Name: a gpc3-targeting bispecific antibody, gpc3-s-fab, with potent cytotoxicity
Uploaded: 2018-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity at JoVE.com

Bu eser mali R & D planı, Guangdong Eyaleti (PR Çin) (2016A050503028) tarafından desteklenmiştir.

İnsan kanı toplama dahil olmak üzere tüm yordamları Sun Yat-Sen Üniversitesi Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. GPC3-S-Fab tasarım stratejisi
<ol><li>GPC3-S-Fab anti-GPC3 (insanlaşmış GC3313) bir anti-CD16 VHH14 (Şekil 1) ile bir Fab bağlayarak tasarlayın.</li>
	<li>Sentez ve VH-CH1-CD16-VHH ve VL-CL pET26b ve pET21a vektörel çizimler daha önce bildirilen12olarak klonu.</li>
</ol>2. dönüşüm ve kültür
<ol><li>100 Ekle VH-CH1-CD16 (Şekil 1A) ve 100 içeren ng pET26b, pET21a, yetkili BL21 100 µL VL-CL (Şekil 1A) içeren ng (DE3) hücreleri. Mix iyi ve 45-90 s, transfer, 42 ° C su banyosunda 30 dk. Incubate buz üzerinde kuluçkaya ve 3-5 dakika buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Lysogeny suyu (LB) orta 500 µL BL21 içeren bir tüpün içine ekleyin (DE3) hücreleri ve sonra 37 ° c, 45-60 dakika süreyle 150 d/d BL21 yayılmış 100 µL kuluçkaya LB-agar (DE3) hücre tabaklar içeren 50 µg/mL sefaloridin ve ampisilin 100 µg/mL ve 12-16 h 37 ° C'de kuluçkaya.<ol>
<li>Lysogeny suyu (LB) orta hazırlamak: %1 wt/vol tryptone, % 0.5 wt/vol maya özü, % 1 wt/vol NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir koloni hücrelerden sefaloridin 50 µg/mL ve ampisilinve kültür 37 ° c, 220 devir/dakika, 100 µg/mL gecede içeren Süper suyu (SB) orta 5 mL aşılamak. O zaman, kültür 1 mL 100 mL 50 µg/mL sefaloridin ve ampisilin ve kültür 37 ° c, 4 h için 220 devir/dakika 100 µg/mL içeren SB orta içine aşılamak. Ardından kültür 10 mL 1 L SB orta sefaloridin 50 µg/mL ve ampisilin ve kültür 37 ° c, 220 devir/dakika 100 µg/mL içeren içine aktarın.<ol>
<li>Süper suyu orta hazırlamak: % 3.2 wt/vol tryptone, % 2 wt/vol maya özü, % 0.5 wt/vol NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>OD600 0,6 - ulaştığında 0.8, 0.2 mM son bir konsantrasyon izopropil-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) ekleyin. Kültür 16 ° c, 36-48 h periplasmic ifade için 180 rpm.</li>
</ol>3. GPC3-S-Fab Periplasmic arıtma
<ol><li>Periplasmic kesir hazırlık<ol>
<li>4000 x g, 30 dk için 4 ° C de centrifuging tarafından hücreleri toplamak, orta atın ve hücreleri tartın.</li>
		<li>4 mL buz gibi sükroz çözeltisi (20 mM Tris-HCL, pH 7.5; %25 (wt/vol) sükroz ve 1 mM EDTA) gram hücre başına iyice hücrelerde resuspend ve 15 dakika buz üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>8.500 x g (Masa Üstü Santrifüj, sabit açılı rotor), buz üzerinde 20 dk. kaldırmak için süpernatant (sukroz Kesir) ve kurtarmak o 4 ° C santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Buz gibi 5 mm MgCl2 ve PMSF (gram hücre başına 4 mL), 1 mM bir karışımında granül resuspend. Lizozim hisse senedi (15 mg/mL) gram başına 40 µL ekleyin ve buz 30 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>8.500 x g (Masa Üstü Santrifüj, sabit açılı rotor), 4 ° C 20 dakika Transfer süpernatant (periplasmic Kesir) süreyle santrifüj kapasitesi ve buza kaydedin.</li>
		<li>Sükroz kesir ve periplasmic kesir birleştirin ve de 30.000 x g, 4 ° C'de 30 dk. kaldırmak için süpernatant ve kurtarmak o bir 50 mL konik tüp buz santrifüj kapasitesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ni-NTA benzeşme arıtma<ol>
<li>Homojen bir süspansiyon ulaşmak, Ni-NTA özel bir taze 15 mL konik tüp için 1 mL kaldırmak ve 10 sütun birimleri (CV) denge arabellek eklemek için iyice karıştırılarak Ni-NTA özel 1 mL resuspend (25 mM Tris-HCL, pH 7.5; 1 M NaCl) equilibrate için.</li>
		<li>400 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatli bir şekilde çıkarın. Daha sonra Ni-NTA özel sükroz kesir ve periplasmic kesir içeren 50 mL tüp içine ekleyin. Rock 4 ° c 2 h için.</li>
		<li>400 x g karisimin santrifüj kapasitesi, 4 ° C'de 5 dakika süreyle dikkatli bir şekilde süpernatant ilişkisiz kesir olarak başka bir taze buz gibi tüp için çıkarın. Ni-NTA özel bir yerçekimi sütuna aktarmak.</li>
		<li>10 Ekle CV, arabellek yıkama (25 mM Tris-HCL, pH 7.5; 1 M NaCl; 20 mM, 30 mM veya 40 mM imidazole) sütun ve toplamak çamaşır kesir olarak elute. Not: Bu çözümler imidazole konsantrasyonları artan sırayla eklenmelidir.</li>
		<li>3 ekleyin elüsyon CV (25 mM Tris-HCL, pH 7.5; 300 mM NaCl; 100 mM, 200 mM, 300 mM veya imidazole 400 mM) sütun için tampon ve elüsyon kesir olarak 1, 2, 3 ve 4 elute toplamak. Not: Bu çözümler imidazole konsantrasyonları artan sırayla eklenmelidir.</li>
		<li>Diyaliz PBS (137 mM NaCl, KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4 2.7 mM) 2 L eluted fraksiyonları % 12 kontrol GPC3-S-Fab varlığı diyaliz boru (12,4 kDa) 4 ° C'de 2 h. için istimal SDS-sayfa ve sonra tarafından Coomassie mavi boyama.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IgG-CH1 benzeşme arıtma<ol>
<li>IgG-CH1 benzeşme reçine 1 mL 50 mL konik tüp içine aktarmak ve boncuk PBS ile önce yıkayın. Daha sonra GPC3-S-Fab-den sonra adım 3.2.6 içeren diyaliz çözüm ekleyin. Rock 4 ° c 2 h için.</li>
		<li>5 min için 400 x g, santrifüj, 4 ° C. Dikkatle ve reçine bir ağırlık sütun için transfer için başka bir taze buz gibi tüp süpernatant çıkarın.</li>
		<li>10 Ekle CV çamaşır tampon (PBS) için sütun ve yıkama kesir olarak elüsyon toplamak.</li>
		<li>Koleksiyon tüpler Tris pH 9.0 (her eluted kesir mL başına 0.1 mL) 1 M ekleyerek hazırlayın. 3 CV elüsyon arabellek (glisin-HCL, pH 2.7 0.1 M) ile elute ve eluted kesir toplamak; 3 kez tekrarlayın.</li>
		<li>Diyaliz diyaliz boru (12,4 kDa) kullanarak 4 ° C'de 2 h. için PBS 2 L eluted kesirler iki kez tekrarlayın.</li>
		<li>Ultramicrospectrophotometer tarafından protein konsantrasyonu belirlemek (Molar tükenme katsayısı: 91105. 1 A280 = 0.69 mg/L).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. SDS-sayfa ve Western blot Analizi
<ol><li>5 SDS yükleme arabellek x 10 µL örnek almak ve iyice karıştırın. 5 min için 100 ° C'de protein karışımı kaynatın.<ol>
<li>5 x SDS yükleme arabellek hazırlamak: 250 mM Tris-HCL, pH 6.8, % 10 wt/vol SDS, %0,5 wt/vol bromophenol mavi, %50 vol/vol gliserol, % 5 vol/vol beta-mercaptoethanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SDS-sayfa jel yükleme jel (% 5) ve ayrılık jeli (% 12) yukarıda açıklanan26,27,28hazırlayın.</li>
	<li>Haşlanmış protein karışımı ve protein marker 10 µL yük ve SDS-sayfayı çalıştırın.</li>
	<li>Coomassie parlak mavi çözüm ile 20 dk için sallayarak jel leke ve destaining gerçekleştirin.</li>
	<li>Western Blot, PVDF membran için aktardıktan sonra membran TBST (20 mM Tris-HCl, NaCl, %0,1 vol/vol ara 20 150 mM) ile blok + % 5 wt/vol sallayarak süre oda sıcaklığında 1 h için süt kaymağı alınmış.</li>
	<li>Membran birincil antikorlar ile kuluçkaya (Anti-O'nun veya anti-bayrak) seyreltilmiş 1:2,000 TBST + % 5 yağsız süt 1 h için.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 min için TBST ile yıkama ve 3 kez tekrarlayın.</li>
	<li>İkincil antikoru (Anti-fare Fc antikor HRP bağlı) seyreltilmiş 1:2,000 TBST + % 5 yağsız süt 1 h için membran kuluçkaya.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 min için TBST ile yıkama ve 3 kez tekrarlayın.</li>
	<li>HPR substrat film başına 1 mL ekleyin, geliştirmek ve fotoğraf çekmek.</li>
</ol>5. jel filtrasyon Analizi
<ol><li>Aşağıdaki sütun kullanın: sütun hacmi 24 mL; Denge arabellek PBS pH 7.4; Akış hızı 0.5 mL/dk odasında ılıman; Örnek hacmi 200 µL.</li>
	<li>Aşağıdaki protein güç ve konsantrasyon kullanın: 500 µL 1.2 mg/ml GPC3-S-Fab. 20.000 x g 30 dk için de santrifüj kapasitesi ve yüklemek için 200 µL al.</li>
	<li>Protein marker hacmi ve konsantrasyon, 100 µL sitokrom C (2 mg/mL, 12.4 kDa), 140 µL anhidraz (3 mg/mL, 29 kDa), albümin (10 mg/mL, 66 kDa) 140 µL ve alkol dehidrogenaz (5 mg/mL, 150 kDa) 200 µL bir tüpün içine alın. 20.000 x g 30 dk için de santrifüj kapasitesi ve yüklemek için 200 µL al.</li>
	<li>Her koşudan önce en az 2 ile yıkayın CV distile suyun akış hızı 0.5 mL/dak.</li>
	<li>Sütun en az 2 ile equilibrate CV denge arabelleği (PBS, pH 7,4) 0.5 mL/dk akış hızında.</li>
	<li>Otomatik olarak örnek örnek yüklemek için 0.5 mL/dk enjekte et.</li>
	<li>Denge arabelleği 0.5 mL/dk ile elute ve 280 ve 215 nm algılamak.</li>
</ol>6. Akış Sitometresi Analizi
<ol><li>HepG2 Kültür (GPC3 pozitif), Hep3B (GPC3 pozitif), Huh7 (GPC3 pozitif) ve 100 x 20 mm plastik yemekleri DMEM orta % 10 fetal Sığır serum (FBS), penisilin (100 µg/mL) ve streptomisin (50 µg/mL) 37 ° C'de içeren hücrelerde MHCC - 97H (GPC3 complement) %5 CO2.</li>
	<li>Kültür CHO (GPC3 complement) hücreleri ve tam uzunlukta insan GPC3 cDNA (GPC3 pozitif) 100 x 20 mm plastik yemekler RPMI 1640 orta %10 FBS, penisilin (100 µg/mL) ve streptomisin (50 µg/mL) 37 ° c, % 5 CO2içeren yataklık CHO/GPC3 hücreleri.</li>
	<li>Tam uzunlukta insan CD16 cDNA (CD16 pozitif) barındıran NK92/CD16 25 cm2 şişeye %10 FBS, penisilin (100 µg/mL) ve streptomisin (50 µg/mL) 37 ° c, % 5 CO2ile RPMI 1640 orta içeren kültür.</li>
	<li>Hücreleri % 70-90 birleşmesi olduğunuzda, orta atın ve PBS 2 mL hücrelerle yıkayın. 1 mL % 0.25 tripsin ekleyin ve 37 ° c için 2-3 dk (veya hücre yüzeyinden ayırmak başlayana kadar) kuluçkaya. Tripsin etkisiz hale getirmek ve hücrelerin yavaşça yukarı ve aşağı pipetting tarafından yeniden askıya almak için tam büyüme orta 1 mL ekleyin.</li>
	<li>Neubauer hemasitometre kullanarak hücre sayıları saymak ve hücre canlılığı Trypan Mavitarafından algılamak.</li>
	<li>3 x 106 hücreler her hücre satırı için toplamak. PBS + % 0,2 BSA hücreleri yeniden askıya almak için 1 mL ekleyin. 200 x g, santrifüj, 4 ° C 5 dk. iki kez tekrarlamak için.</li>
	<li>PBS + % 0,2 BSA hücreleri yeniden askıya almak için 0.3 mL ekleyin ve her 5 mL polistren yuvarlak alt tüp 100 µL (yaklaşık 1 milyon) aktarın. Not: Lütfen burada tüpler için adımları soğuk buz üstünde tutulmalıdır emin olun. Antikor hücre yüzey antijeni bağlanırken, karmaşık içselleştirmesi başlar. Soğuk tutarak, süreci önemli ölçüde yavaşladı.</li>
	<li>Her tüp için birincil antikor (GPC3-S-Fab veya insan Igg1, son konsantrasyonu 5 µg/mL) 10 µL ekleyin ve 1 h için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>PBS 1 mL ekleyin + % 0,2 BSA yıkama ve 200 x g, santrifüj, 4 ° C'de 5 dakika süreyle üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>PBS + % 0,2 BSA, 100 µL yeniden askıya alma ve daha sonra ikincil antikoru (anti-insan IgG(H+L)-488, son konsantrasyonu 10 µg/mL) 0.5 µL ekleyin ve buz 1 h. Not için kuluçkaya: Bu adıma, lütfen hücreler gelen ışık tutmak..</li>
	<li>PBS 1 mL ekleyin + % 0,2 BSA yıkama ve 200 x g, santrifüj, 4 ° C'de 5 dakika süreyle üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>Hücreleri tarafından akış sitometresi standart protokolü29göre analiz. Hücrelerin uyarma için 488 nm lazer ile elde etmek.</li>
</ol>7. sitotoksik deneyleri
<ol><li>Tümör hücreleri hazırlayın.<ol>
<li>Kültür HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H ve CHO hatları 6.1 6.5 adımlarda açıklandığı gibi hücre.</li>
		<li>0,5 × 105/mL hücrelere sulandırmak ve 100 µL hücreleri (iyi başına 5000 hücre) 96-şey plakalar üzerinde plakası. 6-8 h hücre eklemek izin vermek için kültür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İnsan periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) hazırlayın.<ol>
<li>PBS eşit bir birimdeki bir 50 mL konik tüp taze hazırlanmış kanı sulandırmak. Örneğin, kan 10 mL 10 mL PBS ile oranında seyreltin.</li>
		<li>Lenfosit ayrılık orta 15 mL taze 50 mL konik tüp içine al. Lenfosit ayrılık ortama tüp tarafı boyunca seyreltilmiş kan yavaş yavaş aktarın. Not: tüp dikey tutun. Lenfosit ayrılık orta yüzeyine bozulmaz.</li>
		<li>400 x g oda sıcaklığında 35 dk için de kapalı tut ile santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Yavaş yavaş üst plazma katmanı kaldırın ve PBMCs plazma-lenfosit ayrılık orta arayüz içeren beyaz kan katman al.</li>
		<li>PBS + % 2 Kişilik birimi olan PBMCs seyreltik FBS. 400 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Hücrelerle iki kez PBS + % 2 yıkama FBS. 5 dakika süreyle santrifüj 400 x g de 6,5 adımda anlatıldığı gibi hücre sayıları saymak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NK hücreleri hazırlayın.<ol>
<li>5 x 107 hücre/mL PBS + %2 FBS ve yerde bir konsantrasyon, PBMCs süspansiyon hazırlamak 5 mL polistren yuvarlak alt tüp giriyordu.</li>
		<li>İnsan NK hücre zenginleştirme kokteyl 50 µL/mL hücre ekleyin. Mix iyi ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Manyetik parçacıklar NK hücre zenginleştirme kiti ve mix iyi onlar düzgün pipetting tarafından askıya alınır sağlamak için yukarı ve aşağı 5 katından fazla şiddetle resuspend. 100 µL/mL resuspended manyetik parçacıklar hücre süspansiyon aktarın. Mix iyi ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>PBS + %2 ekleyerek toplam hacmi 2.5 mL kadar hücre süspansiyon getirmek FBS. Tüp hücrelerde yavaşça yukarı ve aşağı 2 - 3 kez pipetting tarafından karıştırın. (Olmadan bir kap) tüp mıknatıs yerleştirin. Oda sıcaklığında 2.5 min için yerleşmek manyetik boncuklar izin.</li>
		<li>Mıknatıs kaldırın. Bir sürekli çekimde zenginleştirilmiş hücre süspansiyon yeni bir tüp içine dökme Tüp, tersine çevirin.</li>
		<li>6.5. adımda açıklandığı gibi hücre sayıları saymak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sitotoksik tepki kadar ayarla.<ol>
<li>NK hücreleri 5 × 105 hücreleri/karşılık gelen kültür ortamı kullanarak ml seyreltik. 100 µL NK hücre süspansiyon, bir 96-şey plaka üzerinde kaplama tümör hücreleri ekleyin.</li>
		<li>GPC3-S-Fab 10 µL 30 µg/mL, 3 kat seyreltme, 9 nokta (üç çoğaltır) son bir konsantrasyon, en yüksek dozla farklı konsantrasyonlarda ekleyin.</li>
		<li>37 ° c, % 5 CO2 72 h için kuluçkaya.</li>
		<li>72 h, kuluçka sonra orta kaldırmak ve DMEM orta CCK8 reaktif her kuyuya 96-şey plakaları için 10 µL içeren 100 µL ekleyin ve 37 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>450 de plaka okumak nm'de 1, 2, 3 ve 4 h CCK8 reaktif ekledikten sonra.</li>
		<li>Verileri analiz. (OD450 GPC3-S-Fab + efektör + tümör - OD450 Orta) hayatta kalma oranı hesaplamak / (OD450 tümör - OD450 Orta) × %100 ve (OD450 GPC3-S-Fab + tümör - OD450 Orta) / (OD450 tümör - OD450 Orta) × %100. Efektör hücreler NK hücreleri vardır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Weiner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+monoclonal+antibody-based+therapeutics.">Building better monoclonal antibody-based therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).</li><li>Rathi, C., Meibohm, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+pharmacology+of+bispecific+antibody+constructs.">Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs.</a> The Journal of Clinical Pharmacology. 55, S21-S28 (2015).</li><li>Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-antigen-binding+bispecific+antibodies+for+cancer+treatment.">Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment.</a> Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).</li><li>Demarest, S. J., Glaser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+therapeutics,+antibody+engineering,+and+the+merits+of+protein+stability.">Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability.</a> Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).</li><li>Mabry, R., Snavely, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+bispecific+antibodies:+The+selection+of+stable+single-chain+fragments+to+overcome+engineering+obstacles.">Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles.</a> IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).</li><li>Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+interactions+in+the+Fab+fragment:+a+comparative+evaluation+of+the+single-chain+Fv+and+Fab+format+engineered+with+variable+domains+of+different+stability.">Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability.</a> Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).</li><li>Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody-based+cancer+therapy+of+solid+tumors.">Nanobody-based cancer therapy of solid tumors.</a> Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).</li><li>Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+antigens+by+single-domain+antibody+fragments:+the+superfluous+luxury+of+paired+domains.">Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).</li><li>Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Domain+Antibodies+As+Versatile+Affinity+Reagents+for+Analytical+and+Diagnostic+Applications.">Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications.</a> Frontiers in Immunology. 8, 977 (2017).</li><li>Fernandes, C. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Camelid+Single-Domain+Antibodies+As+an+Alternative+to+Overcome+Challenges+Related+to+the+Prevention,+Detection,+and+Control+of+Neglected+Tropical+Diseases.">Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases.</a> Frontiers in Immunology. 8, 653 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+bispecific+antibody,+S-Fab,+induces+potent+cancer+cell+killing.">A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing.</a> Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-domain+antibody-linked+Fab+bispecific+antibody+Her2-S-Fab+has+potent+cytotoxicity+against+Her2-expressing+tumor+cells.">A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells.</a> AMB Express. 6 (1), 32 (2016).</li><li>Nakano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-glypican+3+antibodies+cause+ADCC+against+human+hepatocellular+carcinoma+cells.">Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).</li><li>Behar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+anti-FcgammaRIII+(CD16)+llama+single-domain+antibodies+that+activate+natural+killer+cells.">Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells.</a> Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).</li><li>Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+single-domain+antibodies+in+bacterial+systems.">Expression of single-domain antibodies in bacterial systems.</a> Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).</li><li>Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotic+expression+of+antibodies.">Prokaryotic expression of antibodies.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).</li><li>Spiess, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bispecific+antibodies+with+natural+architecture+produced+by+co-culture+of+bacteria+expressing+two+distinct+half-antibodies.">Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies.</a> Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).</li><li>Filmus, J., Selleck, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glypicans:+proteoglycans+with+a+surprise.">Glypicans: proteoglycans with a surprise.</a> Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).</li><li>Baumhoer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glypican+3+expression+in+human+nonneoplastic,+preneoplastic,+and+neoplastic+tissues:+a+tissue+microarray+analysis+of+4,387+tissue+samples.">Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples.</a> American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).</li><li>Llovet, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+signature+to+discriminate+dysplastic+nodules+from+early+hepatocellular+carcinoma+in+HCV+cirrhosis.">A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis.</a> Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).</li><li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+glypican-3+expression+differentiates+the+majority+of+hepatocellular+carcinomas+from+benign+hepatic+disorders.">Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders.</a> Gut. 48 (4), 558-564 (2001).</li><li>Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+a+developmentally+regulated+transcript+MXR7+in+hepatocellular+carcinoma:+biological+significance+and+temporospatial+distribution.">Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution.</a> Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).</li><li>Flaherty, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+evaluation+of+GMA161--an+antihuman+CD16+(FcgammaRIII)+monoclonal+antibody+for+treatment+of+autoimmune+disorders+in+CD16+transgenic+mice.">Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice.</a> Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).</li><li>Sharma, R., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+phenotypic+and+functional+features+of+NK+cells+in+humans.">Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans.</a> Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).</li><li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+CD16a,+the+surface+receptor+of+Kupffer+cells,+on+the+growth+of+hepatocellular+carcinoma+cells.">Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).</li><li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pouring+and+running+a+protein+gel+by+reusing+commercial+cassettes.">Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li><li>Feng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutically+targeting+glypican-3+via+a+conformation-specific+single-domain+antibody+in+hepatocellular+carcinoma.">Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Bu çalışmada, biz bsAbs, yeni bir biçim oluşturmak için bir strateji mevcut GPC3-S-hangi GPC3 pozitif tümör hücreleri hedefleme NK hücreleri askere Fab. S-Fab üzerinde doğal Fab dayalı bir anti-CD16 VHH11,12ekleyerek biçimi. BsAbs içeren Fc bölge ile karşılaştırıldığında, GPC3-S-Fab kolayca bakteri büyük ölçüde periplasm olarak üretilmektedir.
İletişim kuralında tanımlanan ifade ve arıtma stratejisi k...

Monoklonal antikor şimdi geniş kanser tedavi1için kullanılır. Antikorlar esneklik nedeniyle çeşitli antikor tabanlı biçimler aktif olarak keşfedilmeyi. Monoklonal antikorlar ile karşılaştırıldığında, bsAbs iki farklı hedefler aynı anda ve verimli bir şekilde hedef ve tümör hücreleri2öldürmek için bağışıklık efektör hücreleri alımı tetiklemek tanımasını sağlayarak iki farklı antijen bağlayıcı modülleri var.
Geçerli rekombinant bsAb biçimleri genellikle iki sınıf için atanmış: Fc içeren bsAbs ve bsAbs bir Fc bölge olmadan. Çoğunlukla memeli hücrelerinde üretilir Fc içeren biçimleri ile karşılaştırıldığında, bsAbs olmadan bir Fc bölge daha küçük boyutları, avantajları daha kolay mikroorganizma ifade sistemlerinde üretilen ve tümör doku daha verimli bir şekilde nüfuz 3.
bsAbs bir Fc bölge olmadan genellikle tek-zinciri değişken parçaları (scFvs) veya Fabs3gibi bireysel bağlama moieties bağlayarak meydana gelir. Olmadan teskin etki, scFv parçaları genellikle dayalı bsAbs termal kararlılık, düşük çözünürlük veya toplama4,5için artan bir potansiyel tehlikeye. Buna ek olarak, Fab-esaslı bsAbs CH1 ve CL heterodimerization yerli Fab yan4,6' nedeniyle daha istikrarlı.
Değişken etki alanından ağır zinciri yalnızca antikorlar (VHHs, tek etki alanı antikor da bilinir) doğal ağır zincir antikorlar7aktif antijen bağlayıcı parçası vardır. VHHs yüksek afinite özellikleri, geleneksel IgGs8, düşük immünojenisite ve yüksek verim özgüllük bakteriyel ifade9' var. FV parçaları ile karşılaştırıldığında, VHHs daha yüksek termal kararlılık10var. Fab moieties ile karşılaştırıldığında, VHHs daha küçük boyutları nedeniyle CH1 ve CL eksikliği var. Böylece, S-Fab, Fab bir tek etki alanı antikor, VHH, ile bağlantı kurarak elde bsAb biçiminde tasarlanmış ve onun anti-tümör etkisi11,12için okudu.
Bu çalışmada, GPC3-S-Fab inşaatı hGC3313 ile bir anti-CD16a VHH14 Fab bağlama tarafından tanımlanmıştır. GPC3-S-Fab, verimli bir şekilde periplasmic ifade Escherichia coli (e.coli)içinde üretilmektedir. GPC3-S-Fab fonksiyonel çalışmaları GPC3-S-Fab karaciğer kanseri tedavisi için umut verici bir strateji olduğunu düşündürmektedir. Böylece, GPC3-S-Fab avantajları alternatif teknikleri ile ilgili başvuruları önceki çalışmalarda kolay üretim ve arıtma ve daha istikrarlı bsAbs içerir.
Memeli ifade ve prokaryotik ifade sistemler BsAbs çeşitli biçimlerde ifade etmek için kullanılmaktadır. Memeli ifade sistemleri, E. coliaksine-tabanlı protein ifade sistemlerine sahip pek çok faydaları, yüksek verim, düşük maliyetli ve emek tasarrufu, genetik manipülasyon ve yüksek dönüşüm verimliliği15kolaylığı dahil olmak üzere. E. colibsAbs ifade için iki temel strateji vardır: sitoplazma ve sitoplazma ve dış hücre zarlarında15arasında periplasm ifadede ifade. Sitoplazma azaltarak çevreye, periplasm bir daha oksitleyici doğru katlanır teşvik çevre ve proteinler16ortak ifade karşılaştırılır. Doğru katlanır çözünürlük, istikrar ve işlev bsAbs üretiminde önemli bir rol oynar. Bu nedenle, bir sinyal sıra pelB periplasm için salgılanmasını E. coli17yönlendirmek için S Fab N-terminus eklendi. Emin olmak için doğru katlanır, çözünürlük, termal kararlılık ve konformasyon istikrar, karmaşıklığı ve bir antikor boyutunu azaltarak sık16istihdam. S-Fab biçimi bir Fab ve bakteriyel sistemlerinde basit yapısı ve küçük boyutu nedeniyle büyük olasılıkla çok iyi ifade edilen bir VHH oluşur.
GPC3 bu GPC3-S-Fab bispecific antikor biçimde seçildi. Glypican-3 (GPC3) ile glycosylphosphatidylinositol (GPI)18hücre yüzeyine demirli heparin sülfat (HS) proteoglikan ailesinin bir üyesidir. GPC3 karaciğer kanserleri19,20,21,22çoğunluğu için hangi hesabı % 70 hepatosellüler karsinom (HCC) olguların overexpressed. GPC3 nadiren normal dokulara ifade edilir çünkü GPC3 HCC için potansiyel bir hedef teklif edildi. Birden çok fare mAbs GPC3 karşı üretilen. Ancak, sadece GC33 sınırlı anti-tümör faaliyet 22sergiledi ve bu hastalarda klinik etkinlik sergilemek için başarısız oldu. Bu çalışmada, GPC3-S-Fab NK hücreleri GPC3 tümör hücreleri14öldürmek için recruit edebilmek için gösterildi.
NK hücreleri toplamak için anti-CD16 VHH kullanıldı. CD16a esas olarak doğal öldürücü (NK) hücreler, makrofajlar, monosit ve bazı alt türlerinden T hücrelerinin üzerinde ifade bir düşük benzeşme IgG reseptör var. NK hücreleri23tarafından antikor bağımlı hücre sitotoksisite (CCDA) ilgilenmektedir. İnsan NK hücreleri iki türe, CD56 kategorize - CD16 + ve CD56 + CD16-. CD56 + CD16− NK hücreleri, CD56 aksine-CD16 + NK hücreleri serbest bırakmak daha yüksek düzeyde perforin ve granzyme B ve böylece güçlü sitotoksisite24mevcut. CD16a, ifade Kupffer hücreleri (KCs), karaciğerde ikamet makrofajlar vardır. Kupffer hücreleri karaciğer kanseri25bastırılması içinde önemli bir rol oynamaktadır. Böylece, CD16a hedefleme bsAbs T hücrelerinin karaciğer kanserine karşı ilgi çekici daha bir daha umut verici strateji olabilir.

<table><tbody><tr><td>Shaking incubator</td><td>Thermo Fisher</td><td>MAXQ 4000</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Zhicheng</td><td>ZWYR-D2402</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Cence</td><td>GL-10MD</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman coulter</td><td>Avanti j-26S XPI</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Ultraviolet spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Nanodrop</td><td></td></tr><tr><td>Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td><td>Mini-PROTEAN&amp;reg; Tetra</td><td>Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td>Trans-blot apparatus</td><td>Criterion</td><td>Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td>Imaging system</td><td>Bio-rad</td><td>chemidoc tm XRS+</td><td></td></tr><tr><td>Fast Protein Liquid chromatogram</td><td>GE Healthcare</td><td>AKTA avant</td><td></td></tr><tr><td>GF column</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>Beckman coulter</td><td>FC500</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5702R</td><td></td></tr><tr><td>Envision plate reader</td><td>TECAN</td><td>Infinite F50</td><td></td></tr><tr><td>Anti His-tag</td><td>eBioscience</td><td>14-6657-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-Flag-tag</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>anti-human(H&amp;amp;L)-488</td><td>A11013</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG HRP-linked antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA-Agarose</td><td>Tribioscience</td><td>TBS9202-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG-CH1 affinity resin</td><td>Thermo Fisher</td><td>194320005</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>NK cell enrichment kit</td><td>Stemcell</td><td>19055</td><td></td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Stemcell</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>CCK8 kit</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500CP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500CP</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15050-057</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Standard marker</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MWGF200</td><td>Gel filtration</td></tr><tr><td>Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG)</td><td>VWR chemicals</td><td>VWRC0487-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0655-100FT</td><td></td></tr><tr><td>Knanamycine</td><td>VWR</td><td>VWRC0408-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>VWR</td><td>VWRC0339-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0021B</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6791-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900106</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>aladdin</td><td>A110752-500g</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>aladdin</td><td>P112134-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900020</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sangon Biotech</td><td>A505255-0250</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4)</td><td>VWR</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>VWR</td><td>60-24-2</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF)</td><td>VWR</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6876-25G</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>VWR</td><td>VWRC0472-50G</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500922-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>VWR</td><td>VWRC0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900122</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 20mm plastic dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 flask</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>96 well cell culture cluster</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610498-0005</td><td></td></tr><tr><td>CHO</td><td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td><td>GNHa 3</td><td></td></tr><tr><td>MHCC-97H</td><td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td><td>SCSP-528</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td><td>TCHu 72</td><td></td></tr><tr><td>Huh7</td><td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td><td>TCHu182</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B</td><td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td><td>TCHu106</td><td></td></tr><tr><td>NK92</td><td>ATCC</td><td>CRL2408</td><td></td></tr></tbody></table>

a gpc3-targeting bispecific antibody, gpc3-s-fab, with potent cytotoxicity

Bu iletişim kuralı İnşaat ve bispecific antikor (bsAb), GPC3-S-Fab fonksiyonel çalışmaları açıklanmaktadır. bsAbs iki farklı kolları aracılığıyla iki farklı epitopları tanıyabilir. bsAbs aktif olarak yeteneklerini doğrudan bağışıklık hücreleri tümör hücrelerini öldürmek için recruit için inceledik. Şu anda, bsAbs çoğunluğu rekombinant proteinler, Fc içeren bsAbs olarak veya daha küçük bsAb türevleri Fc bölge olmadan şeklinde üretilmektedir. Bu çalışmada, GPC3-S-Fab, bir antikor parçası (Fab) tabanlı bispecific antikor anti-GPC3 antikor GC33 bir anti-CD16 tek etki alanı antikor ile Fab bağlama tarafından tasarlanmıştır. GPC3-S-Fab Escherichia coli ifade edilen ve iki benzeşme chromatographies tarafından arıtılmış. Saf GPC3-S-Fab özellikle bağlamak ve GPC3 pozitif karaciğer kanseri hücrelerini öldürmek doğal katil hücreler, işe alma tarafından GPC3-S-Fab potansiyel bir uygulama karaciğer kanseri tedavisi öneriyor.

GPC3-S-Fab arıtma
GPC3-S-Fab E. coli bir iki adım benzeşme saflaştırma tarafından ilk Ni-NTA-özel, IgG-CH1 benzeşme arıtma tarafından takip ile saflaştırıldı. İki adım benzeşme arıtma sonra GPC3-S-Fab homojenliği ile 1:1 (Şekil 2A) yakın iki zincir için saflaştırıldı. VH-CH1-CD16 VHH ve VL-CL polipeptitler varlığı onların farklı C-terminal eti...

Watch this Scientific Journal Video about A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity at JoVE.com

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Burada, içinde bispecific antikor GPC3-S-Fab üretmek için bir protokol mevcut Escherichia coli. Saf GPC3-S-Fab güçlü sitotoksisite karşı GPC3 pozitif karaciğer kanseri hücreleri vardır.

GPC3 hedefleme Bispecific antikor, GPC3-S-Fab, güçlü sitotoksisite

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

a-gpc3-targeting-bispecific-antibody-gpc3-s-fab-with-potent

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.5K Görüntüleme.  Sun Yat-Sen University. Burada, içinde bispecific antikor GPC3-S-Fab üretmek için bir protokol mevcut Escherichia coli. Saf GPC3-S-Fab güçlü sitotoksisite karşı GPC3 pozitif karaciğer kanseri hücreleri vardır.

Video: A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few decades, the field of antibody-drug conjugates, bispecific antibodies, chimeric antigen receptors (CAR) and cancer immunotherapy has emerged as the most promising area of basic and therapeutic investigations. With numerous successful human trials targeting immune checkpoint receptors and CAR-T cells in leukemia and melanoma at a breakthrough pace, it is highly exciting times for oncologic therapeutics derived from variations of antibody engineering. Regrettably, a significantly large numbers of antibody and CAR based therapeutics have also proven disappointing in human trials of solid cancers because of the limited availability of immune effector cells in the tumor bed. Importantly, nonspecific distribution of therapeutic antibodies in tissues other than tumors also contribute to the lack of clinical efficacy, associated toxicity and clinical failure. As faithful translation of preclinical studies into human clinical trails are highly relied on mice tumor xenograft efficacy and safety studies, here we highlight a method to test the tumor and general tissue distribution of therapeutic antibodies. This is achieved by labeling the protein-A purified antibody with near Infrared fluorescent dye followed by live imaging of tumor bearing mice.

Here we present a protocol to study the in vivo localization of antibodies in mice tumor xenograft models.

Hedef Antijen Spesifik Terapötik Antikor tümör ve doku dağılımının analizi

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Kanser Araştırmaları

Preparation of Site-Specific Cytotoxic Protein Conjugates via Maleimide-thiol Chemistry and Sortase A-Mediated Ligation

Cancer is currently the second most common cause of death worldwide. The hallmark of cancer cells is the presence of specific marker proteins such as growth factor receptors on their surface. This feature enables development of highly selective therapeutics, the protein bioconjugates, composed of targeting proteins (antibodies or receptor ligands) connected to highly cytotoxic drugs by a specific linker. Due to very high affinity and selectivity of targeting proteins the bioconjugates recognize marker proteins on the cancer cells surface and utilize receptor-mediated endocytosis to reach the cell interior. Intracellular vesicular transport system ultimately delivers the bioconjugates to the lysosomes, where proteolysis separates free cytotoxic drugs from the proteinaceous core of the bioconjugates, triggering drug-dependent cancer cell death. Currently, there are several protein bioconjugates approved for cancer treatment and large number is under development or clinical trials.
One of the main challenges in the generation of the bioconjugates is a site-specific attachment of the cytotoxic drug to the targeting protein. Recent years have brought a tremendous progress in the development of chemical and enzymatic strategies for protein modification with cytotoxic drugs. Here we present the detailed protocols for the site-specific incorporation of cytotoxic warheads into targeting proteins using a chemical method employing maleimide-thiol chemistry and an enzymatic approach that relies on sortase A-mediated ligation. We use engineered variant of fibroblast growth factor 2 and fragment crystallizable region of human immunoglobulin G as an exemplary targeting proteins and monomethyl auristatin E and methotrexate as model cytotoxic drugs. All the described strategies allow for highly efficient generation of biologically active cytotoxic conjugates of defined molecular architecture with potential for selective treatment of diverse cancers.

Here we provide detailed protocols for a site-specific labeling of proteins with cytotoxic drugs using maleimide-thiol reaction and sortase A-mediated ligation.

Cancer is currently the second most common cause of death worldwide. The hallmark of cancer cells is the presence of specific marker proteins such as ...

Biyokimya

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Bir Yakın Kızılötesi Photoimmunotherapy Tekniği Karışık 3D Kültür seçici hücre Eliminasyon

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Biyomühendislik

Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as valency, spatial arrangement, interdomain distance, and Fc mutations affect the anti-tumor efficacy of these therapies, commonly by influencing the homing of T cells to tumors, which remains a major challenge. Here, we describe a method to transduce activated human T cells with luciferase, allowing in vivo tracking of T cells during T-BsAb therapy studies. The ability of T-BsAbs to redirect T cells to tumors can be quantitatively evaluated at multiple time points during treatment, allowing researchers to correlate the anti-tumor efficacy of T-BsAbs and other interventions with the persistence of T cells in tumors. This method alleviates the need to sacrifice animals during treatment to histologically assess T cell infiltration and can be repeated at multiple time points to determine the kinetics of T cell trafficking during and after treatment.

Here, we describe a method for transducing human T cells with luciferase to facilitate in vivo tracking of bispecific antibody-induced T cell trafficking to tumors in studies to evaluate the anti-tumor efficacy and mechanism of T cell-engaging bispecific antibodies.

Luciferaz Dönüştürülmüş İnsan T Hücrelerini Kullanarak Bispesifik Antikor Kaynaklı T Hücresi Kaçakçılığını İzleme

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

High-Content Screening Assay for the Identification of Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Modifying Compounds

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells expressing the epidermal growth factor receptor HER2 can be targeted by the anti-HER-2 antibody trastuzumab. Antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) is an important mechanism implicated in the antitumor action of HER-2. Trastuzumab bound to cancer cells can be recognized by the Fc receptors of ADCC effector cells (e.g., natural killer (NK) cells, macrophages, and granulocytes), triggering the cytotoxic activity of these immune cells leading to cancer cell death. We set out to develop an image-based assay for the quantification of ADCC to identify novel ADCC modulator compounds by high-content screening. In the assay, HER2 overexpressing JIMT-1 breast cancer cells are co-cultured with NK-92 cells in the presence of trastuzumab, and target cell death is quantified by automated microscopy and quantitative image analysis. Target cells are distinguished from effector cells based on their EGFP fluorescence. We show how compound libraries can be tested in the assay to identify ADCC modulator drugs. For this purpose, a compound library test plate was set up using randomly selected fine chemicals off the lab shelf. Three microtubule destabilizing compounds (colchicine, vincristine, podophyllotoxin) expected to interfere with NK cell migration and degranulation were also included in the test library. The test screen identified all three positive control compounds as hits proving the suitability of the method to identify ADCC-modifying drugs in a chemical library. With this assay, compound library screens can be performed to identify ADCC-enhancing compounds that could be used as adjuvant therapeutic agents for the treatment of patients receiving anticancer immunotherapies. In addition, the method can also be used to identify any undesirable ADCC-inhibiting side effects of therapeutic drugs taken by cancer patients for different indications.

This protocol presents an automated, image-based high-throughput technique to identify compounds modulating natural killer cell-mediated breast cancer cell killing in the presence of a therapeutic anti-HER-2 antibody.

Antikor Bağımlı Hücresel Sitotoksisiteyi Modifiye Eden Bileşiklerin Tanımlanması için Yüksek İçerikli Tarama Testi

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells ...

Quantifying Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in a Tumor Spheroid Model: Application for Drug Discovery

Monoclonal antibody-based immunotherapy targeting tumor antigens is now a mainstay of cancer treatment. One of the clinically relevant mechanisms of action of the antibodies is antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), where the antibody binds to the cancer cells and engages the cellular component of the immune system, e.g., natural killer (NK) cells, to kill the tumor cells. The effectiveness of these therapies could be improved by identifying adjuvant compounds that increase the sensitivity of the cancer cells or the potency of the immune cells. In addition, undiscovered drug interactions in cancer patients co-medicated for previous conditions or cancer-associated symptoms may determine the success of the antibody therapy; therefore, such unwanted drug interactions need to be eliminated. With these goals in mind, we created a cancer ADCC model and describe here a simple protocol to find ADCC-modulating drugs. Since 3D models such as cancer cell spheroids are superior to 2D cultures in predicting in vivo responses of tumors to anticancer therapies, spheroid co-cultures of EGFP-expressing HER2+ JIMT-1 breast cancer cells and the NK92.CD16 cell lines were set up and induced with Trastuzumab, a monoclonal antibody clinically approved against HER2-positive breast cancer. JIMT-1 spheroids were allowed to form in cell-repellent U-bottom 96-well plates. On day 3, NK cells and Trastuzumab were added. The spheroids were then stained with Annexin V-Alexa 647 to measure apoptotic cell death, which was quantitated in the peripheral zone of the spheroids with an automated microscope. The applicability of our assay to identify ADCC-modulating molecules is demonstrated by showing that Sunitinib, a receptor tyrosine kinase inhibitor approved by the FDA against metastatic cancer, almost completely abolishes ADCC. The generation of the spheroids and image acquisition and analysis pipelines are compatible with high-throughput screening for ADCC-modulating compounds in cancer cell spheroids.

Here, we present a method to identify compounds that modulate the ADCC mechanism, an important cancer cell-killing mechanism of antitumor antibodies. The cytotoxic effect of NK cells is measured in breast cancer cell spheroids in the presence of Trastuzumab. Image analysis identifies live and dead killer and target cells in spheroids.

Bir Tümör Sferoid Modelinde Antikora Bağımlı Hücresel Sitotoksisitenin Ölçülmesi: İlaç Keşfi Uygulaması

Monoclonal antibody-based immunotherapy targeting tumor antigens is now a mainstay of cancer treatment. One of the clinically relevant mechanisms of ...

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological malignancies such as childhood acute lymphocytic leukemia. Efforts are currently underway to extend this promising therapy to solid tumors in addition to other hematological cancers. Here, we describe the development and production of potent CAR T cells targeting antigens with unique or preferential expression on solid and liquid tumor cells. The in vitro potency of these CAR T cells is then evaluated in real-time using the highly sensitive impedance-based xCELLigence assay. Specifically, the impact of different costimulatory signaling domains, such as glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (TNFR)-related protein (GITR), on the in vitro potency of CAR T cells is examined. This report includes protocols for: generating CAR T cells for preclinical studies using lentiviral gene transduction, expanding CAR T cells, validating CAR expression, and running and analyzing xCELLigence potency assays.

We describe a quantitative real-time in vitro cytolysis assay system to evaluate the potency of chimeric antigen receptor T cells targeting liquid and solid tumor cells. This protocol can be extended to assess other immune effector cells, as well as combination treatments.

Katı ve Hematolojik Kanser Hücrelerini Hedefleyen İmhimik Antijen Reseptör T Hücreleri Için Gerçek Zamanlı Potens Tsay

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic fever and autoimmune diseases. Since thousands of antibodies with different epitopes are circulating in blood, no universal method, except for the dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF), was reported to target specific harmful antibodies. The development of DCAF molecules makes significant contribution to the progress of targeted therapy, which were demonstrated to eliminate the antibody dependent enhancement (ADE) effect in a Dengue virus (DENV) infection model and to boost the acetylcholine receptor activity in a myasthenia gravis model. Here, we describe a protocol for the synthesis of a DCAF molecule (DCAF1), which can selectively block 4G2 antibody to attenuate ADE effect during Dengue virus infection, and illustrate the binding of DCAF1 to 4G2 antibody by an ELISA assay. In our method, DCAF1 is synthesized by the conjugation of a hydrazine derivative of a Fc-III peptide and a recombinant expressed long &#945;-helix with antigenic sequence through native chemical ligation (NCL). This protocol has been successfully applied to DCAF1 as well as other DCAF molecules for targeting their cognate antibodies.

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) is novel for the elimination of harmful antibodies. Here, we describe a detailed protocol for the synthesis of DCAF1 molecule, which can selectively block 4G2 antibody to eliminate antibody dependent enhancement effect during Dengue virus infection.

Antijenik Peptid ve Fc-III Mimetics (DCAF) Çift Fonksiyonlu Konjuge tarafından Hedefli Antikor Engelleme

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...

Assessment of Human Natural Killer Cell Events Driven by Fc&#947;RIIIa Engagement in the Presence of Therapeutic Antibodies

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and cytotoxicity, driven by Fc&#947;RIIIa (CD16) expressed on natural killer (NK) cells. These observations have led to research focusing on methods to increase Fc receptor-mediated events, which include removal of a fucose moiety found on the Fc portion of the antibody. Further studies have elucidated the mechanistic changes in signaling, cellular processes, and cytotoxic characteristics that increase ADCC activity with afucosylated antibodies. Additionally, other studies have shown the potential benefits of these antibodies in combination with small molecule inhibitors. These experiments demonstrated the molecular and cellular mechanisms underlying the benefits of using afucosylated antibodies in combination settings. Many of these observations were based on an artificial in vitro activation assay in which the Fc&#947;RIIIa on human NK cells was activated by therapeutic antibodies. This assay provided the flexibility to study downstream effector NK cell functions, such as cytokine production and degranulation. In addition, this assay has been used to interrogate signaling pathways and identify molecules that can be modulated or used as biomarkers. Finally, other therapeutic molecules (i.e., small molecule inhibitors) have been added to the system to provide insights into the combination of these therapeutics with therapeutic antibodies, which is essential in the current clinical space. This manuscript aims to provide a technical foundation for performing this artificial human NK cell activation assay. The protocol demonstrates key steps for cell activation as well as potential downstream applications that range from functional readouts to more mechanistic observations.

A protocol for studying Fc&#947;RIIIa-driven events by therapeutic antibodies in human natural killer cells is described here. This artificial stimulation platform permits the interrogation of downstream effector functions such as degranulation, chemokine/cytokine production, and signaling pathways mediated by the Fc&#947;RIIIa and Fc portions of antibodies involved in binding.

Terapötik Antikorların Varlığında FcφRIIIa Katılımı tarafından Yönlendirilen İnsan Doğal Öldürücü Hücre Olaylarının Değerlendirilmesi

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and ...

Advances in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Chimeric Antigen Receptor-Expressing Natural Killer Cells

Natural killer (NK) cells are innate immune cells that play a crucial role in the body's defense against tumors and viral infections. The generation of human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived chimeric antigen receptor (CAR) expressing NK cells has emerged as a promising avenue for "off the shelf" cancer immunotherapy. Here, we utilized an NK cell-optimized CAR construct that includes the transmembrane domain of NKG2D, the 2B4 co-stimulatory domain, and the CD3&#950; signaling domain, which has been demonstrated to stimulate robust antigen-specific NK cell-mediated antitumor activity. The use of iPSCs for CAR NK cell generation offers several advantages, including homogenous CAR expression, scalability, reproducibility, and the potential for clinical application. This detailed step-by-step protocol from cell engineering to differentiation enables the generation of NK cell-optimized iPSC-derived CAR-expressing NK cells, providing a standardized and targeted cancer immunotherapy with improved antitumor activity and highlighting their potential as a promising treatment option for various malignancies.

Here, we present a method to differentiate and expand human iPSC-derived chimeric antigen receptor (CAR)-expressing natural killer cells with improved killing against various malignancies. This protocol demonstrates the differentiation and expansion of natural killer (NK) optimized iPSC-derived CAR-NK cells and the measurement of antitumor activity against various tumor cell lines.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kimerik Antijen Reseptörü İfade Eden Doğal Öldürücü Hücrelerdeki Gelişmeler

Natural killer (NK) cells are innate immune cells that play a crucial role in the body's defense against tumors and viral infections. The generation of ...