This method is scalable, and applicable to any phenotype of interest.

SPLINTER kullanarak Pooled Sıralama gelen Nadir Genomik Variantların Algılama

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yabani tip PCR Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonlar Tespiti için oldukça hassas bir yöntem olarak doğrudan bölme imkanı Kombine Engelleme

DNA kirlenme ribozomal DNA tabanlı RNA örneklerinde değerlendirilmesi

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Naked-Eye Detection of Rare Point Mutations in DNA

Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonun Tespiti için Sanger Dizilimi ile Birleştirilmiş Vahşi Tip Bloke Edici PCR

Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonun Tespiti için Sanger Dizilimi ile Birleştirilmiş Vahşi Tip Bloke Edici PCR

Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonun Tespiti için Sanger Dizilimi ile Birleştirilmiş Vahşi Tip Bloke Edici PCR

SPLINTER kullanarak Pooled Sıralama gelen Nadir Genomik Variantların Algılama