Ringraziamo Hisayoshi Nozaki (Università di Tokyo), Takashi Nakada (Keio University), Yuka Marukawa Hashimoto (Università femminile del Giappone) e Hiroyuki Sekimoto (Università femminile del Giappone). Desideriamo ringraziare gli utenti per i loro commenti. Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione per la ricerca scientifica (n. 26440223 e H 15 04413) della Japan Society per la promozione della scienza, Giappone e da una sovvenzione della Fondazione di sviluppo di tecnologia nuova per Yuki Tsuchikane.

1. raccolta di un campione di acqua contenente alghe
Nota: Conjugatophytes unicellulari crescere nelle aree di acqua dolce stagnante, come laghi, paludi e risaie. Un campione di acqua contenente alghe raccolti da uno di questi ambienti per la produzione di un ceppo di cultura. I seguenti elementi sono necessari prima di iniziare il processo: un plancton netto, una pipetta monouso e una bottiglia o un tubo da 50 mL per la raccolta di campioni di acqua.
<ol><li>Utilizzare un plancton netto in un ambiente di lago per raccogliere le alghe dall'acqua. Utilizzare una rete appropriata, a seconda dello scopo. Nota: La parte superiore della rete è permeabile all'acqua. Le alghe catturate dalla rete sono concentrate nel contenitore inferiore del plancton netto. Un grossolano permette piccole alghe di passare attraverso. Una maglia fine intasarsi facilmente.</li>
	<li>Trasferire l'acqua (circa 50 mL) per il tubo da 50 mL o una bottiglia di plastica di 100 mL. Portare il campione di acqua concentrata al laboratorio.</li>
	<li>Conjugatophytes unicellulari anche crescere in paludi o campi di risaia. In queste zone di acque basse, campione di acqua contenente alghe può campionare direttamente con un contagocce. Quindi, trasferire l'acqua (30-50 mL) per il tubo da 50 mL o una bottiglia di plastica di 50 mL. Nota: L'acqua viene campionata attentamente sopra la superficie del terreno, affinché il campione non contiene alcun terreno.</li>
</ol>2. conferma delle alghe
Nota: Sono necessari i seguenti elementi: una lente di ingrandimento o microscopio portatile e un 60 mm piatto per l'osservazione.
<ol><li>Per confermare la presenza di alghe nel campione mentre è nella pipetta usa e getta, è possibile utilizzare la lente di ingrandimento per osservare il campione direttamente. Nota: Più grandi cellule di circa 400-1.000 µm di lunghezza (ad es., Closterium trifasciata) può essere facilmente osservato utilizzando questo metodo.</li>
	<li>Per confermare le alghe al microscopio portatile, versare il campione di acqua in un piatto di plastica di laboratorio.<ol>
<li>Mettere il campione (3 mL circa) sulla parte interna della metà superiore (coperchio) di 60 mm di Petri, quindi posizionare la metà inferiore, con la sua parte inferiore rivolta verso la parte interna del coperchio, sulla parte superiore. Nota: Questo metodo conserva il campione da movimento e rende più facile l'osservazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparazione di una pipetta capillare di vetro da una pipetta Pasteur per l'isolamento
Nota: Prima di iniziare il processo, sono necessari i seguenti elementi: sterilizzato pipette Pasteur, un rack per le pipette Pasteur, guanti, un bulbo di gomma, una lampada a spirito, metanolo per la lampada di spirito, un accendino, forcipe, un bidone per il vetro e una camera pulita o laminare Cappa a flusso (se necessario).
<ol><li>Accendere un bruciatore ad alcool.<ol>
<li>Per produrre una pipetta capillare di vetro fine per l'isolamento, assicurarsi che la fiamma non è tremolante. Affilare la fiamma e fate sciogliere la pipetta di Pasteur alla sua punta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Un vetro sterile pipetta di Pasteur sulla fiamma, supportata dal lato del bulbo di gomma a mano e sul lato di punta usando il forcipe di calore.</li>
	<li>Prendere la pipetta di Pasteur spegne la fiamma e allungarlo.<ol>
<li>Quando il vetro si sta sciogliendo, rimuovere rapidamente la pipetta di Pasteur dalla fiamma e poi tirare. Nota: In questo esperimento, la pipetta di Pasteur è stata estesa da 15-20 cm. Make sicuro che la pipetta è spento la fiamma durante il tiro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rompere la punta della pipetta capillare di vetro alla lunghezza corretta. Poiché la parte di curvatura è la più bella, è ideale per la punta. Nota: In questo studio, è stata preparata una pipetta capillare di vetro con una mancia di 5-10 cm.<ol>
<li>Assicurarsi di eliminare il capillare dopo fusione esso e confermare che la fiamma è messo fuori.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Le bolle rilasciate dalla pipetta capillare di vetro indicano le dimensioni della punta di apertura. Selezionare il formato corretto per la cella di essere isolato. Circa 1 mm di bolle è corretto per l'isolamento di specie Closterium , con larghezze di cella di 10-20 µm.</li>
</ol>4. single-cell isolamento mediante una pipetta capillare di vetro
Nota: I seguenti elementi sono necessari prima di iniziare: un microscopio ottico invertito, vetri da orologio, un piatto di plastica e sterile filettati provette contenenti CA mezzo (tabella 1) o condizionata CA media7.
<ol><li>Preparare alcuni vetri da orologio (22 mm di diametro e profondità di 1 mm), ciascuno contenente 1 mL di mezzo sterile di CA.</li>
	<li>Isolare una cellula bersaglio del campione di acqua raccolti sul campo.<ol>
<li>Versare il campione di acqua (circa 30-40 mL) contenenti cellule bersaglio nel piatto in plastica.</li>
		<li>Osservando l'esempio nel piatto di plastica sotto un microscopio ottico invertito, raccogliere singole cellule con la pipetta capillare di vetro.</li>
		<li>Portare la pipetta capillare di vetro accanto alla cella per facilitare l'aspirazione della cellula per azione capillare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire le cellule in un vetro da orologio contenente 1 mL di mezzo di CA sterile (Figura 1a).</li>
	<li>Pick up le celle utilizzando nuovamente una nuova pipetta capillare di vetro dal mezzo CA sterile e trasferirlo in un vetro da orologio secondo contenente mezzo sterile di CA (Figura 1b). Nota: Questo processo viene ripetuto fino a quando una singola cellula è isolata nella piastra di spot (Figura 1C).</li>
	<li>Pick up la singola cella usando una nuova pipetta capillare di vetro e infine di trasferirlo in una provetta contenente 14 mL di medium di CA o medium condizionato di CA (Figura 1D). Incubare il campione a 23 ° C sotto una luce: 8 16-h-h scuro ciclo per 2 settimane. Nota: I fattore sconosciuti per proliferazione delle cellule, che sono secreti dalle cellule crescenti nell'ambiente circostante, sono inclusi nel medium condizionato per facilitare la divisione cellulare4. Se viene stabilita una cultura clonale, preparare il medium condizionato di CA dal terreno di coltura4. La cultura diventa verde se l'operazione riesce.</li>
</ol>

<ol>
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Utilizzando il presente metodo, ceppi 9 cultura clonale di SP. Closterium sono stati stabiliti da 15 cellule isolate dal campione di acqua (Inba1), che rappresenta un tasso di successo del 60%. Identificazione di specie avverrà in futuro di osservazione morfologica, come pure le analisi del DNA, ad esempio analisi filogenetica molecolare8.
Nel presente metodo, la freschezza del campione d'acqua è importante per il tasso di successo. Si consiglia di isolare le cellule dai campioni di acqua appena possibile dopo la raccolta di campi. Anche se le cellule della specie Closterium (ad es., c. trifasciata, c. peracerosum-strigosum-littorale complessi) possono essere mantenute nel campione d'acqua per circa 7 d memorizzandolo a 4-8 ° C, l'isolamento delle cellule è auspicabile il giorno di raccolta o il giorno successivo. È anche importante rimuovere eventuali contaminanti diversi da cellule bersaglio, aumentando così il numero di ripetizioni di lavaggio (cioè, > 3 x) può impedire una contaminazione delle colture di microrganismi nel suolo e nelle cellule.
Una limitazione di questa tecnica è che i mezzi di coltura utilizzati in questo protocollo (CA o medium condizionato di CA) non sono sempre appropriati per coniugare tutte le alghe. In alcuni casi, può essere necessario considerare l'utilizzo di un altro supporto, come pure luce diversa e condizioni di temperatura. Inoltre, come è difficile dimostrare se una cultura è cresciuta da una singola cella, è necessario raccogliere con precisione solo 1 cella durante il trasferimento di cellule in una provetta. Di conseguenza, il trasferimento deve essere effettuato con una pipetta capillare di vetro nuovo ogni volta.
Creazione di una cultura clonale con questa pipetta metodo di lavaggio è un metodo standard di classico/ed è il metodo più affidabile per utilizzare per isolare le cellule desiderate per uno studio. Le culture clonale di alghe utilizzate in molti studi8,9,10,11 di coniugazione sono state stabilite utilizzando il presente metodo. È difficile analizzare la coniugazione alghe senza una cultura clonale. Inoltre, negli ultimi anni, de novo intero genoma sequenze sono diventato facile da ottenere (ad esempio, utilizzando il MinION nanopore sequencer) e instaurazione delle colture clonali faciliterà ulteriormente sequenziamento de novo . In altre parole, questo metodo è il primo passo in futuro lo studio di queste alghe per capire meglio la loro biodiversità.
Al fine di stabilire un ceppo stabile di cultura, è necessario eseguire alcuni passaggi critici con precisione all'interno del protocollo. Il passo più importante è la preparazione di una pipetta capillare di vetro con un'apertura ottima per permettere il passaggio di una singola cella solo. L'apertura della pipetta capillare di vetro deve essere leggermente superiore alla lunghezza di asse minore della cellula di interesse. La pipetta capillare di vetro ottimale può aspirare a una singola cella per azione capillare. Tuttavia, se il diametro del diaframma è troppo grande, il capillare si baserà anche in materiali contaminanti non viventi o anche (un) altro microrganismo, oltre alla cella di destinazione.
Per ottenere una pipetta capillare di vetro con un'apertura ottimale, i seguenti punti sono importanti da notare. In primo luogo, il pilastro della fiamma deve essere stretto durante il riscaldamento la pipetta capillare di vetro. Successivamente, quando si tira la pipetta di Pasteur, deve essere rimosso dalla fiamma; in caso contrario, l'apertura della pipetta Pasteur crollerà.
Le attrezzature e i contenitori mostrati in questo protocollo sono essenziali e possono essere modificati. Ad esempio, utilizzando piastre multi-pozzetto anziché vetri da orologio con un pozzo, il lavaggio della cella possa essere resi più efficiente. Inoltre, i contenitori possono essere sostituiti per altri simili. Con il trasferimento di una singola cella al terreno di coltura nell'ultima fase, può essere stabilita una cultura clonale.
Preparare un contenitore sterile e lavorando in un cappuccio stabilirà axeniche ceppi (incontaminate). Per evitare la contaminazione, è necessario ripetere la fase di lavaggio con aliquote fresche più di 3 volte. A volte, i batteri sono anche sterilizzati aggiungendo antibiotici15.
Questo metodo focalizzato su desmid (Zygnematales) isolamento, ma modificando le dimensioni dell'apertura di pipetta capillare di vetro, può essere applicato per l'isolamento di plancton di dimensioni diverse.

Coniugando le alghe (dell'ordine Zygnematales), noto anche come conjugatophytes, occupano una posizione filogenetica chiave come i parenti viventi più vicini degli antenati immediati di terra piante1,2. Stabilito culture clonale di alghe hanno portato a una vasta gamma di studi tassonomici, fisiologici e genetici negli ultimi anni. Le tecniche di isolamento di microrganismi da un campo naturale hanno una lunga tradizione3,4. Negli ultimi anni, automatizzato isolamento tecniche mediante citometria a flusso sono stati stabiliti5. Il metodo più comune utilizzato per ottenere una singola cella per la creazione di una cultura clonale è l'isolamento di singole cellule utilizzando una pipetta capillare di vetro6. Questo metodo tradizionale richiede abilità e un preciso protocollo sperimentale.
In questo articolo, dimostriamo il campionamento di alghe da campioni del campo e la creazione di culture clonale di alghe unicellulari coniugazione, come le specie di Closterium , utilizzando una pipetta capillare di vetro. Un campione di acqua contenente cellule vegetative è raccolti da un sito di campo (ad es., un lago, stagno o campo di risaia). Le cellule sono isolate dal campione acqua utilizzando una pipetta capillare di vetro e poi lavate. Le cellule sono coltivate in una provetta contenente azoto-completati medio (CA medio) a 24 ° C sotto una luce: 8 16-h-h regime scuro. Questo metodo è anche adatto per l'isolamento di altre microalghe per generare colture clonali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sampling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plankton net</td>
			<td>RIGO, Japan</td>
			<td>N-NO380T</td>
			<td>Mesh size: 32 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE)</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>JAN: 4960759 206725</td>
			<td>Magnification: 20&#215;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier)</td>
			<td>Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan</td>
			<td>1985-20</td>
			<td>Magnification: 20&#215;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spuit</td>
			<td>EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan</td>
			<td>Sterile spuit No.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps)</td>
			<td>Labcon, USA</td>
			<td>3181-345-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle (100 mL Polycarbonate bottle)</td>
			<td>AS ONE Corporation, Japan</td>
			<td>1-7403-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish</td>
			<td>Asahi glass Co. Ltd., Japan</td>
			<td>1010-060</td>
			<td>&#160;For observation of algae.&#160; 60 mm/non-treated dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of a micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes (cotton plugged 9&#8221; Pasteur Pipettes)</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>7 &#215; 225 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc)</td>
			<td>AS ONE Corporation, Japan</td>
			<td>5-5669-01</td>
			<td>10 &#215; 40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless forceps</td>
			<td>AS ONE Corporation, Japan</td>
			<td>PT-09</td>
			<td>110 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-cell isolation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch glass (Blood reaction board)</td>
			<td>Sekiya Rika Co., Ltd, Japan</td>
			<td>F14-155-030</td>
			<td>to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded test tubes&#160;</td>
			<td>Fujimotorika, Co., Ltd, Japan</td>
			<td>XX142</td>
			<td>18 &#216; &#215; 170 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>CKX41N</td>
			<td>for isolation of algae.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic dish</td>
			<td>Asahi glass Co. Ltd., Japan</td>
			<td>SH90-15E&#160;</td>
			<td>&#160;90 &#215; 15 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of a clonal culture of unicellular conjugating algae

È essenziale stabilire colture clonali di microalghe per uso negli studi di vari argomenti, quali fisiologia, genetica, tassonomia e microbiologia. Pertanto, è estremamente importante sviluppare tecniche per stabilire culture clonale. In questo articolo, dimostriamo l'istituzione delle culture clonale di un'alga coniugazione. Campioni di acqua sono raccolti dal campo. Successivamente, le cellule sono isolate utilizzando una pipetta capillare di vetro, inseriti nei media e coltivate in condizioni idonee per la generazione di una cultura clonale.

Un campione di acqua (Inba1) da 50 mL è stato raccolto da un punto di campionamento nel lago Inba-numa (pH 8.1, 24,7 ° C; 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E) al Sakura-shi, Chiba, Giappone, il 25 giugno 2016. Il campione è stato conservato a 4-8 ° C. Il giorno successivo dopo la raccolta, un esemplare di Closterium SP. è stato isolato dal campione di acqua contenente cellule vegetative. Quindici cellule vegetative di morfologia identica (Inba1-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14 e -15) sono stati isolati dal campione e poi lavati con la pipetta metodo di lavaggio. Quindici isolate singole cellule sono state coltivate in provette indipendente contenente 15 mL di medium condizionato di CA. Dopo 2 settimane di incubazione, la proliferazione delle cellule è stata osservata in 9 provette [Inba1-1, -3, -4, -5 (Figura 2a), -6, -9, -10, -12 (Figura 2b) e -13; Tabella 2]. Nove culture clonali sono state stabilite dagli isolati di campione Inba1 (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig1.jpg"> Figura 1 : Il flusso di isolamento di singole cellule. (un) trasferimento delle cellule algali il singolo bersaglio da campione originale alla sterile medie il primo vetro d'orologio. (b, c) Trasferire di nuovo la cella per il vetro d'orologio prossimo a lavare. Questa procedura deve essere ripetuta fino a quando non ci sono nessun altre cellule/contaminanti rispetto l'obiettivo nel medio; tre vetri da orologio sono mostrati nel diagramma qui come esempio. (d) Infine, trasferire la cella lavata in una provetta del mezzo appropriato per la crescita. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57761/57761fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2.jpg"> Figura 2 : Fotografie di cellule vegetative di Closterium SP. (un) Inba1-5) e (b) Inba1-12 sono mostrati qui. La barra della scala = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig3.jpg"> Figura 3 : Creazione di una cultura clonale del campione di Inba1. Le provette per 2 settimane in coltura sono state fotografate dal basso. Un asterisco indica la proliferazione delle cellule. La barra della scala = 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57761/57761fig3large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome del supporto</td>
			<td>Riferimento</td>
			<td colspan="2">Commenti</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="13">CA</td>
			<td rowspan="13">Ichimura e Watanabe12
</td>
			<td>CA (NO3)2·4H2O</td>
			<td>2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>KNO3
</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4NO3
</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Β-Na2glycerophosphate·5H2O</td>
			<td>3 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4·7H2O</td>
			<td>2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vitamina B12</td>
			<td>0,01 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotina</td>
			<td>0,01 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tiamina HCl</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metalli PIV</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fe (come EDTA; molare 1:1)</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Aggiungere acqua per fare 100 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">pH regolare con NaOH per 7.2</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">Metalli di P IV</td>
			<td rowspan="7">Provasoli e oviducal13
</td>
			<td>Na2EDTA·2H2O</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>FeCl3·6H2O</td>
			<td>19,6 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>MnCl2· 4H2O</td>
			<td>3,6 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZnCl2*</td>
			<td>1,04 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>CoCl2·6H2O</td>
			<td>0,4 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>4·2H na2MoO2, O</td>
			<td>0,25 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Aggiungere acqua per fare 100 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Fe (come EDTA; molare 1:1)</td>
			<td rowspan="3">Provasoli14
</td>
			<td>Fe (NH4)2(quindi4)2·6H2O,</td>
			<td>70,2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2EDTA·2H2O,</td>
			<td>66 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Aggiungere acqua per fare 100 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Medium condizionato di CA</td>
			<td>Abe et al.7
</td>
			<td colspan="2">Incubare le cellule in medium CA fresco per 14 – 20 giorni. Raccogliere il mezzo di colto mediante filtrazione utilizzando carta da filtro qualitativa e sterilizzare il mezzo filtrato in autoclave (121 ° C per 15 min).</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">* Il NIES, 1,04 mg ZnCl2 è sostituito dal 2,2 mg ZnSO4·7H2O.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Formulazioni i supporti utilizzati in questo studio.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Campione di acqua</td>
			<td>Nome della cella</td>
			<td>Stato dopo cultura</td>
			<td>Nome della razza</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="15">Inba1</td>
			<td>-1</td>
			<td>Le cellule hanno proliferato</td>
			<td>Inba1-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>-2</td>
			<td>Non modificato</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-3</td>
			<td>Le cellule hanno proliferato</td>
			<td>inba1-3</td>
		</tr>
<tr>
<td>-4</td>
			<td>Le cellule hanno proliferato</td>
			<td>inba1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>-5</td>
			<td>Le cellule hanno proliferato</td>
			<td>inba1-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>-6</td>
			<td>Le cellule hanno proliferato</td>
			<td>inba1-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>-7</td>
			<td>Non modificato</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-8</td>
			<td>Non modificato</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-9</td>
			<td>Le cellule hanno proliferato</td>
			<td>inba1-9</td>
		</tr>
<tr>
<td>-10</td>
			<td>Le cellule hanno proliferato</td>
			<td>inba1-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>-11</td>
			<td>Non modificato</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-12</td>
			<td>Le cellule hanno proliferato</td>
			<td>inba1-12</td>
		</tr>
<tr>
<td>-13</td>
			<td>Le cellule hanno proliferato</td>
			<td>inba1-13</td>
		</tr>
<tr>
<td>-14</td>
			<td>Non modificato</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-15</td>
			<td>Non modificato</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Il riassunto prova di isolamento.

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Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

Creazione di una cultura clonale di alghe unicellulari coniugazione

In questo articolo, dimostriamo l'istituzione delle culture clonale di specie algali coniugazione unicellulari raccolti da un sito di campo naturale.

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.1K Views.  Japan Women's University. In questo articolo, dimostriamo l'istituzione delle culture clonale di specie algali coniugazione unicellulari raccolti da un sito di campo naturale.

Video: Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Ricerca

Biologia

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

Isolamento di cellule CD133 + staminali del fegato per l&#39;espansione clonale

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale expansion, may become cumbersome, laborious and time-consuming when large numbers of cells are required. To address this need, the performance of a new multi-layered cell culture vessel to facilitate easy scale up of cells from single layered T-flasks will be discussed. The flasks tested are available in 3- and 5-layer format and enable culture and complete recovery of three and five times the number of cells respectively, compared to T-175 flasks. A key feature of the BD Multi-Flask is a mix/equilibration port that allows rapid in-vessel mixing as well as uniform distribution of cells and reagents within and 
between layers of each vessel and consistently produce cells that can be cultured in an environment that is congruent to T-175 flasks.
The design of these Multi-Flasks also allows for convenient pipette access for adding reagents and cells directly into the flasks as well as efficient recovery of valuable cells and reagents and reduces risk of contamination due to pouring. For applications where pouring is preferred over pipetting, the design allows for minimal residual liquid retention so as to reduce wastage of valuable cells and reagents.

Cells play an instrumental and increasing role in research, and the discovery and development of new therapeutics. With this increasing need for greater number of cells we need more efficient and effective ways for growing and harvesting attachment dependent cells. A Multilayered flask with the right features can serve this purpose.

Scale-up di colture cellulari di mammifero utilizzando un pallone nuovo multistrato

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale ...

Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a chemically stratified water column and unlike other inland bodies of water, largely prevents external input of carbon and nutrients from streams. Biota are exposed to numerous environmental stresses, including year-round severe nutrient deficiency, low temperatures, extreme shade, hypersalinity, and 24-hour darkness during the winter 1. These extreme environmental conditions limit the biota in Lake Bonney almost exclusively to microorganisms 2.
Single-celled microbial eukaryotes (called "protists") are important players in global biogeochemical cycling 3 and play important ecological roles in the cycling of carbon in the dry valley lakes, occupying both primary and tertiary roles in the aquatic food web. In the dry valley aquatic food web, protists that fix inorganic carbon (autotrophy) are the major producers of organic carbon for organotrophic organisms 4, 2. Phagotrophic or heterotrophic protists capable of ingesting bacteria and smaller protists act as the top predators in the food web 5. Last, an unknown proportion of the protist population is capable of combined mixotrophic metabolism 6, 7. Mixotrophy in protists involves the ability to combine photosynthetic capability with phagotrophic ingestion of prey microorganisms. This form of mixotrophy differs from mixotrophic metabolism in bacterial species, which generally involves uptake dissolved carbon molecules. There are currently very few protist isolates from permanently ice-capped polar lakes, and studies of protist diversity and ecology in this extreme environment have been limited 8, 4, 9, 10, 5. A better understanding of protist metabolic versatility in the simple dry valley lake food web will aid in the development of models for the role of protists in the global carbon cycle.
We employed an enrichment culture approach to isolate potentially phototrophic and mixotrophic protists from Lake Bonney. Sampling depths in the water column were chosen based on the location of primary production maxima and protist phylogenetic diversity 4, 11, as well as variability in major abiotic factors affecting protist trophic modes: shallow sampling depths are limited for major nutrients, while deeper sampling depths are limited by light availability. In addition, lake water samples were supplemented with multiple types of growth media to promote the growth of a variety of phototrophic organisms.
RubisCO catalyzes the rate limiting step in the Calvin Benson Bassham (CBB) cycle, the major pathway by which autotrophic organisms fix inorganic carbon and provide organic carbon for higher trophic levels in aquatic and terrestrial food webs 12. In this study, we applied a radioisotope assay modified for filtered samples 13 to monitor maximum carboxylase activity as a proxy for carbon fixation potential and metabolic versatility in the Lake Bonney enrichment cultures.

Microbial eukaryotes are both a source of photosynthetically-derived carbon and top predatory species in permanently ice-covered Antarctic lakes. This report describes an enrichment culture approach to isolate metabolically versatile microbial eukaryotes from the Antarctic lake, Lake Bonney, and assesses inorganic carbon fixation potential using a radioisotope assay for Ribulose-1,5-bisphophate carboxylase oxygenase (RubisCO) activity.

Istituzione di microbiche colture di arricchimento eucariotiche da un chimicamente Stratificati Antarctic Lake e valutazione del potenziale fissazione del carbonio

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

Il Metodo Culture Slice per seguire lo sviluppo dei germi dente Espianto Cultura

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls and carotenoids. In vivo, these proteins are folded with pigments to form complexes which are inserted in the thylakoid membrane of the chloroplast. The high similarity in the chemical and physical properties of the members of the family, together with the fact that they can easily lose pigments during isolation, makes their purification in a native state challenging. An alternative approach to obtain homogeneous preparations of LHCs was developed by Plumley and Schmidt in 19871, who showed that it was possible to reconstitute these complexes in vitro starting from purified pigments and unfolded apoproteins, resulting in complexes with properties very similar to that of native complexes. This opened the way to the use of bacterial expressed recombinant proteins for in vitro reconstitution. The reconstitution method is powerful for various reasons: (1) pure preparations of individual complexes can be obtained, (2) pigment composition can be controlled to assess their contribution to structure and function, (3) recombinant proteins can be mutated to study the functional role of the individual residues (e.g., pigment binding sites) or protein domain (e.g., protein-protein interaction, folding). This method has been optimized in several laboratories and applied to most of the light-harvesting complexes. The protocol described here details the method of reconstituting light-harvesting complexes in vitro currently used in our laboratory, and examples describing applications of the method are provided.

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

In Vitro Ricostituzione di Complessi Light-raccolta di piante e alghe verdi

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Istituzione di un pH extracellulare acido sistema cultura

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

Istituzione e manutenzione di scarafaggi americani gnotobiotici (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

Coltura tissutale della corteccia ovarica bovina

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the executor for most of the liver functions, primary hepatocytes have limited proliferating capacity. This requires the establishment of ex vivo hepatocyte expansion models for liver physiological and pathological research. Here, we isolated murine hepatocytes by two steps of collagenase perfusion and established a 3D organoid culture as the 'mini-liver' to recapitulate cell-cell interactions and physical functions. The organoids consist of heterogeneous cell populations including progenitors and mature hepatocytes. We introduce the process in detailed to isolate and culture the murine hepatocytes or fetal hepatocyte to form organoids within 2-3 weeks and show how to passage them by mechanically pipetting up and down. In addition, we will also introduce how to digest the organoids into single cells for lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering. The organoids can be used for drug screens, disease modelling, and basic liver research by modeling liver biology and pathobiology.

A long-term ex vitro 3D organoid culture system was established from mouse hepatocytes. These organoids can be passaged and genetically manipulated by lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering.