Bu yöntem, kullanıcıların homing kinetiğini değerlendirmek ve T hücresi kalıcılığını izlemek için T hücrelerini in vivo olarak kolayca izlemelerini sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, akış sitometrisinde veya immünohistokimyada fedakarlık gerektirmeden aynı hayvan üzerinde birden fazla zaman noktasında tekrarlanabilmesidir. Bu teknik, diğer bağışıklık hücresi türlerini izlemek için de değiştirilebilir.
293T hücrelerini kültürlemek için, 110 mililitre ısıl inaktive fetal sığır serumu ve 11 mililitre penisilin streptomisin ekleyerek bir litre DMEM hazırlayın. Altıncı 293T hücrelerine beş kez 10 kez çözün ve bunları DMEM içeren bir T175 şişesine aktarın. Hücreler% 90'dan fazla birleşene gelmeden önce hücreleri altı gün boyunca her üç günde bir ila 10 arasında bölün.
Transfeksiyon için, 1,5 mililitre ortamı bir pipet kullanarak iki adet 50 mililitrelik tüpe aktarın. Bir tüpe 10 mikrogram VSVG plazmid, 20 mikrogram gag pol ve 20 mikrogram tıklama böceği kırmızı Domates veya TCMBDR lusiferaz plazmidi ekleyin ve karıştırın. Başka bir tüpe 100 mikrolitre DNA in vitro transfeksiyon reaktifi ekleyin ve karıştırın.
Her iki tüpü de oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. DNA in vitro transfeksiyon reaktifini içeren ortamı, DNA plazmidlerini içeren tüpe damla damla aktarın ve bir pipetle hafifçe karıştırın. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
Kuluçka sırasında, beş ila 10 mililitre% 0.05 tripsin ekleyerek 293T hücrelerini ayırın. Hücreler ayrıldıktan sonra, 10 mililitre ortam ekleyin ve beş dakika boyunca 800 G'de santrifüj yapın. Hücreleri 1,5 mililitre ortamda yeniden askıya alın.
DNA in vitro transfeksiyon reaktifini ve DNA plazmidlerini içeren ortamı 293T hücrelerine ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, süspansiyonu bir T175 şişesine aktarın. 18 mililitre medya ekleyin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, hücreleri ayırmadan ortamı bir cam pipetle dikkatlice aspire edin ve 18 mililitre taze ortam ile değiştirin. Yine, gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, buza konan bir pipet kullanarak viral süpernatantı çıkarın ve hücreleri ve kalıntıları pellet etmek için beş dakika boyunca 800 G'de santrifüj yapın.
Viral süpernatantı 0.22 mikronluk bir filtre kullanarak filtreleyin ve hemen buzun üzerine yerleştirin. İnsan T hücrelerinin in vitro aktivasyonu için,% 0.1 sığır serum albümini veya BSA içeren 10 mililitre PBS ve steril 15 mililitrelik bir tüpe iki milimolar EDTA ekleyin. Daha sonra boncukları yıkamak için bir tüpe boncuk ekleyin ve tüpü manyetik bir rafa yerleştirin.
İki dakika sonra, PBS'yi tüpten çıkarın. DMEM'i hazırladıktan sonra, yıkanmış boncukları ve interlökin-2 veya IL-2'yi mililitre başına 30 uluslararası birimlik son konsantrasyona ekleyin. Bir hemo sitometre ve Trypan mavisi boya kullanarak T hücrelerini sayın.
Saydıktan sonra, ortama istediğiniz sayıda T hücresi ekleyin ve karıştırmak için tüpü yavaşça ters çevirin. 24 delikli bir doku kültürü plakasının her bir kuyucuğunda iki milyon T hücresi, boncuk ve IL-2 içeren 2.5 mililitre ortam plakası. Nemlendirilmiş% 5 karbondioksitte 37 santigrat derecede kültür.
Lusiferaz ile ne zaman transdübe edileceğini belirlemek için T hücrelerini üç gün boyunca her gün 20X'lik bir hedef altında inceleyin. Daha sonra, bir RetroNectin plakası hazırlamak için, PBS'de mililitre başına iki mililitre 20 mikrogram RetroNektin ilave edilmemiş altı kuyucuklu bir plakanın kuyucuğuna ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. RetroNektin'i plakanın tabanını çizmeden aspire edin ve altı kuyucuklu plakadaki kuyucuk başına PBS'de üç mililitre% 2 BSA ekleyin.
Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, spinokülasyon için, BSA'yı aspire edin ve kuyucukları bir kez üç mililitre PBS ile yıkayın. Taze PBS ile devam edin veya değiştirin ve plakayı gece boyunca dört santigrat derecede kapalı bırakın.
Ertesi gün, kuyu başına iki mililitre TCMBDR lusiferaz viral süpernatant ekleyin ve 32 santigrat derecede 90 dakika boyunca 1.240 G'de santrifüj yapın. Transdüksiyon için, T hücrelerini saydıktan sonra, viral süpernatantı aspire edin ve insan IL-2'nin mililitresi başına 30 uluslararası birim içeren altı mililitre DMEM'de kuyu başına iki milyon T hücresini plakalayın. T hücrelerini iki gün boyunca inceleyin.
Hücreler neredeyse birleştiğinde, bir pipet kullanarak plakanın altından yavaşça yıkayın ve her bir kuyucuğu ayrı bir T75 şişesine aktarın. Şişe başına toplam 15 mililitre hacim için dokuz mililitre ortam ekleyin. Ertesi gün, 15 mililitre ortam ekleyin ve akış sitometrisi yaparak başarılı transdüksiyonu onaylayın.
Fareyi uyuşturduktan sonra, 26 gauge'lik bir iğne kullanarak, geriye dönük olarak 100 mikrolitre ortama 20 milyon T hücresi enjekte edin. T hücresi sağkalımını in vivo olarak desteklemek için 1.000 ünite rekombinant IL-2'yi deri altından uygulayın. Daha sonra bispesifik antikoru retroorbital veya intraperitoneal olarak uygulayın.
İn vivo görüntüleme için, anestezi uygulanmış bir farede 26 gauge iğne ile retroorbital enjeksiyon ile 100 mikrolitre üç miligram D-lusiferin uygulayın. Görüntü yakalamak için, fareyi görüntüleyicinin ışık geçirmez haznesine, ksenogrefti taşıyan yan taraf kameraya doğru bakacak şekilde yerleştirin. Edinme kontrol panelini kullanarak ışıldayan, fotoğraf ve bindirmeyi seçin.
Pozlama süresini otomatik, gruplamayı orta ve f-stop olarak ayarlayın ve görüntüleri alın. İlk görüntüden sonra, sonraki görüntülerin doğrudan karşılaştırılabilmesi için pozlama süresini ilk görüntü için otomatik olarak hesaplananla eşleşecek şekilde ayarlayın. Akciğerlerdeki T hücresi varlığını değerlendirmek için fare sırtüstü yatarken başka bir dizi görüntü alın.
Silahlı T hücreleri, tümöre silahsız T hücrelerinden daha hızlı kaçakçılık yaptı ve akciğerleri iki gün erken terk etti. T hücre infiltrasyonunun zaman içinde tümörlere kantitasyonu biyolüminesans ile ölçüldü ve tümör konturu üzerine entegre edilmiş piksel başına toplam sürü veya ışıma olarak ifade edildi. T hücresi kaçakçılığı, lusiferaz transdüne T hücrelerinin enjeksiyonundan sonraki 28 gün boyunca izlenebilir ve tedavi boyunca T hücresi homing ve kalıcılığının izlenmesine izin verir.
DKO farelerde HER2 pozitif insan meme kanseri hastası kaynaklı ksenogreftlere T hücresi kaçakçılığı gösterilmiştir. Susturulmamış bir FC ile HER2 bispesifik antikoru ile tedavinin, kontrollü bir bispesifik antikora kıyasla tümör büyümesi üzerinde hiçbir etkisi yoktu. Buna karşılık, tek başına veya bir K322A mutasyonu ile kombinasyon halinde N297A mutasyonu içeren HER2 bispesifik antikoru ile tedavi, tümör büyümesini tamamen durdurabilmiştir.
Susturucu mutasyonları olan gruplar için, T hücresi lüminesans sinyali, enjeksiyon sonrası üçüncü günde daha yüksek bir zirveye ulaştı ve kontrollü bispesifik antikor ve susturulmamış HER2 bispesifik antikoru ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir seviyede devam etti. Nöroblastom hastası kaynaklı ksenogreftler taşıyan fareler, Ly6C pozitif makrofajların tükenmesinin, tümörlere yönelik T hücresini önemli ölçüde artırdığını, bunun da tümör büyümesinin azalmasına ve sağkalımın uzamasına neden olduğunu göstermiştir. Etki, osteosarkom hasta kaynaklı ksenogreftlerde daha belirgindi.
Tümör antijeni STEAP1'i hedef alan bispesifik antikorlar arasında, IGGL SCFV formatı, tedavi süresince devam eden T hücrelerinin ilk dozundan sonraki altıncı günde önemli ölçüde daha fazla T hücresi infiltrasyonu ile sonuçlandı. Bu tür gözlemler in vitro sitotoksisite testleri ile tahmin edilmemiştir. T hücrelerini in vivo olarak izledikten sonra, kullanıcılar T hücrelerinin tümör veya diğer normal dokular içinde nerede bulunduğunu daha spesifik olarak belirlemek için immünohistokimya yapabilirler.
