우리 감사 히사요 노자 키 (도쿄 대학), 오 나카 다 (게이오 대학), 유카 Marukawa 하시 모토 (일본 여자 대학교), 히로유키 Sekimoto (일본 여자의 대학). 그들의 의견에 대 한 검토자에 게 감사 하 길. 이 연구는 과학의 승진, 일본, 일본 사회에서 과학 연구 (No. 26440223 및 15 H 04413)에 대 한 특정 고 유키 Tsuchikane에 새로운 기술 개발 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

1. 해 조류를 포함 하는 물 샘플의 수집
참고: 단 세포 conjugatophytes 호수, 늪, 논 등 정체 민물 지역에서 성장 한다. 조류-포함 된 물 샘플은 문화 긴장을 생산 하기 위해 이러한 환경 중 하나에서 수집 됩니다. 프로세스를 시작 하기 전에 다음과 같은 항목이 필요: 플랑크톤 넷, 일회용 피 펫, 그리고 병 또는 50 mL 튜브 물 샘플을 수집.
<ol><li>플랑크톤 호수 환경에서 인터넷을 사용 하 여 물에서 조류를 수집. 사용 목적에 따라 적절 한 net. 참고: 그물의 상부는 물 침투성. 그물에 의해 조류 그물 플랑크톤의 하단 컨테이너에 집중 된다. 굵고 메쉬 작은 조류를를 통해 전달할 수 있습니다. 좋은 메쉬 쉽게 막힌 가져옵니다.</li>
	<li>50 mL 튜브 또는 100 mL 플라스틱 병에 물 (약 50ml)을 전송 합니다. 실험실에 집중된 물 샘플을가지고.</li>
	<li>단 세포 conjugatophytes는 또한 늪 이나 논에서 성장 한다. 이 얕은 물 지역에서 조류를 포함 하는 물 샘플 직접 스포이드와 함께 샘플링 될 수 있습니다. 그런 다음, 전송 (30-50 mL) 물 50 mL 튜브 또는 50 mL 플라스틱 병. 참고: 물은 신중 하 게 샘플링 토양 표면 위의 샘플 어떤 토양을 포함 하지 않습니다.</li>
</ol>2입니다. 조류의 확인
참고: 다음 항목은 필요 시는 루 페 또는 휴대용 현미경 및 60 m m 관찰에 대 한 접시.
<ol><li>일회용 피 펫에는 샘플에 조류의 존재를 확인, 샘플을 직접 관찰 하는 루 페를 사용 합니다. 참고: 약의 더 큰 셀 400-1000 µ m 길이 (예를 들어, Closterium ehrenbergii)에 쉽게 수 있습니다이 방법을 사용 하 여 관찰.</li>
	<li>휴대용 현미경 조류를 확인 하려면 플라스틱 실험실 접시에 물 샘플을 붓는 다.<ol>
<li>윗부분의 안쪽 부분에 샘플 (약 3 mL)을 넣어 (뚜껑) 60 mm 페 트리 접시의 위에 뚜껑의 안쪽 부분을 직면 하 고 그것의 바닥 부분과 아래쪽 절반 장소. 참고:이 메서드는 이동에서 샘플을 유지 하 고 관찰을 쉽게.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 격리 한 유리 모 세관 피 펫 파스퇴르 피 펫에서의 준비
참고: 프로세스를 시작 하기 전에 다음과 같은 항목이 필요: 살 균 파스퇴르 펫, 파스퇴르 펫, 장갑, 고무 전구, 정신 램프, 유리, 쓰레기통, 집게, 라이터, 정신 램프에 대 한 메탄올에 대 한 랙 및 클린 룸 또는 층 류 흐름 후드 (필요한 경우)입니다.
<ol><li>알콜 버너 점화.<ol>
<li>격리에 대 한 정밀한 유리 모 세관 피펫은 생산, 불꽃은 경 경 하지 있는지 확인 합니다. 불꽃을 날카롭게 하 고 파스퇴르 피 펫의 끝을 녹여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>지원 되는 고무 전구 측면에 손으로 및 팁 사이드에 집게를 사용 하 여 불꽃에 파스퇴르 피 펫 멸 균 유리 열.</li>
	<li>불꽃에서 파스퇴르 피 펫을가지고 고 그것을 스트레칭.<ol>
<li>유리 용 해, 신속 하 게 불꽃에서 파스퇴르 피 펫을 제거 하 고 키를 누릅니다. 참고:이 실험에서 파스퇴르 피펫으로 확장 되었다에 의해 15-20 cm. 확인 확실을 피펫으로 불꽃을 당기는 동안.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적절 한 길이를 유리 모 세관 피 펫의 끝을 휴식. 때문에 굴복 부분은 최고의 팁에 이상적입니다. 참고:이 연구에서 5-10 cm의 팁과 유리 모 세관 피펫은 준비 되었다.<ol>
<li>그것을 용융 후 모 세관을 삭제 하 고 불꽃 나오는 것을 확인 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>거품 유리 모 세관 피 펫에서 발표 여 팁의 크기를 나타냅니다. 격리 되어야 하는 셀에 대 한 적절 한 크기를 선택 합니다. 약 1 m m 거품의 셀 폭이 10-20 µ m의 Closterium 종의 격리에 대 한 적절 한입니다.</li>
</ol>4. 단일 셀 격리 유리 모 세관 피 펫
