Bu yöntem embriyolardaki kılavuz RNA'ları kontrol edebilir, erken gelişimsel soruları test edebilir veya düzenlenmiş fareler oluşturabilir. CRISPR Cas9'daki herhangi bir gelişme bu yöntemle kullanılabilir. Bu yöntemin temel avantajı, öğrenmenin kolay olması ve farelere erişimi olan laboratuvarlar için mevcut olan reaktifleri kullanmasıdır.
Gelecekte, bu teknik, eşlik eden bir hayvanın veya tarımla ilgili önemli bir hayvanın yavrularındaki bir hastalığı veya mutasyonu düzeltmek için yararlı olacaktır. Bu yöntem, fare modelleri oluşturmak için en uygun yöntemdir. Laboratuarımızda, döllenme ve erken preimplantasyon gelişimini, özellikle de embriyo potansiyelindeki gen düzenlemesini çevreleyen olayları araştırmak için bu yöntemin varyasyonlarını kullanıyoruz.
En zorlu kısım, embriyoları plakadan plakaya taşımak için cam iğneyi kullanmaktır. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımda bir araştırma uzmanı olan Chantal Diallo olacak. Embriyo toplama ve işlemeye başlamak için, ötenazi dişi fareyi sırtına yerleştirin ve cerrahi olarak açılacak karın üzerine% 70 etanol püskürtün.
Karın boşluğunu açmak ve yumurta kanallarını çıkarmak için cilt tabakasını cerrahi makasla kesin ve yumurtalıkları bulun. Daha sonra, yumurtalıklara proksimal olarak yerleştirilmiş her iki yumurta kanalını da cerrahi olarak çıkarın ve bunları M2 artı BSA ortamının bireysel 50 mikrolitrelik damlacıklarına yerleştirin. Bir stereo mikroskop altında, kümülüs-oosit komplekslerini veya oosit içeren COC'leri serbest bırakmak için yumurta kanalının ampullasını çentiklemek için diseksiyon forseps kullanın, daha sonra kalıntıların taşınmasını önlemek için, her bir kümülüs-oositi 20 ila 30 mikrolitreye ayarlanmış bir saplı pipetle tek bir 50 mikrolitrelik M2 artı BSA damlacığına aktarın ve birleştirin.
Daha sonra, kümülüs hücrelerini zigotlardan çıkarmak için, COC'leri biraz ekstra medya ile 100 mikrolitrelik M2 artı hyaluronidaz damlacığına aktarın ve embriyolar çok daha küçük kümülüs hücrelerinden gözle görülür şekilde ayrılana kadar pipetle hafifçe karıştırın. Hyaluronidizazı seyreltmek ve gevşek kümülüs hücrelerini temizlemek için, zigotları taze 50 mikrolitrelik M2 artı BSA damlacığına taşımak için ağızdan çalışan bir pipet kullanın. Daha sonra, embriyonun zona pellucida'sını aşındırmak ve reaktif dağıtımı için ek fiziksel engelleri azaltmak için, embriyoları 60 milimetrelik bir plaka üzerinde önceden ısıtılmış 100 mikrolitrelik bir asit Tirod damlacığına veya AT çözeltisine aktarın.
Zona pellucida'nın% 30'u aşınana kadar zigotları stereo mikroskop altında sürekli olarak gözlemleyin, daha sonra AT'yi seyreltmek için embriyoları dört adet 50 mikrolitrelik M2 artı BSA damlacığından geçirin. Daha sonra, stereo mikroskop altında sayarak işlenmiş uygun sayıda embriyo belirleyin. BSA'yı, embriyoları 50 mikrolitre azaltılmış serum ortamının iki damlacığından geçirerek seyreltin.
Daha sonra, 10 mikrolitrelik azaltılmış serum ortamından oluşan bir damlacık içine 25 ila 30 embriyo ağız pipeti, daha sonra ribonükleoprotein veya RNP kompleksinin 10 mikrolitresini eklemek için el tipi bir pipet kullanın. Viskoz gliserolü RNP kompleksinden seyreltin ve numuneyi 10 kez pipetleyerek veya karışım artık viskozite göstermeyene kadar homojenize edin. Daha sonra, kabarcıklardan kaçınırken 20 mikrolitre embriyo ve RNP karışımını 0.1 santimetrelik bir elektroporasyon küvetine pipetleyin, daha sonra düzenleme reaktiflerini zigot içine iletmek için, 30 voltluk bir kare dalga protokolü, 3 milisaniye darbe uzunluğuna sahip 4 ila 6 darbe ve 100 darbe aralığı kullanarak embriyoları elektroporate edin.
Daha sonra, embriyoları küvetten temizlemek için küvetin üstüne 50 mikrolitre M2 artı BSA ekleyin ve bu karışımı bir tabağa hafifçe pipetleyin. Embriyo kültürü için, önceden dengelenmiş bir kültür plakasında 20 ila 30 zigot KSOM artı BSA damlacığına aktarın ve embriyoları damlacığa taşıyın. Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede% 95 nem ile% 5 karbondioksit içinde inkübe edin.
Ertesi gün, sadece iki hücreli embriyoları taze bir KSOM artı BSA karışımı damlacığına aktarın ve plakayı inkübatöre geri gönderin. Ölü veya döllenmemiş embriyoları bırakın veya atın. Genotiplemeden önce, bir PCR reaksiyonuna müdahale edebilecek medya bileşenlerini seyreltmek için morula blastosist embriyolarını iki damla DPBS ile yıkayın.
Bir ağız pipeti kullanarak, bireysel embriyoları 8 delikli bir PCR şeridinin bir kuyucuğuna aktarın ve 10 mikrolitre lizis tamponu ekleyin. Daha sonra, embriyoları lize etmek için, bir termal bisikletçiyi 4 saat boyunca 55 santigrat dereceye kadar programlayın, ardından proteinaz K'yı 95 santigrat derecede 10 dakikalık bir inkübasyonla inaktive edin. Bu çalışmada, fare tirozinaz lokusunu pozitif kontrol olarak hedeflemeye yönelik örnek bir strateji, oligo tasarımları ve homolog olmayan uç birleştirme ve homolojiye yönelik onarım için genotipleme stratejileri gösterilmiştir.
Tek bir tek kılavuz veya sgRNA sunarken, RNP'lerin dağıtımı C57 siyah 6J ve C57 siyah 6N fare suşlarında% 100'e kadar ve dahil olmak üzere% 50 ila% 100'de meydana gelen ekleme delesyonları oluşumu ve% 17 ila% 63 arasında değişen küçük oligo bazlı değiştirmelerMühendislik genomik delesyonlarında, düzenleme etkinliği% 3 ila% 100 arasında değişirEmbriyo mümkün olduğunca hızlı ideal koşullara yakın tutulmalıdır. protokol yapılır, ne kadar iyiyse. Ayrıca, hyaluronidaz ve asit Tyrode'lara maruz kalmayı en aza indirin. Bu yöntem, düzenlenmiş bir hayvan üretmeyi, implantasyonu veya gebelik canlılığını test etmeyi veya plantasyon öncesi geliştirme sırasında ölçümleri veya görüntüleri ve çeşitli metrikleri toplamak için deneyi birden çok kez gerçekleştirmeyi açıklar.
