Profesör Hiraoka Biz bize suşları göndermek için teşekkür ederim. Biz Goran Gustafssons Vakfı ve İsveç Kanser Derneği (2008/939) desteğiyle kabul etmiş sayılırsınız.

1. Fisyon maya kültürü <ol><li> Edinburgh Minimal Medya (EMM) ve ammoniumchloride olmadan EMM (EMM-N) 8 hazırlayın. Otofloresans azaltmak için glukoz solüsyonu otoklava ama 0,2 mikron filtre ve daha sonra otoklava medya eklendi kullanarak sterilize yerine filtre olmamalıdır. </li><li> İnokülasyon fisyon maya hücreleri filtre sterilize glukoz ile EMM sıvı ortam 3 ml taze, 8 YEA, zengin medya ile bir agar plaka üzerinde büyüdü. Bir hücrelerin iyi bir havalandırma sağlamak için kapağı hafifçe itti 13mL tüpleri kullanın. 30 225 rpm sallayarak hücrelerin büyümesine izin ° C Hücreleri (1 X 10 6 - 2 X 10 7 hücre / ml) log fazı büyüyen tutun Burker odasına kullanarak onları sayarak 2 gün boyunca uygun seyreltme, her sabah ve akşam izledi. </li><li> Deney günü erken log fazı, 5 hücre olduğundan emin olun X 10 6 - 1 X 10 7 hücre / ml. </li><li> T açlıktan içinEMM-N medya EMM medya ile 20 dakika arasında geçiş sırasında azot hücreleri. Bu, daha hızlı bir hızda santrifüj olarak maksimum 1.5 RCF masa üstü santrifüj 1.5 ml Eppendorf tüp 3 ml hücre hasat yapılır fisyon maya 9 stres yanıtı neden olabilir . Çift iplik tekniği, anlam kullanın; ilk spin 2 dakika sonra Eppendorf tüp 180 ° döndürün ve 1.5 RCF 2 dk 10 için tekrar döndürün. Bu tüpün alt kısmındaki bir pelet tüm hücreleri toplamak için yardımcı olur. EMM-N ile bir kez yıkayın ve sonra EMM-N pelet çözülür ve 30 hücreleri az 15 dakika süreyle inkübe ° C&#39;de 225 rpm&#39;de sallayarak ve ardından 2 nokta devam. Örnek hazırlama. </li></ol> 2. Örnek hazırlama <ol><li> Harvest 1.5 mL, daha hızlı bir hızda santrifüj olarak maksimum 1.5 RCF masa üstü santrifüj bir 1.5 ml Eppendorf tüp hücrelerin fisyon maya 9 stres yanıtı neden olabilir . Çift iplik tekniği, meani kullanın.ng 2 dakika süreyle ilk dönüşü, ardından Eppendorf tüp 180 ° döndürün ve 2 dk 10 1.5 RCF tekrar döndürebilirsiniz. Bu tüpün alt kısmındaki bir pelet tüm hücreleri toplamak için yardımcı olur. </li><li> Süpernatantı, ama bırakın 10-15 mcL ve geri kalan medya hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Alternatif olarak, hücre pelletini tekrar süspansiyon, taze medya 10 mcL ekleyin. </li><li> Açık cam slaytlar ve cam kapak Yok (1.5) emin olun. Normalde bunları temizlemek için, ama toz dolu olmadığından emin değilsiniz. </li><li> Dondurucu filtresi sterilize edilmiştir 1mg/ml lektin bir stok solüsyonu bir kısım dışarı atın. Lektin çözüm birkaç kez refrozen olabilir. Lektin kapak cam maya hücreleri gidermek için kullanılır. </li><li> Place 5 objektif cam filtre sterilize glukoz ile EMM mcL. </li><li> 5 kapak cam köşesindeki lektin çözüm mcL yerleştirin. Sonradan lektin açılan aynı köşede, yani hücre kültürü 5 mcL. Pipetleme ve daha sonra birkaç kez karıştırın, uzun kenarı pipet kullanarak kapağı camı boyunca kültür-lektin karışımı hücre yayıldı. Her şeyi bırakın veya aşırı sıvı cam kapak ters köşe emmek hücre karışımı yoğunluğuna bağlı. </li><li> Bankta objektif cam ve diğer tarafta tek bir tarafı ile kapak cam, kontör, yerleştirin. Cam kapak, birkaç dakika için biraz kurumasını bekleyin. Kesinlikle tamamen kuru olmalıdır, ama çok fazla sıvı cam olmamalıdır. </li><li> EMM açılan objektif cam yaklaşık 70 ° melek ile cam kapak yerleştirin. EMM açılan yukarıdan aşağıya düşecek böylece kapak cam gidelim. </li><li> Silikon gres ile kenarları mühür için 2 ml şırınga hazırlar. 200 ul ucu geniş ucu ve şırınga ekleyin. Silikon gres yaklaşık 1 ml şırınga doldurun. Silikon ince bir çizgi hafifçe iltihap kapak cam kenarlarına uygulanırhing şırınga piston. Şimdi küçük bir büyüme odasına S. pombe hücreleri. </li></ol> 3. Mikroskopi <ol><li> Cıva / ksenon lamba, mikroskop ve bilgisayar çevirerek floresan mikroskopi başlatın. Floresan mikroskop maya büyüme odasına yerleştirin. 63 X objektif veya NA = 1.3 veya daha yüksek 100 X amacı kullanın. Bir yağ hedefi ise, yağ ekleyin. </li><li> Hücreleri bulmak ve keskin bir görüntü elde etmek için parlak alanını kullanın. </li><li> Floresan mikroskopi için ayarları maya hücreleri mikroskop etiketlemek için kullanılan fluorochromes bağlı olarak değişir. 16-line ortalama düzlem tarama ayarı ile Plan-Apochromat 63x yağ objektif lens (NA = 1.4) ile konfokal mikroskop Zeiss LSM 700 Lazer Tarama Mikroskobu kullanın. Iğne deliği 0.8 mm optik bir dilim verir 1-1,1 Airy birimleri, ayarlanmış olmalıdır. Biz, böylece d Alexa 488 ile 582 nm dalga boyunda ışın ayırıcı filtre kümesi kullanarak Track 1 GFP tespit488 ve 582 nm arasındaki dalga boylarında etecting. İzinde &#39;de 2, böylece 578 ve 600 nm arasındaki dalga boylarında tespit 578 nm dalga boyunda ışın ayırıcı kullanarak mCherry için optimal bir filtre ayarını kullanın. Bu Parça 2 MRFP (SPB) ve NM (mCherry) tespit olacağı anlamına gelir. </li><li> Çok sayıda fotoğraf ve her bir suş için 60 farklı hücrelerde ölçebilmek için gerekli ele alalım. Genellikle 15 resim bağımsız mikroskopi alanları yeterli. Mikroskopi süresi 60 dakikayı aşarsa taze hücreler ile yeni bir büyüme odasına olduğunu tavsiye edilir. </li></ol> 4. Subselüler mesafelerin nicel ölçümü <ol><li> Zeiss Zen Light Edition programı resim açın. Tüm sinyaller aynı odak düzlemli tüm hücrelerde farklı fluorochromes arasında mikron mesafe ölçümleri araç önlem kullanma. Floresan sinyal merkezini belirlemek için ışık yoğunluğu ve kontrastı ayarlayın. Bu basitleştirilmiş bir protokol sadece iki farklı c kullanırmüşahedeler ve dolayısıyla SPB ve NM aynı kanalda. SPB NM büyük yuvarlak bir yapı tarafından saydı. Mesafelerde bir not defteri sayfasına aktarın. En az 60 hücre ölçün. Mesafeyi ölçmek için, ImageJ diğer programlar da kullanılabilir, ancak Zeiss Zen Işık, yüksek resim çözünürlüğü ve bu programı kullanarak ve yakınlaştırmak için kolaylığı nedeniyle tercih edilir. ImageJ açıldı lsm formatında resimler birbirlerinin üstüne iki kanal olacaktır. Her iki kanal ile bir resim yapmak için, ilk iki kanal bölünmüş ve daha sonra bunları birleştirmek. Bundan sonra satırı aracı, yukarıda açıklandığı gibi mesafeleri ölçmek için kullanılabilir. </li><li> SigmaStat-3.5 yazılımını kullanarak, örneğin, bir istatistik programı kullanarak örneğin t-testi veya Mann-Whitney rank sum testi farklı suşları ve tedaviler arasında, ortalama ya da medyan hücre içi mesafeler karşılaştırın . Hücreler için daha kısa bir seçim olacaktır bu yana sık sık veri normal dağılıma sahip değildirtüm sinyaller bu yana floresan sinyalleri arasındaki mesafeler, aynı odak düzlemli ölçülecek olması gerekir. Bir t-testi, Mann-Whitney rank sum testi, normal dağılım eksikliği veri setleri karşılaştırma imkanı sağlarken, veri normal dağılıma sahip olduğunda sadece kullanılabilir. T-testi, Mann-Whitney Rank Sum Test medyan karşılaştırıldığında ise iki farklı veri setlerinin ortalama karşılaştırılır . </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Gerilme PJ1185: (h + his7 +: dis1placR - GFP Chr1 [: ura4 + leu1 hphMX6 Laço] sid4-MRFP: kanMX6 cut11 mCherry: natMX6 ura4-D18-32 ade6-DN / N) EMM yetiştirildi . Bir örnek çekilmiş ve küçük bir büyüme odasında monte ve resimleri (Şekil 1A + N) alınmıştır. Daha sonra büyüme ortamı EMM w / o ammoniumchloride (EMM-N) ile değiştirilir ve hücreleri g edildi.sallayarak ise 15 dakika boyunca rown. Azot hasret hücreler daha sonra EMM-N ve resimler ile bir büyüme odasında monte edilmiştir (Şekil 1A-N) alınmıştır. Lokus (GFP) ve SPB (Şekil 1B ve Tablo 1) arasındaki mesafeyi ölçmek için ölçme aracı kullanılmıştır. Buna ek olarak, odağı (GFP) ve NM arasındaki mesafe ölçüldü (Şekil 1B ve Tablo 2). Azot tükenmesi öncesi ve sonrası medyan Subselüler mesafeler SigmaStat 3.5 yazılımı (Tablo 3) kullanılarak karşılaştırıldı. SBP doğru NM uzak hareketli gen küme lokalizasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir kayma vardı. GFP ve SBP arasındaki mesafe ölçme veri olabilir dolayısıyla bir normal dağılım ve ortalama mesafeleri (1,777 mikron + N ve 1.587 mm-N), t-testi (Tablo 1 ve 3) kullanılarak karşılaştırıldı . Iki ortalama değerleri (p = 0.008, t-testi) arasında anlamlı bir fark yoktu. GFP ve NM arasındaki mesafe ölçüm verileri normal bir di yoktustribution ve bu nedenle medyan mesafeleri (0 mikron + N ve 0.390 mm-N), Mann-Whitney Rank Sum testi (Tablo 2 ve 3) kullanarak karşılaştırıldı. Iki medyan değerleri (p &lt;0.001, Mann-Whitney Rank Sum testi) arasında anlamlı bir fark yoktu. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454fig1.jpg" /> Şekil 1: GFP ile işaretlenmiş Chr1 adlı genlerin bir küme lokalizasyonu, azot açlıktan sonra değişti. (A) Sol sütun, + N, EMM sağ sütunda yetişen bir hücre,-N, EMM-N yetişen bir hücre bir temsilci hücre çekirdeğinde bir temsilci hücre çekirdeği. Yeşil Chr1 küme etiketleme GFP sinyali, kırmızı MRFP ve mCherry sırasıyla, SPB ve NM etiketleme. (B) Aynı hücre çekirdeği olarak (A) ama şimdi ölçülen subnuclear mesafeler; sarı: hücre çekirdeğinin çapı, mavi: SPB ve GFP sinyal ve pembe arasındaki mesafe: GFP sinyal ve nükleer membran arasındaki mesafe. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Tablo 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1a.jpg" /> <img alt="Tablo 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1b.jpg" /> <img alt="Tablo 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1c.jpg" /> (Tablo 1). EMM yetiştirilen PJ1185 suşu mikron subnuclear mesafeleri ölçülür. İlk satır, hücre (d), ikinci satır, GFP ve SPB arasındaki mesafe, üçüncü sıra, GFP ve NM arasındaki mesafe çapı. <img alt="Tablo 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2a.jpg" /> <img alt="Tablo 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2b.jpg" /> <img alt="Tablo 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2c.jpg" /> (Tablo 2). EMM-N yetiştirilen PJ1185 suşu mikron subnuclear mesafeleri ölçülür. İlk satır, hücre (d), ikinci satır, GFP ve SPB arasındaki mesafe, üçüncü sıra, GFP ve NM arasındaki mesafe çapı. <imgalt = &quot;Tablo 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3454/3454table3.jpg&quot; /&gt; Tablo 3 gerginlik PJ1185 gözlenen subnuclear mesafelerin Tanımlayıcı istatistikler azot açlık önce (+ N) ve (N) &#39;den sonra. Birinci sıra: hücre sayısı, ikinci satır ölçülen ortalama çapı (d), üçüncü satır: medyan çapı (d), dördüncü satır: GFP ve NM arasında medyan mesafeleri: GFP ve SPB, beşinci satır arasındaki mesafe demek.

<ol>
	<li>Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-802 (1994).</li><li>Robinett, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator/repressor+recognition.">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. Cell. Biol. 135, 1685-1685 (1996).</li><li>Bahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14, 943-943 (1998).</li><li>Asakawa, H., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+imaging+of+meiotic+chromosome+dynamics+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Live-cell fluorescence imaging of meiotic chromosome dynamics in Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods. Mol. Biol. 558, 53-53 (2009).</li><li>Alfredsson-Timmins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+chromatin+is+an+early+response+to+nitrogen+starvation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Reorganization of chromatin is an early response to nitrogen starvation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 118, 99-99 (2009).</li><li>Kristell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+depletion+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe+causes+nucleosome+loss+in+both+promoters+and+coding+regions+of+activated+genes.">Nitrogen depletion in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe causes nucleosome loss in both promoters and coding regions of activated genes.</a> Genome. Res. 20, 361-361 (2010).</li><li>West, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cut11(+):+A+gene+required+for+cell+cycle-dependent+spindle+pole+body+anchoring+in+the+nuclear+envelope+and+bipolar+spindle+formation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">cut11(+): A gene required for cell cycle-dependent spindle pole body anchoring in the nuclear envelope and bipolar spindle formation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol. Biol. Cell. 9, 2839-2839 (1998).</li><li>Tomlin, G. C., Morrell, J. L., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+protein+Cdc11p+links+Sid4p+to+the+fission+yeast+septation+initiation+network.">The spindle pole body protein Cdc11p links Sid4p to the fission yeast septation initiation network.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 1203-1203 (2002).</li><li>Funabiki, H., Hagan, I., Uzawa, S., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-dependent+specific+positioning+and+clustering+of+centromeres+and+telomeres+in+fission+yeast.">Cell cycle-dependent specific positioning and clustering of centromeres and telomeres in fission yeast.</a> J. Cell. Biol. 121, 961-961 (1993).</li><li>Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+analysis+of+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods. Enzymol. 194, 795-795 (1991).</li><li>Soto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+centrifugation-induced+gravity+forces+through+mitogen-activated+protein+kinase+pathways+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Transduction of centrifugation-induced gravity forces through mitogen-activated protein kinase pathways in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Microbiology. 153, 1519-1519 (2007).</li><li>Hagan, I. M., Ayscough, K. R., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence microscopy in yeast. , (2000).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+and+exploiting+the+fluorescent+protein+paintbox+(Nobel+Lecture).">Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 5612-5612 (2009).</li><li>Mackay, D. R., Ullman, K. S., Rodesch, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Imaging+of+Mitosis+After+siRNA+Transfection.">Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection.</a> J. Vis. Exp. (40), e1878-e1878 (2010).</li></ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Hücresel olayları izlemek için canlı hücre görüntüleme kullanımı son on yılda giderek daha popüler hale gelmiştir. Bu denizanası Aequorea victoria Yeşil Floresan Protein kullanımı ile başladı ve şimdi birçok farklı fluorochromes kadar kırmızı (648 nm) 11 cyan (475 nm) geniş bir spektrumları yoluyla yayan floresan mevcuttur. Immünofloresan üzerinden canlı hücre görüntüleme en önemli avantajlarından biri, hücreleri, dolayısıyla tespit süreci mümkün eserler kaçınarak mikroskopi önce formaldehit veya etanol / aseton tedavisi sabit değildir olduğunu. Buna ek olarak, tek tek hücrelerin izleyin ve hücresel olaylar 12 film elde etmek için mümkün kılan, inkübasyon saat veya gün boyunca sık aralıklarla fotoğraf çekmek için, canlı hücre görüntüleme imkanı sunar . Memeli hücreleri gibi yaklaşık 3-4 çapında küçük maya hücresi ile karşılaştırıldığında yaklaşık 100 mm çapları, daha büyük bir boyuta sahip olmanın avantajına sahipMu; m. Öte yandan, maya ile avantajı kolayca manipüle genom. Homolog rekombinasyon maya çok verimli bir şekilde ortaya çıkar ve farklı fluorochromes 3 ilgi proteinleri kaynaştırmak için kullanılır . Ayrıca, Laço LacR-GFP protein dizileri ve daha sonraki ifade hedeflenen entegrasyon kullanarak belirli bir kısmının, hücre çekirdeği 2 içinde genom algılanmasını sağlar . S. Kullanımı mikroskopi pombe hücreleri düşük maliyetli hücre kültürü koşullarında hızlı bir nesil zaman yetişen doğal tek hücreli organizmalar olduğundan ek avantajları vardır. Ayrıca, S. metazoan homolog genler beri pombe mükemmel ökaryotik bir model organizmadır. Bu tekniğin en önemli sınırlamaları Bir gerçek sinyal algılama rahatsız maya hücre otofloresans. Bu sorun, filtre sterilize glikoz minimal büyüme ortamını kullanarak yerine otoklava üstesinden gelinebilir. IçindeAyrıca maya hücreleri, bunları montaj log fazı 2 gün önce yetiştirilen edilmelidir. Burada sunulan protokol maya hücre içindeki proteinlerin hücre içi lokalizasyonu belirlemek için nispeten basit, ama henüz nicel bir yöntem sunmaktadır. Ayrıca, farklı zaman noktalarında fotoğraf çekmek hücresel olayları takip edebilirsiniz.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorum </td></tr><tr><td> Lektin </td><td> Sigma </td><td> L1395 </td><td></td></tr><tr><td> Silikon gres </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lazer tarama mikroskobu EKK 700 </td><td> Zeiss </td><td> EKK 700 </td><td> Diğer konfokal mikroskop kullanılır. </td></tr><tr><td> SigmaStat 3,5 </td><td> Statcon </td><td> SigmaStat 3,5 </td><td> İstatistiksel analiz için herhangi bir yazılım olabilir. </td></tr></tbody></table>

quantitative live cell fluorescence-microscopy analysis of fission yeast

Birkaç mikroskopi teknikleri, hücre içinde belirli bir proteinin tespit edebilir bugün mevcuttur. Son on yılda ilgi protein doğrudan bağlı Yeşil Floresan Protein (GFP) gibi fluorochromes kullanarak canlı hücre görüntüleme 1 giderek daha popüler hale gelmiştir. GFP ve benzer fluorochromes kullanma proteinlerin hücre içi lezyonlar ve hareketleri bir floresan mikroskop tespit edilebilir. Ayrıca, bu tekniği kullanarak bir kromozomun belli bir bölgesine subnuclear lokalizasyon okudu olabilir. GFP Lac repressör protein (LacR) erimiş ve ektopik Laço dizisi tandem tekrarlar kromozom 2 faiz bölgeye eklenmiştir hücrede ifade edilir. LacR-GFP Laço tekrarlar ve genom o bölgede, floresan mikroskop yeşil bir nokta olarak görülebilir yapışacaktır . Maya özellikle homolog yılından bu yana bu tür manipülasyon için uygundurrekombinasyon çok etkili olduğu ve böylece Laço tekrarlar ve GFP 3 ile mühendislik füzyon proteinleri hedeflenen entegrasyon sağlar. Burada fizyon maya canlı hücre analizi için kantitatif bir yöntem açıklanmaktadır. Fisyon maya canlı hücre analizi için ek protokoller bulunabilir, mayotik kromozom davranışları 4 bir film yapmak nasıl örneğin. Bu deneyde biz subnuclear organizasyon ve gen indüksiyonu sırasında nasıl etkilenir. Biz genleri çevresinde Laço bağlayıcı sitelerinin giriş Chr1 adlı bir gen kümesinin, etiketli. Gen küme fisyon maya 5 azot açlık sırasında erken uyarılan gen zenginleştirilmiştir. Gerilim nükleer membran (NM), kırmızı floresan sinyal sebebiyet veren NM proteini Cut11 mCherry eki etiketli. Mil Pole gövde (SPB) bileşik Sid4 Kırmızı Floresan Protein (Sid4-MRFP) 6 eritilir. </s&gt;. Vejetatif büyüyen maya hücreleri sentromerlere her zaman NM 7 gömülü olan SPB bağlıdırlar . SPB NM büyük bir yuvarlak yapı olarak tanımlanır. Azot kaynağı tükenmesi önce görüntüleme ve 20 dakika sonra gen kümesi (GFP) ve NM / SPB arasındaki mesafe belirleyebilirsiniz. Azot tükenmesi öncesi ve sonrası ortalama veya medyan mesafeler karşılaştırılır ve böylece azot tükenmesi sonra gen küme hücre içi lokalizasyonu bir kayma var olup olmadığını ölçmek.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast at JoVE.com

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Fisyon maya,<em&gt; Schizosaccharomyces pombe</em&gt; Temel hücresel süreçleri incelemek için iyi bir model sistemdir. Burada fizyon maya kantitatif canlı hücre analizi gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu deneyde hücre çekirdeğinin içinde genom organizasyonu odaklanır, fakat yöntem sitozolik faktörleri incelemek için de kullanılabilir.

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

quantitative-live-cell-fluorescence-microscopy-analysis-fission

Research

JoVE Journal

Biology

20.1K Görüntüleme.  University of Uppsala. Fisyon maya, Schizosaccharomyces pombe Temel hücresel süreçleri incelemek için iyi bir model sistemdir. Burada fizyon maya kantitatif canlı hücre analizi gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu deneyde hücre çekirdeğinin içinde genom organizasyonu odaklanır, fakat yöntem sitozolik faktörleri incelemek için de kullanılabilir.

Video: Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Biyoloji

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Hücre Elektrofüzyon Floresan Mikroskop ile görüntülendi

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

Kantitatif Spor Analizi İş Akışı

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Bölünme Maya Cinsel Yaşam Döngüsü Mikroskopi

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

Fisyon Maya Cytokinetic Olayların zamanmekansal Analizi

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of proteins which are essential for bacterial survival. A series of target-specific dyes can be used as probes to better understand these processes. Staining with lipophilic dyes enables the observation of membrane structure, visualization of lipid microdomains, and detection of membrane blebs. Use of fluorescent-d-amino acids (FDAAs) to probe the sites of peptidoglycan biosynthesis can indicate potential defects in cell wall biogenesis or cell growth patterning. Finally, nucleic acid stains can indicate possible defects in DNA replication or chromosome segregation. Cyanine DNA stains label living cells and are suitable for time-lapse microscopy enabling real-time observations of nucleoid morphology during cell growth. Protocols for cell labeling can be applied to protein depletion mutants to identify defects in membrane structure, cell wall biogenesis, or chromosome segregation. Furthermore, time-lapse microscopy can be used to monitor morphological changes as an essential protein is removed and can provide additional insights into protein function. For example, the depletion of essential cell division proteins results in filamentation or branching, whereas the depletion of cell growth proteins may cause cells to become shorter or rounder. Here, protocols for cell growth, target-specific labeling, and time-lapse microscopy are provided for the bacterial plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Together, target-specific dyes and time-lapse microscopy enable characterization of essential processes in A. tumefaciens. Finally, the protocols provided can be readily modified to probe essential processes in other bacteria.

Understanding the function of essential processes in bacteria is challenging. Fluorescence microscopy with target-specific dyes can provide key insights into microbial cell growth and cell cycle progression. Here, Agrobacterium tumefaciens is used as a model bacterium to highlight methods for live cell imaging for characterization of essential processes.

Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...