참고: 시작 하기 전에 다음과 같은 항목이 필요: 거꾸로 가벼운 현미경, 시계 안경, 플라스틱 접시, 그리고 메 마른 스레드 시험관 CA 매체 (표 1)를 포함 하거나 CA 중간7조건.
<ol><li>몇 가지 시계 안경 (22 m m 직경에서 및 깊이 1 m m), 살 균 CA 매체의 각 포함 1 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>현장에서 수집 물 샘플에서 목표 셀을 격리 합니다.<ol>
<li>플라스틱 그릇에 대상 셀을 포함 하는 물 샘플 (약 30-40 mL)를 따르십시오.</li>
		<li>거꾸로 가벼운 현미경 플라스틱 접시에 샘플을 관찰 하는 동안 유리 모 세관 피 펫을 사용 하 여 단일 셀을 선택 합니다.</li>
		<li>모 세관 작용에 의해 세포의 포부를 촉진 하기 위하여 셀 근처 유리 모 세관 피 펫을가지고.</li>
	</ol>
</li>
	<li>살 균 CA 매체 (그림 1a)의 1 mL를 포함 하는 시계 유리에 셀을 전송 합니다.</li>
	<li>다시 새로운 유리 모 세관 피펫은 멸 균 CA 매체에서를 사용 하 여 셀을 선택 하 고 메 마른 캘리포니아 매체 (그림 1b)를 포함 하는 두 번째 시계 유리에 그것을 전송. 참고:이 프로세스는 단일 셀 자리 플레이트 (그림 1c)에 격리 될 때까지 반복 됩니다.</li>
	<li>새로운 유리 모 세관 피펫은를 사용 하 여 단일 셀을 선택 하 고 마지막으로 CA 매체 또는 조건된 CA 매체 (그림 1의 d)의 14 mL를 포함 하는 테스트 튜브에 전송. 16 h 빛: 8에서 23 ° C에서 샘플을 품 어-어두운 h 2 주 주기. 참고: 주변 환경으로 성장 하는 세포에서 분 비 되는 세포 증식에 대 한 알 수 없는 factor(s)4세포 분열 촉진 하기 위하여 조절된 매체에 포함 됩니다. 클론 문화를 설립 하는 경우 배양4에서 바른된 CA 매체를 준비 합니다. 문화 성공 하면 녹색을 돌 것 이다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wickett, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylotranscriptomic+analysis+of+the+origin+and+early+diversification+of+land+plants.">Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).</li><li>Delwiche, C. F., Cooper, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+origin+of+a+terrestrial+flora.">The evolutionary origin of a terrestrial flora.</a> Current Biology. 25, R899-R910 (2015).</li><li>Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+procedure+for+obtaining+clonal+isolation+of+diatoms.">A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms.</a> British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).</li><li>Pringsheim, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance. , 119 (1946).</li><li>Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N., Andersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+isolation+techniques+for+microalgae.">Automated isolation techniques for microalgae.</a> Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae. , 101-116 (2005).</li><li>Andersen, R. A., Kawachi, M., Andersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+microalgae+isolation+techniques.">Traditional microalgae isolation techniques.</a> Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques. , 83-100 (2005).</li><li>Abe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+nuclear+transformation+of+the+Closterium+peracerosum-strigosum-littorale+complex.">Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).</li><li>Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+processes+of+Penium+margaritaceum+(Zygnemophyceae,+Charophyta).">Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta).</a> Phycological Research. 59, 74-82 (2011).</li><li>Kanda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+knockouts+reveal+that+CpRLP1+is+a+negative+regulator+of+the+sex+pheromone+PR-IP+in+the+Closterium+peracerosum-strigosum-littorale+complex.">CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Scientific Reports. 7, 17873 (2017).</li><li>Ichimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+types+and+reproductive+isolation+in+Closterium-ehrenbergii+Meneghini.">Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini.</a> Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).</li><li>Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+physiological+properties+of+a+protein+inducing+protoplast+release+during+conjugation+in+the+Closterium+peracerosum-strigosum-littorale+complex.">Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Planta. 182, 348-354 (1990).</li><li>Ichimura, T., Watanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Closterium+calosporum+complex+from+the+Ryukyu+Islands-Variation+and+taxonomical+problems.">The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems.</a> Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).</li><li>Provasoli, L., Pintner, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+media+for+fresh-water+algae:+problems+and+suggestions+.">Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions .</a> The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959. , 84-96 (1960).</li><li>Provasoli, L., Tryon, C. A., Hartmann, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media++&amp;+prospects+for+the+cultivation+of+marine+algae.">Media &amp; prospects for the cultivation of marine algae.</a> Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan. , 63-75 (1968).</li><li>Guillard, R. R. L., Andersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+methods+for+microalgae.">Purification methods for microalgae.</a> Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae. , 117-132 (2005).</li></ol>

현재 메서드를 사용 하 여 Closterium sp.의 9 클론 문화 긴장 15 셀 60%의 성공률을 나타내는 물 샘플 (Inba1)에서 고립에서 설립 되었다. 종 식별 밖으로 미래에 형태학 관찰 분자 계통 발생 분석8같은 DNA 분석에 의해 실행 될 것 이다.
현재의 방법에서 물 샘플의 신선도 성공률에 중요 하다. 필드 컬렉션 후 즉시 물 샘플에서 세포를 분리 하는 것이 낫다. Closterium 종 (예를 들어, C. ehrenbergii, C. peracerosum-strigosum-littorale 복잡 한)의 세포는 4-8 ° C에서 그것을 저장 하 여 약 7 d 물 샘플에서 유지 될 수, 세포의 분리는 바람직한 컬렉션 또는 다음 날의 하루. 그것은 또한 세척 반복의 수를 증가 하는 그래서 대상 셀 이외의 어떤 오염 물질을 제거 하는 것이 중요 (즉, > 3 x) 미생물 토양과 셀에 의해 문화의 오염 되지 않을 수 있습니다.
이 기술은 한계 (CA 또는 CA 매체 조절된)이이 프로토콜에 사용 된 문화 미디어는 항상 모든 conjugating 조류에 대 한 적절 한입니다. 경우에 따라 그것은 다른 매체 뿐 아니라 다른 빛과 온도 조건을 사용 하 여 필요할 수 있습니다. 또한, 그것은 하나의 단일 셀에서 문화 성장 여부를 증명 하기 어려운, 그것은 테스트 튜브에 세포를 전송할 때 정확 하 게 1 셀을 선택 하는 데 필요한. 따라서, 전송 할 수 새로운 유리 모 세관 피 펫을 각 시간.
이 피 펫 세척 방법 클론 문화 수립 클래식/표준 방법 이며, 연구에 대 한 원하는 셀을 사용 하는 가장 신뢰할 수 있는 방법입니다. 많은 연구8,9,,1011 에 사용 되는 조류를 동산의 클론 문화는 현재 메서드를 사용 하 여 설치 되었다. 클론 문화 없이 변화 조류를 분석 하는 것이 어렵습니다. 또한, 최근 몇 년 동안, 드 노 보 전체 게놈 시퀀스를 (예를 들어, 미니 언 nanopore 시퀀서를 사용 하 여), 쉽게 되었고 클론 문화 구축 더 드 노 보 시퀀싱을 촉진 한다. 즉,이 메서드는 첫 번째 단계는 미래에 더 그들의 생물 다양성을 이해 하는 것이 조류의 연구.
안정적인 문화 긴장을 설정 하기 위해 그것은 정확 하 게는 프로토콜 내에서 특정 중요 한 단계를 수행 하는 데 필요한입니다. 가장 중요 한 단계는 단일 셀만의 통과 허용 하는 최적의 조리개와 유리 모 세관 피 펫의 준비 합니다. 유리 모 세관 피 펫의 조리개의 셀의 작은 축 길이 보다 약간 더 있어야 합니다. 최적의 유리 모 세관 피펫은 모 세관 작용에 의해 단일 셀을 발음 수 있습니다. 그러나, 조리개의 직경이 너무 크면, 모 세관 비 생활 오염 물질 또는 심지어 (는) 다른 organism(s), 목표 셀 외에 그릴 것입니다.
최적의 조리개와 유리 모 세관 피 펫을 얻기 위해 다음 사항을 주의 하는 중요 하다. 첫째, 불꽃의 기둥 유리 모 세관 피 펫을가 열 하는 때 좁은 수 있어야 합니다. 다음, 파스퇴르 피 펫, 당기는 불꽃;에서 제거 그렇지 않으면, 파스퇴르 피 펫의 조리개 붕괴 됩니다.
장비 및 컨테이너가이 프로토콜에 표시 된 기본은 하 고 수정할 수 있습니다. 예를 들어 사용 하 여 멀티 잘 플레이트 한 잘 시계 안경 대신, 셀 세척 할 수 있다 더 효율적. 또한, 기타 유사한 것 들에 대 한 컨테이너를 교체하실 수 있습니다. 마지막 단계에서 문화 매체에 단일 셀을 전송 하 여 클론 문화를 설정할 수 있습니다.
멸 균된 용기를 준비 하 고 후드에서 axenic (오염된) 긴장을 설정 합니다. 오염을 방지 하기 위해, 그것은 이상 3 x 신선한 aliquots와 세척 단계를 반복 해야 합니다. 가끔은, 박테리아는 또한 항생제15을 추가 하 여 멸 균.
이 방법에 초점을 맞춘 desmid (Zygnematales) 절연, 하지만 유리 모 세관 피펫은 조리개의 크기를 바꾸어 서, 그것은 다르게 크기의 플랑크톤의 고립에 적용할 수 있습니다.

동산 (의 주문 Zygnematales) 조류, 일컬어 conjugatophytes, 차지 토지 식물1,2의 즉시 조상의 가장 가까운 살아있는 친척으로 주요 계통 발생 위치. 설립된 클론 문화 조류의 분류학, 생리, 그리고 유전자 연구의 광범위 한 지난 몇 년간 끌고있다. 자연적인 분야에서 미생물의 절연 기술을 오랜 전통3,4있다. 최근 몇 년 동안, cytometry 사용 하는 기술도 있다 자동화 된 격리 설립5. 클론 문화의 설립에 대 한 단일 셀을 가져오는 데 사용 하는 가장 일반적인 방법이입니다 유리 모 세관 피펫은6을 사용 하 여 단일 셀 격리. 이 전통적인 방법 기술과 정확한 실험 프로토콜에 필요합니다.
이 문서에서 설명 해 조류의 샘플링 필드 샘플 및 Closterium 종 같은 단 세포의 변화 조류의 클론 문화의 설립에서 유리 모 세관 피 펫을 사용 하 여 합니다. 식물 세포를 포함 하는 물 샘플 필드 사이트 (예를 들면, 호수, 연못, 또는 논)에서 수집 됩니다. 세포는 유리 모 세관 피 펫을 사용 하 여 물 샘플에서 격리 하 고 씻어. 셀 16 h 빛: 8에서 24 ° C에서 질소 보충 매체 (CA 중간)를 포함 하는 테스트 튜브에 교양-h 어두운 정권. 이 메서드는 또한 클론 문화 생성 하 다른 미세 분리에 적합.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sampling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plankton net</td>
			<td>RIGO, Japan</td>
			<td>N-NO380T</td>
			<td>Mesh size: 32 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE)</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>JAN: 4960759 206725</td>
			<td>Magnification: 20&#215;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier)</td>
			<td>Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan</td>
			<td>1985-20</td>
			<td>Magnification: 20&#215;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spuit</td>
			<td>EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan</td>
			<td>Sterile spuit No.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps)</td>
			<td>Labcon, USA</td>
			<td>3181-345-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle (100 mL Polycarbonate bottle)</td>
			<td>AS ONE Corporation, Japan</td>
			<td>1-7403-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish</td>
			<td>Asahi glass Co. Ltd., Japan</td>
			<td>1010-060</td>
			<td>&#160;For observation of algae.&#160; 60 mm/non-treated dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of a micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes (cotton plugged 9&#8221; Pasteur Pipettes)</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>7 &#215; 225 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc)</td>
			<td>AS ONE Corporation, Japan</td>
			<td>5-5669-01</td>
			<td>10 &#215; 40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless forceps</td>
			<td>AS ONE Corporation, Japan</td>
			<td>PT-09</td>
			<td>110 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-cell isolation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch glass (Blood reaction board)</td>
			<td>Sekiya Rika Co., Ltd, Japan</td>
			<td>F14-155-030</td>
			<td>to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded test tubes&#160;</td>
			<td>Fujimotorika, Co., Ltd, Japan</td>
			<td>XX142</td>
			<td>18 &#216; &#215; 170 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>CKX41N</td>
			<td>for isolation of algae.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic dish</td>
			<td>Asahi glass Co. Ltd., Japan</td>
			<td>SH90-15E&#160;</td>
			<td>&#160;90 &#215; 15 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of a clonal culture of unicellular conjugating algae

다양 한 주제, 생리학, 유전학, 분류학, 미생물학 등의 연구에 사용 하기 위해 미세 클론 문화 확립에 필수적 이다. 따라서, 매우 클론 문화를 구축 하는 기술을 개발 하는 것이 중요 하다. 이 문서에서는, conjugating 조류의 클론 문화의 설립을 설명합니다. 물 샘플은 현장에서 수집 됩니다. 그 후, 세포를 유리 모 세관 피 펫, 미디어에 배치 하 고 클론 문화 생성을 위해 적당 한 조건 하에서 재배를 사용 하 여 격리 됩니다.

50 mL의 물 샘플 (Inba1) 한 샘플링 지점 호수 바 numa에서에서 수집 (pH 8.1 24.7 ° C; 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E)에 사쿠라 시, 치 바, 일본, 6 월 25 일, 2016. 물 샘플은 4-8 ° c.에 저장 된 Closterium sp.의 표본 수집 후 다음날 식물 세포를 포함 하는 물 샘플에서 분리 했다. 동일한 형태학의 15 식물 세포 (Inba1-1,-2,-3,-4,-5,-6,-7,-8,-9,-10,-11,-12,-13,-14, 및-15) 샘플에서 고립 되었고 다음 세척 방법 피 펫을 사용 하 여 세척. 15 고립 된 단일 셀 조건된 CA 매체의 15 mL를 포함 하는 독립적인 테스트 튜브에 교양 있었다. 2 주 후 부 화, 세포 증식 9 테스트 튜브에서 관찰 되었다 [Inba1-1,-3,-4,-5 (그림 2a),-6,-9,-10,-(그림 2b), 12와-13; 표 2]입니다. 9 클론 문화 Inba1 샘플 분리 (그림 3)에서 설립 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig1.jpg"> 그림 1 : 단일 셀 격리의 흐름. 첫 번째 시계 유리에서 (은)는 살 균을 원래 물 샘플에서 단일 대상 조류 셀 전송 매체. (b, c) 씻어 다음 시계 유리 셀을 다시 전송 합니다. 없는 다른 셀/오염 매체; 대상 보다는 때까지이 절차를 반복 해야 합니다. 3 개의 시계 유리는 예를 들어 여기에 다이어그램에 표시 됩니다. (d) 마지막으로, 성장에 대 한 적절 한 매체의 테스트 튜브를 씻어 셀을 전송. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57761/57761fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2.jpg"> 그림 2 : 식물 세포의 사진 Closterium sp. (한) Inba1-5와 (b) Inba1-12 여기에 표시 됩니다. 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig3.jpg"> 그림 3 : Inba1 샘플에서 클론 문화의 설립. 2 주 동안 배양 시험관 바닥에서 촬영 했다. 별표는 셀 확산을 나타냅니다. 눈금 막대 = 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57761/57761fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>미디어의 이름</td>
			<td>참조</td>
			<td colspan="2">코멘트</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="13">CA</td>
			<td rowspan="13">Ichimura와 와타나베12
</td>
			<td>캘리포니아 (3)2·4H2O</td>
			<td>2 밀리 그램</td>
		</tr>
<tr>
<td>알 것3
</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH43
</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Β-나2glycerophosphate·5H2O</td>
			<td>3 밀리 그램</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4·7H2O</td>
			<td>2 밀리 그램</td>
		</tr>
<tr>
<td>비타민 B12</td>
			<td>0.01 μ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>비타민 b 복합체</td>
			<td>0.01 μ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>티 아민 HCl</td>
			<td>1 μ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>PIV 금속</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fe (EDTA;로 1:1 어 금 니)</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">100 mL를 만들기 위해 물을 추가합니다</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">pH 7.2 NaOH로 조정</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">P 4 금속</td>
			<td rowspan="7">Provasoli 및 Pintner13
</td>
			<td>나2EDTA·2H2O</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>FeCl3·6H2O</td>
			<td>19.6 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>MnCl2· 4 H2O</td>
			<td>3.6 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZnCl2*</td>
			<td>1.04 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>CoCl2·6H2O</td>
			<td>0.4 밀리 그램</td>
		</tr>
<tr>
<td>나2무4·2H2O</td>
			<td>0.25 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">100 mL를 만들기 위해 물을 추가합니다</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Fe (EDTA;로 1:1 어 금 니)</td>
			<td rowspan="3">Provasoli14
</td>
			<td>Fe (NH4)2(이렇게4)2·6H2O,</td>
			<td>70.2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2EDTA·2H2O,</td>
			<td>66 밀리 그램</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">100 mL를 만들기 위해 물을 추가합니다</td>
		</tr>
<tr>
<td>바른된 CA 매체</td>
			<td>아베 외7
</td>
			<td colspan="2">14-20 일에 대 한 신선한 CA 매체에 세포를 품 어. 교양된 매체 여과 질적 필터 종이 사용 하 여 수집 하 고 압력가 마로 소독 (15 분 동안 121 ° C)에 의해 필터링 된 매체를 소독.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">*에 NIES 1.04 mg ZnCl2 2.2 mg ZnSO4·7H2o.에 의해 대체 됩니다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1:이 연구에 사용 된 미디어의 공식.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>물 샘플</td>
			<td>셀의 이름</td>
			<td>문화 후 상태</td>
			<td>스트레인 이름</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="15">Inba1</td>
			<td>-1</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>Inba1-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>-2</td>
			<td>변경 되지</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-3</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-3</td>
		</tr>
<tr>
<td>-4</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>-5</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>-6</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>-7</td>
			<td>변경 되지</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-8</td>
			<td>변경 되지</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-9</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-9</td>
		</tr>
<tr>
<td>-10</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>-11</td>
			<td>변경 되지</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-12</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-12</td>
		</tr>
<tr>
<td>-13</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-13</td>
		</tr>
<tr>
<td>-14</td>
			<td>변경 되지</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-15</td>
			<td>변경 되지</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 2:에서 격리 시험 요약입니다.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae at JoVE.com

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

단 세포 변화 조류의 클론 문화 설립

이 문서에서는, 종의 단 세포 변화 조류 자연 필드 사이트에서 수집 된 클론 문화의 설립을 설명 합니다.

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

establishment-of-a-clonal-culture-of-unicellular-conjugating-algae

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K 조회수.  Japan Women's University. 이 문서에서는, 종의 단 세포 변화 조류 자연 필드 사이트에서 수집 된 클론 문화의 설립을 설명 합니다.

비디오: Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

Clonal 확장 CD133 + 간 줄기 세포의 분리

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale expansion, may become cumbersome, laborious and time-consuming when large numbers of cells are required. To address this need, the performance of a new multi-layered cell culture vessel to facilitate easy scale up of cells from single layered T-flasks will be discussed. The flasks tested are available in 3- and 5-layer format and enable culture and complete recovery of three and five times the number of cells respectively, compared to T-175 flasks. A key feature of the BD Multi-Flask is a mix/equilibration port that allows rapid in-vessel mixing as well as uniform distribution of cells and reagents within and 
between layers of each vessel and consistently produce cells that can be cultured in an environment that is congruent to T-175 flasks.
The design of these Multi-Flasks also allows for convenient pipette access for adding reagents and cells directly into the flasks as well as efficient recovery of valuable cells and reagents and reduces risk of contamination due to pouring. For applications where pouring is preferred over pipetting, the design allows for minimal residual liquid retention so as to reduce wastage of valuable cells and reagents.

Cells play an instrumental and increasing role in research, and the discovery and development of new therapeutics. With this increasing need for greater number of cells we need more efficient and effective ways for growing and harvesting attachment dependent cells. A Multilayered flask with the right features can serve this purpose.

새로운 Multilayered 플라스크를 사용하여 포유류 세포 배양의 스케일 업

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale ...

Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a chemically stratified water column and unlike other inland bodies of water, largely prevents external input of carbon and nutrients from streams. Biota are exposed to numerous environmental stresses, including year-round severe nutrient deficiency, low temperatures, extreme shade, hypersalinity, and 24-hour darkness during the winter 1. These extreme environmental conditions limit the biota in Lake Bonney almost exclusively to microorganisms 2.
Single-celled microbial eukaryotes (called "protists") are important players in global biogeochemical cycling 3 and play important ecological roles in the cycling of carbon in the dry valley lakes, occupying both primary and tertiary roles in the aquatic food web. In the dry valley aquatic food web, protists that fix inorganic carbon (autotrophy) are the major producers of organic carbon for organotrophic organisms 4, 2. Phagotrophic or heterotrophic protists capable of ingesting bacteria and smaller protists act as the top predators in the food web 5. Last, an unknown proportion of the protist population is capable of combined mixotrophic metabolism 6, 7. Mixotrophy in protists involves the ability to combine photosynthetic capability with phagotrophic ingestion of prey microorganisms. This form of mixotrophy differs from mixotrophic metabolism in bacterial species, which generally involves uptake dissolved carbon molecules. There are currently very few protist isolates from permanently ice-capped polar lakes, and studies of protist diversity and ecology in this extreme environment have been limited 8, 4, 9, 10, 5. A better understanding of protist metabolic versatility in the simple dry valley lake food web will aid in the development of models for the role of protists in the global carbon cycle.
We employed an enrichment culture approach to isolate potentially phototrophic and mixotrophic protists from Lake Bonney. Sampling depths in the water column were chosen based on the location of primary production maxima and protist phylogenetic diversity 4, 11, as well as variability in major abiotic factors affecting protist trophic modes: shallow sampling depths are limited for major nutrients, while deeper sampling depths are limited by light availability. In addition, lake water samples were supplemented with multiple types of growth media to promote the growth of a variety of phototrophic organisms.
RubisCO catalyzes the rate limiting step in the Calvin Benson Bassham (CBB) cycle, the major pathway by which autotrophic organisms fix inorganic carbon and provide organic carbon for higher trophic levels in aquatic and terrestrial food webs 12. In this study, we applied a radioisotope assay modified for filtered samples 13 to monitor maximum carboxylase activity as a proxy for carbon fixation potential and metabolic versatility in the Lake Bonney enrichment cultures.

Microbial eukaryotes are both a source of photosynthetically-derived carbon and top predatory species in permanently ice-covered Antarctic lakes. This report describes an enrichment culture approach to isolate metabolically versatile microbial eukaryotes from the Antarctic lake, Lake Bonney, and assesses inorganic carbon fixation potential using a radioisotope assay for Ribulose-1,5-bisphophate carboxylase oxygenase (RubisCO) activity.

탄소 고정 가능성 화학 층상 남극 호수 및 평가에서 미생물 진핵 농축 문화의 확립

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

이식편 문화 치아 세균의 개발을 다음과 같은 사항에 대해 슬라이스 문화 방법

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls and carotenoids. In vivo, these proteins are folded with pigments to form complexes which are inserted in the thylakoid membrane of the chloroplast. The high similarity in the chemical and physical properties of the members of the family, together with the fact that they can easily lose pigments during isolation, makes their purification in a native state challenging. An alternative approach to obtain homogeneous preparations of LHCs was developed by Plumley and Schmidt in 19871, who showed that it was possible to reconstitute these complexes in vitro starting from purified pigments and unfolded apoproteins, resulting in complexes with properties very similar to that of native complexes. This opened the way to the use of bacterial expressed recombinant proteins for in vitro reconstitution. The reconstitution method is powerful for various reasons: (1) pure preparations of individual complexes can be obtained, (2) pigment composition can be controlled to assess their contribution to structure and function, (3) recombinant proteins can be mutated to study the functional role of the individual residues (e.g., pigment binding sites) or protein domain (e.g., protein-protein interaction, folding). This method has been optimized in several laboratories and applied to most of the light-harvesting complexes. The protocol described here details the method of reconstituting light-harvesting complexes in vitro currently used in our laboratory, and examples describing applications of the method are provided.

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

식물과 녹조류의 빛 수확 단지의 체외의 재구성에

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

그노토바이오틱 아메리칸 바퀴벌레설립 및 유지보수(페리플라나 아메리카나)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

소 난소 피질 조직 배양

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the executor for most of the liver functions, primary hepatocytes have limited proliferating capacity. This requires the establishment of ex vivo hepatocyte expansion models for liver physiological and pathological research. Here, we isolated murine hepatocytes by two steps of collagenase perfusion and established a 3D organoid culture as the 'mini-liver' to recapitulate cell-cell interactions and physical functions. The organoids consist of heterogeneous cell populations including progenitors and mature hepatocytes. We introduce the process in detailed to isolate and culture the murine hepatocytes or fetal hepatocyte to form organoids within 2-3 weeks and show how to passage them by mechanically pipetting up and down. In addition, we will also introduce how to digest the organoids into single cells for lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering. The organoids can be used for drug screens, disease modelling, and basic liver research by modeling liver biology and pathobiology.

A long-term ex vitro 3D organoid culture system was established from mouse hepatocytes. These organoids can be passaged and genetically manipulated by lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering.