Anne Dodson teşekkür ediyoruz ve Stephanie Heinrich smFISH Protokolü en iyi duruma getirme konusunda tavsiye için Xavier Darzacq için analiz platformunda, Haiyan Huang öneriler istatistiksel analizi için yardım edin. Bu eser Mart Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable güvenir (00027344), Damon Runyon'un Kanser Araştırma Vakfı (35-15) ve Glenn Vakfı'na EÜ ve bir NSF yüksek lisans araştırma bursu Grant No fon tarafından desteklenmiştir DGE-1106400 Dizayn Merkezi için.

Not: Tüm tamponları ve bu protokol için kullanılan ortamı Tablo 1' de listelenmiştir. Satıcı bilgileri reaktifleri için Malzemeler tablolistelenir.
Gün 1/1-2 gün:
Not: bitkisel kültür için 0.4-0.6 tercih edilen bir ortamda, bir OD600 hücrelerin büyümesine. Segregasyonun kültür için hücreleri (genellikle bir OD600 itibaren 1.85 içinde kültür) tercih edilen bir yöntemle mayoz geçmesi için ikna etmek.
1. örnek fiksasyon ve sindirim
<ol><li>~3.5 OD%600 3 formaldehit hücrelerinin toplam düzeltmek.<ol>
<li>Bitkisel kültür için 480 µL % 37 formaldehit 15 mL konik tüpler kültürünün 5.52 mL ekleyin.</li>
		<li>Segregasyonun kültür için 160 µL % 37 formaldehit 2 mL microcentrifuge tüpler 1840 µL kültürünün ekleyin. ~ 5 kat için ters çevir'i karıştırın. Uyarı: Toksik formaldehit. İdare ve kurumsal düzenlemelere göre atmayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüpler bir silindir davul oda sıcaklığında 20 dakika yerleştirin. Segregasyonun örnekleri,-20 dk, oda sıcaklığında sabitleme sonra gecede 4 ˚C sabitleme devam etmek için döner. Not: Gece fiksasyon tekrarlanabilirlik ve segregasyonun örnekleri için elde edilen smFISH verilerin kalitesini artırır. Fiksasyon zaman optimize edilmelidir.</li>
	<li>Örnekler tespit ederken, 200 mM Vanadyl Ribonucleoside kompleksleri (VRC), en az 10 dk 65 ˚C çözülme.</li>
	<li>Sindirim ana karışımda 15 mL Tüp hazırlayın: 1 örnek için arabellek b 425 µL 200 mM (65 ˚C ısındı); VRC 40 µL ile karıştırın. 5 örnekleri için 2125 µL arabellek b 200 µL 200 mm (65 ˚C ısındı) VRC ile karıştırın. Açık kahverengi yeşil VRC eklenmesinden sonra görünür ana karışıma eklemeden önce VRC tam olarak resuspend için girdap ~ 5 s. Not: VRC eklenmesi sırasında sindirim smFISH sonuçları, tutarlılığını potansiyel olarak ham özü saf zymolyase karışımı tarafından tanıtıldı nükleaz kirletici engelleyerek iyileştirir. Bu adımda gerekli VRC miktarı optimize edilmelidir.</li>
	<li>Bitkisel örnekleri için ~ 1057 x g 3 dk de tüpler santrifüj kapasitesi. Segregasyonun örnekleri (sonra gece fiksasyon) için 1,5 dk. Decant 21.000 x g, santrifüj kapasitesi veya süpernatant formaldehit atık için Aspire edin. Not: Oda sıcaklığında tüm Santrifüjü adımlar gerçekleştirilir.</li>
	<li>1.5 mL soğuk arabellek b hücreleri yukarı ve aşağı pipetting veya tüplerin ters çevirme ve karıştırmak için flicking resuspend. Bitkisel örnekleri 2 mL tüpler için resuspension sonra aktarın.</li>
	<li>1.5 dakika süreyle santrifüj 21.000 x g de kaldırmak sıvı dökme vakum aspirasyon veya pipetting, ~ 100 µL bırakarak.</li>
	<li>1.5 mL soğuk arabellek b hücreleri resuspend</li>
	<li>1.5 dakika süreyle santrifüj 21.000 x g de kaldırmak sıvı dökme vakum aspirasyon veya pipetting, ~ 100 µL bırakarak.</li>
	<li>Hücreleri 21.000 x g de 1,5 dk. aspiratı soğuk arabellek B. santrifüj 1,5 ml sıvı vakum tamamen veya pipetting resuspend.</li>
	<li>Sindirim ana mix ve kısaca resuspend girdap 425 µL hücrelerde resuspend. 100T 10 mg/mL zymolyase 5 µL her tüp için ekleyin. Not: Girdap önce tüpler için ekleme her zaman zymolyase. Zymolyase ana karışıma eklemek yerine her tüp için ayrı ayrı ekleyin. Her iki adım zymolyase hızlı bir şekilde precipitates çünkü tüpleri arasında sindirim tutarlılığı korumaya yardımcı olmak.</li>
	<li>Girdap 2-3 s karıştırmak için. Tüpler silindir davulunun üstündeki yerleştirin ve 15-30 dk 30 ˚C, sindirmek. Bitkisel hücreleri ve erken segregasyonun aşamaları, genellikle ~ 15 dk sürer ve segregasyonun profaz ve segregasyonun bölümler için genellikle ~ 30 dakika sürer. Not: mikroskobunun her 5 dk 15 dk sonra denetleyin ve saydam olmayan ve Refraktif ~ %80 hücre görünür sindirim durdurur. Şu andan itibaren çok kırılgan hücrelerdir. Hücreleri nazikçe işlemek ve vakum aspirasyon ya da vortexing kullanmayın.
</li>
	<li>Tüpler ~ 376 x g 3 dk. Kaldır, sıvı tamamen pipetting tarafından santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Yavaşça yukarı ve aşağı 1 - 2 kez için pipetting tarafından arabellek b 1 mL içeren hücreleri resuspend karıştırın.</li>
	<li>~ 376 x g 3 dk. Kaldır Tampon B sıvı, tüpler santrifüj kapasitesi pipetting tarafından. Yavaşça 1 mL % 70 etanol (RNase free su ile seyreltilmiş) hücrelerde resuspend.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 3,5-4 saat için kuluçkaya.</li>
</ol>2. hibridizasyon
<ol><li>Formamide oda sıcaklığına getirmek (50 mL aliquot için ~ 30 dk su banyosunda alır). Not: formamide şişe şişe formamide oksidasyonunu önlemek için oda sıcaklığına ulaşıncaya kadar açmayın. Dikkat: Formamide zehirlidir. İdare ve kurumsal düzenlemelere göre atmayın.</li>
	<li>% 10 formamide yıkama arabellekte bir 15 mL konik Tüp hazırlayın.</li>
	<li>~ 376 x g 3 dk. kaldırmak 500 µL % 70 etanol için de tüpler santrifüj kapasitesi pipetting tarafından. Yavaşça yukarı ve aşağı kalan hücreleri resuspend ve sonra hücreleri düşük yapışma tüpler için aktarmak için damlalıklı. Not: yüksek yapışma borular kullanarak büyük ölçüde hücre kaybı sırasında sonraki yıkar azaltır.</li>
	<li>Tüpler ~ 376 x g 3 dk. çıkarmak için de tekrar pipetting tarafından tüm etanol santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>1 mL % 10 formamide yıkama arabellek ve yavaşça damlalıklı aşağı yukarı 2 - 3 kez eklemek hücreleri resuspend.</li>
	<li>Hücreleri hibridizasyon çözüm hazırlarken ~ 20 min için oda sıcaklığında oturmak izin. 1 örnek için 50 µL hibridizasyon arabelleği (Oda sıcaklığı), 200 mm (65 ˚C ısındı) VRC 5 µL ve her sonda (200 nM final) 1 µL karıştırın. 5 örnekleri için 250 µL hibridizasyon arabelleği (Oda sıcaklığı), 200 mm (65 ˚C ısındı) VRC 25 µL ve her sonda (200 nM final) 5 µL karıştırın.<ol>
<li>Hibridizasyon (-20 ˚C dondurulmuş) arabellek formamide oksidasyonu önlemek için tüp açmadan önce oda sıcaklığına çözülme.</li>
		<li>200 mM VRC, sondalar, eklemeden önce 5-10 s için girdap ekledikten sonra hangi tasarlanmış ve ticari satın ve üreticinin yönergelerine göre yeniden düzenlendi.</li>
		<li>İki problar Co inkübe varsa, 1:10 1 µL ekleyin seyreltme prob #1 stok, hem de 1:10 1 µL seyreltme, son seyreltme yapmak için prob #2 stokunun ~ 1:500 her iki soruşturma için. Olmak en iyi sinyal-gürültü oranı ihtiyaçları için gerekli konsantrasyonu (Ayrıntılar için bkz: tartışma) en iyi duruma getirilmiş.</li>
	</ol>
</li>
	<li>~ 376 x g 3 dk. Kaldır de örnekleri süpernatant tehlikeli atık pipetting tarafından santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Hibridizasyon çözümünün en az 50 µL her tüp için ekleyin. Karıştırmak için tüpler fiske.</li>
	<li>Bir rulo davul üzerinde 30 ˚C, en az 16 saat karanlıkta kuluçkaya.</li>
</ol>Gün 2/gün 3
3. yıkama ve görüntüleme
<ol><li>Formamide oda sıcaklığına getirmek.</li>
	<li>% 10 formamide yıkama arabellek (FWB) 15 mL konik Tüp hazırlayın.</li>
	<li>Tüpler rulo davul kaldır ve ışıktan korumak için bir folyo kaplı kutusuna koyun.</li>
	<li>~ 376 x g 3 dk. Kaldır de örnekleri süpernatant tehlikeli atık pipetting tarafından santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Yavaşça yukarı ve aşağı pipetting 1 mL % 10 FWB resuspend 2 - 3 kez.</li>
	<li>30 dk folyo kaplı kutusunda (değil döner) için 30 ˚C, kuluçkaya.</li>
	<li>3 dk. için çıkarmak süpernatant tehlikeli atık için pipetting tarafından ~ 376 x g de örnekler santrifüj kapasitesi ve ~ 50 µL bırakın.</li>
	<li>Bu arada, DAPI/FWB 15 mL konik tüp içinde hazırlamak: 1 örnek için 1000 µL % 10 formamide yıkama arabelleği 5 mg/mL DAPI 1 µL ile karıştırın. 10 örnekleri için 10 mL % 10 formamide yıkama arabellek 5 mg/mL DAPI 10 µL ile karıştırın. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetting 1 mL DAPI/FWB resuspend 2 - 3 kez.</li>
	<li>30 dk folyo kaplı kutusunda (değil döner) için 30 ˚C, kuluçkaya.</li>
	<li>Anti-çamaşır suyu reaktifler buz çözme.</li>
	<li>~ 376 x g 3 dk. Kaldır de örnekleri süpernatant tamamen pipetting tarafından santrifüj kapasitesi. Gerekirse, tüm süpernatant kaldırmak için tekrar santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Hemen görüntüsü değil örnekleri, Pelet GLOX arabellek olmadan enzimler 50 µL içinde resuspend. Damlalıklı aşağı yukarı 3 - 4 kez karıştırmak için.<ol>
<li>Unimaged örnekleri folyo kaplı kutuda 4 ˚C görüntüye kadar hazır tutun. Görüntü hazır olduğunuzda ~ 376 x g 2 min için de örnekler santrifüj kapasitesi ve süpernatant tamamen kaldırmak pipetting göre. Aşağıdaki gibi enzimler ile GLOX içinde resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemen yansıma örnekleri için 15-20 µL GLOX arabelleği enzimler ile ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı karıştırmak için damlalıklı. Not: eklendi birim hücre Pelet boyutuna bağlı olarak değişebilir. Biz 15 µL GLOX arabelleği enzimler ile Pelet resuspending tavsiye ve mikroskop hücre yoğunluğu kontrol edin. Hücreleri (çok yoğun hücreleri birbiri topaklanma) varsa, enzimler ile ilave GLOX tampon ekleyin. Hücreleri çok seyrek ise örnek santrifüj kapasitesi ve ~ 5 µL arabelleği kaldırın.</li>
	<li>Damlalıklı 5 µL üzerine bir coverslip (18 mm x 18 mm, No. 1) ve koymak bir slayt üzerinde coverslip.</li>
	<li>Coverslip yerleştirildiği bir laboratuvar silin slayt üzerine koy. Yavaşça laboratuvar silme slayt (sıvı tüm dört coverslip kenarlarından çıkıyor görmelisiniz) ayarlamak için tuşuna basın.</li>
	<li>Slayt alüminyum folyo ile kaplı bir kutu içinde mikroskop Oda aktarın.</li>
	<li>Yüksek büyütme (60-100 X) ve yüksek sayısal diyafram ile geniş alanlı floresan mikroskop kullanarak görüntü. Not: önemli ölçüde tahsil edilecek ışık miktarını sınırlamak gibi smFISH sondalar tarafından yayılan fotonlar maksimum sayıda toplamak için confocal mikroskoplar, tavsiye edilmez. Burada, veri toplanmıştır üzerinde bir 100 X, 1.4 NA amacı ile donatılmış bir mikroskop kullanarak filtre CY5 (EX632/22, EM679/34) görüntüsü 1.3 s, %100 T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, %100 T; ve DAPI (EX390/18, EM435/48), 0.05-0.1 s, %32 - %50 T. Bir parlak alan başvuru yansıması da elde edilebilir. Adım boyu ile 15-25 dilim 0,1-0,2 elde µm, üzerinden tamamen aşağıda görüş alanı tamamen yukarıda, odak tüm sağlamak için RNA noktalar sayılı mı.</li>
</ol>4. görüntü analizi
<ol><li>Balık-quant17 ve StarSearch2gibi yayımlanmış smFISH analiz araçları ile veya deneme tam ihtiyaçlarına bağlı olarak özel programları ile smFISH veri analiz. Not: Bir iyi analiz boru hattı doğru RNA noktalar ayrı arka plan ve X, Y ve Z (isteğe bağlı) koordinatları ve her yerinde, her hücrede noktaların sayısını yoğunluğu gibi istatistikleri çıkış için bir eşik belirlemek kullanıcılara izin vermelidir ve muhtemelen yanlış algılamaların filtre uygulamak için bir yol olarak parametreleri uygun.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Rahman, S., Zenklusen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH)+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).</li><li>Gaspar, I., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strength+in+numbers:+quantitative+single-molecule+RNA+detection+assays.">Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).</li><li>Vargas, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+transcriptionally+coupled+and+uncoupled+splicing.">Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing.</a> Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).</li><li>Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+variability+of+alternative+RNA+splicing.">Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing.</a> Mol Syst Biol. 7, 506 (2011).</li><li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast.">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li><li>Senecal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+modulate+c-Fos+transcriptional+bursts.">Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li><li>Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+SNVs+to+quantify+allele-specific+expression+in+single+cells.">Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells.</a> Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).</li><li>Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+detection+of+single+mRNA+molecules+in+situ.">Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ.</a> Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).</li><li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant.">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li><li>Long, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+type+switching+in+yeast+controlled+by+asymmetric+localization+of+ASH1+mRNA.">Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA.</a> Science. 277 (5324), 383-387 (1997).</li><li>Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbiased+analysis+method+to+quantify+mRNA+localization+reveals+its+correlation+with+cell+motility.">An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility.</a> Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).</li><li>Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORSEN,+a+new+software+dedicated+to+microscope-based+3D+distance+measurements:+mRNA-mitochondria+distance,+from+single-cell+to+population+analyses.">CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses.</a> RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+inactivation+by+expression+of+a+repressive+mRNA.">Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA.</a> eLife. 6, e27417 (2017).</li><li>Mueller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH-quant:+automatic+counting+of+transcripts+in+3D+FISH+images.">FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images.</a> Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).</li><li>Brar, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+view+of+the+yeast+meiotic+program+revealed+by+ribosome+profiling.">High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling.</a> Science. 335 (6068), 552-557 (2012).</li><li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin.">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li><li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2.">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li><li>Dodson, A. E., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+capture+of+heterochromatin+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae.</a> eLife. 4, e05007 (2015).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).</li><li>Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+mRNA+molecules+in+yeast.">Imaging single mRNA molecules in yeast.</a> Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Burada sunulan Protokolü diğer yayımlanmış smFISH iletişim kuralları2,3,21,22,23türetilmiştir ve özellikle Maya zorlanma arka SK1 için optimize edilmiştir. En iyi duruma getirilmiş parametreler cep telefonu numarasını, fiksasyon süresi, Santrifüjü hız ve süresi, sindirim süresi, sindirim arabellek, sonda konsantrasyon ve hibridizasyon arabellek dahil. Hibridizasyon sıcaklığı ve süresi gibi diğer parametreler optimize edilmemiş. Bu bölümde, bu protokol için herhangi bir Maya zorlanma arka plan ve faiz büyüme koşullarına uyum yardımcı olacak bir kaç not paylaşıyoruz.
Mayası hücre duvarına hücre duvarı sonda penetrasyon engelleyeceğinden mayası yüksek kaliteli smFISH görüntüleri alma karşı büyük bir sorun olduğunu. Hücre duvarı zymolyase tarafından eksik hazım sonda ve sinyal yüksek hücre hücre değişkenlik verimsiz hibridizasyon yol açar. Ancak, aşırı sindirim hücreleri çok kırılgan yapmak, önemli yol kaybı çamaşır adımları sırasında hücre ve görüntüleme için slayt hazırlık sırasında patlama hücre. Böylece, sindirim süresi optimize etmek çok önemlidir. Aynı örnek zaman farklı miktarda sindirerek tarafından pilot smFISH deney tavsiye ediyoruz. ~ %80 hücre refraktif sigara olunca sindirim durdu eğer bizim durumumuzda biz en iyi smFISH veri aldı. Genellikle, aynı büyüme koşulu için farklı genetik mutant suşları ile benzer zamanlama sindirmek. Ancak, sindirim süresi farklı büyüme koşulları ve mayoz mayası içinde farklı aşamalarında arasında karşılaştırıldığında farklıdır. Zamanlama belirlendikten sonra smFISH tekrarlanabilir kalitesidir. Not Ayrıca hafif kusurlu hücre duvarı sentezi ve/veya kompozisyon mutant suşları için sindirimi daha az 15 dk. zymolyase farklı gruplar halinde kullanımı tamamlanabilir sindirim zamanlama değişebilir.
En iyi sonda konsantrasyonu yüksek sinyal gürültü oranı elde etmek için gereklidir. Tasarlanmış ve bizim smFISH sondalar ticari olarak satın aldı. İyi problar (genellikle 20-mers) % %35 45, 2 baz çifti sonda ve düşük olan arasında en az bir boşluk arasında değişen GC yüzdesi olmalıdır. Biz bir web tabanlı sonda tasarımcı üretici probları listesi oluşturmak için kullanılan ve seçim için yeterli probları olsaydı, patlama algoritması Saccharomyces genom veritabanında sondalar fazla 17 baz çifti ile örtüşen ortadan kaldırmak için kullanacağımızı genomik diğer bölgeleriyle. Bu kümedeki tüm yukarıdaki ölçüt (20 probları) memnun probları sayısı daha düşük olduğu için NDC80luti (CF 590) benzersiz bölgesine anneals sonda küme için daha fazla photostable floresan boyalar (CAL Fluor 590) seçtik (~ 25 probları) üretici tarafından önerilen en az sayıda. Üreticinin yönergelerini izleyerek sonda çözüm başlamaktan sonra yaptığımız bir 1:10 seyreltme hisse senedi çözüm oluşturur ve seyreltik çözüm-20 ˚C adlı 5-µL aliquots. Her aliquot yalnızca bir kez kullanıldı. Optimizasyonu için bir seri yapmak gerekir dilutions 1:10 seyreltilmiş çözüm ve test hangi toplama en iyi sinyal-gürültü oranı verir. 1:250, 1:500, 1: 1000 ve 1:2000 özgün stoktan seyreltme dizi yapım tavsiye ediyoruz. Bizim durumumuzda, CF 590 ve Q 670 sonda kümeleri için en iyi sinyal-gürültü oranı 1:500 seyreltme faktörü sonuçlandı.
En iyi fiksasyon zaman da başarılı smFISH mayası için önemlidir. Biz o gece fiksasyon 4 ˚C bulundu yerine, oda sıcaklığında 20 dakika, sabitleme önemli ölçüde tutarlılık ve kalite segregasyonun örnekleri için smFISH sonuçlarının geliştirilmiş. Her ne kadar biz nasıl gecede fiksasyon bitkisel örnekleri etkisi olabilir test etmedim, fiksasyon, oda sıcaklığında bu büyüme durumu iyi çalıştı. Böylece, smFISH Protokolü yeni suşları veya büyüme koşulları için en iyi duruma getirmek için kısa fiksasyon saat oda sıcaklığında ile başlayan ve yüksek sinyal değişkenliği oluşursa fiksasyon zaman artan öneririz.
Diğer yayımlanmış protokolleri3,22,23ile karşılaştırıldığında, sindirim ve VRC daha yüksek bir konsantrasyon hibridizasyon sırasında sırasında RNase inhibitörü VRC bizim protokolünü kullanır. VRC ek olarak aşağıdaki iki adımı gelişmiş tutarlılık smFISH sonuçlarının muhtemelen daha iyi RNA molekülleri (enzim ham özleri saf ve RNase içerebilir zymolyase karıştırmak yanında tanıttı nükleaz etkinliğe karşı koruma kirletici maddeleri). Böylece, bizim iletişim kuralı veya VRC daha yüksek konsantrasyonlarda optimizasyonu için listelendiği gibi VRC miktarı kullanmanızı öneririz.
Hücreleri önemli bir kısmını arabellek B ve formamide yıkama arabellek çamaşır adımları sırasında kaybolabilir. Hücre kaybı azaltmak için Santrifüjü hızını artırmak. Bizim durumumuzda, örneklerimizi sırasında arabellek B cips için yüksek hızlı (21.000 x g) kullanarak önemli ölçüde azaltılmış hücre kaybı yıkar. Ancak, dolayısıyla Santrifüjü hızını değiştirme değil önerilir hücreleri zymolyase sindirim sonra çok kırılgan hale gelir. Bunun yerine, büyük ölçüde yıkama formamide yıkama arabellekte sırasında hücreleri cips yardımcı düşük yapışma tüpler bilimsel ABD üzerinden kullanmanızı öneririz. Genel olarak, bizim iletişim kuralı sürekli hücre verimli görüntüleme için yoğun bir monolayer oluşturabilirsiniz. Genellikle, 7 alanları bakış verim > 130 hücreleri miktar için uygun.
Son olarak, en uygun parametreler için ve görüntü analizi gerekli çıkışları belirlemek önemlidir. SmFISH noktalar algılamak için yayımlanan analiz programları yaygın olarak ham görüntüleri arka plan sinyal kaldırmak için Gauss çekirdek kullanarak filtre ve kullanıcılardan görüntüleri2,17her kümesi için kullanılacak sinyal-gürültü oranı belirlemek ister. Ne yazık ki, şu anda tek bir standart hangi tarafından uygun parametreleri belirlenir değildir ve bu yüzden bazı ampirik bu farklı ayarları test gereklidir. Bu adımların her biri için gerekli parametreleri ayarlamak için bir tekrarlayarak farklı parametre kümesi giriş ve ne kadar iyi her kümesinden elde edilen sonuçları maçlar bu el ile birkaç temsilcisi hücrelerde sayım odasından kontrol gerekiyor. Bir parametre kümesi bulunduktan sonra farklı büyüme koşulları ve genetik arka planlar rağmen elde edilen görüntülerin çoğu için kullanılabilir.
Ayrıca, maksimum yoğunluk projeksiyon smFISH görüntülerin miktar22önce gerçekleştirilen bir test edebilirsiniz. Bu adım nokta algılama algoritması basitleştirir ve önemli ölçüde bazı potansiyel olarak yararlı bilgiler rağmen onların hücre altı yerelleştirme gibi bireysel noktaları hakkında pahasına görüntüleme süresini azaltır. Bizim durumumuzda, mRNA molekülleri NDC80 Gen tarafından üretilen sayısı yeterince düşük noktalar de bu işlendikten sonra (tutanaklar tomurcuklanma içinde3,7Maya için nadir değildir) ayrı kaldık. Colocalization Analizi kritik nerede durumlarda analiz boru hattı colocalization değerlendirmek için her kanaldaki her smFISH spot konumunu belirlemek gerekir. Bağlı olarak özel sorular sordu, her nokta yoğunluğu gibi diğer bilgileri de boru hattı daha ayrıntılı bir çözümleme için elde edilebilir gerekebilir. Anahtar en iyi duruma getirme iletişim kuralında adımlar ve görüntü analiz boru hattı yüksek faiz soru çalışmaya smFISH verilerin kalitesini elde etmek çok önemlidir.

Dinamik, düzenleme, Gen ifadesinin bir organizma gibi çevresel stres, enfeksiyon ve değişiklikler onun yanıt gelişimi metabolizmasında kullanıyor. Transkripsiyon regülasyonu odak çalışmaları RNA bereket ölçen teknolojilerine güveniyor. Böyle bir yöntem tek molekül floresans in situ hibridizasyon (smFISH) olarak adlandırdığı bireysel RNA molekülleri tek hücreler1,2tespiti için kullanılır. Bu yöntem, hücre hücre değişkenlik gen ekspresyonu ölçümü ve hücre içi RNA yerelleştirme belirlenmesi sağlar.
En sık kullanılan smFISH teknikte bireysel bir RNA molekülü tespiti hedef RNA tamamlayıcı ve aynı floresan boyalar için Birleşik birden çok kısa DNA prob (genellikle ~ 48 20-mer probları) gerektirir. Tek bir floresan sonda bağlama sinyali zayıf sonuçlar, ancak tüm probları topluluğu sinyalini sağlamdır. Tek bir sonda hedef kapalı bağlama sergi olsa bile, böyle sinyal çok zayıf olarak hedef RNA molekülü3kıyasla beklendiği için bu özellik sinyal-gürültü oranı büyük ölçüde artırır. İçinde hata algılama RNA molekülleri sayısı sayılır ve çeşitli büyüme koşullarında ve farklı mutantlar arasında göre.
İlk gelişimi beri smFISH gen ifade4,5,6,7 patlama transkripsiyon Uçbirleştirme transkripsiyon uzama1,gibi2, çeşitli yönlerini incelemek için uyarlanmıştır , 8 , 9, hücre içi allelic ifade10,11,12ve RNA yerelleştirme13,14,15. Son zamanlarda, hangi aynı genin iki transkript izoformlarının ifade eğitim için bu yöntemi kullandık kısa transkript izoformu (NDC80ORF) vardır onun tüm sıra uzun izoformu (NDC80luti ile paylaştı )16. İki mRNA izoformlarının benzersiz olarak tanımlamak için biz iki yoklama kümesi kullanılır: bir set NDC80lutibenzersiz sırasını belirli ve diğer küme başka bir floresan boya, Birleşik, iki izoformlarının ortak bölgesine bağlar. NDC80luti RNA colocalized bir yer her iki floresan sinyali ile ise tanımlanan NDC80ORF RNA biri sadece sinyal ortak soruşturma kümesinden içerir. Sayısı beri NDC80ORF transkript sonda hibridizasyon, yüksek verim ve yüksek sinyal gürültü oranı güvenle smFISH noktalar tanımlamak ve hata azaltmak gerekli "çıkarma" yöntemine göre hesaplanır yayma.
Bu kağıt tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaesmFISH gerçekleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı, cep numarası, fiksasyon süresi, sindirim süresi, sindirim arabellek, sonda konsantrasyon ve hibridizasyon içinde smFISH deneyler için kullanılan arabellek en iyi duruma getirilmiş S. cerevisiae geçiren SK1 zorlanma arka için bitkisel büyüme veya mayoz. Ancak, aynı zamanda bu el yazması Not: resim alma ve (2) ek optimizasyon farklı zorlanma arka planlar ve büyüme koşulları için gerektirebilir Protokolü adımları sonra smFISH verilerin kalitesini kontrol etmek için (1 yöntemi.

<table><tbody><tr><td>BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td><td>Ambion</td><td>AM2616</td><td>Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C3515</td><td>Store at 4 &amp;deg;C for short-term. Vortex before use.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td>Store at -20 &amp;deg;C after reconstitution in water. Protect from light.</td></tr><tr><td>50% Dextran Sulfate</td><td>Milli Pore</td><td>S4030</td><td>Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA</td><td>Sigma</td><td>R4251</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution in water.</td></tr><tr><td>Ethanol (100%, 200 proof)</td><td>various</td><td></td><td>Flammable.</td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Fisher</td><td>F79-500</td><td>Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>various</td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C after dissolving in nuclease-free water.</td></tr><tr><td>Glucose oxidase</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Potassium phosphate (monobasic and dibasic)</td><td>various</td><td></td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Probe library, diluted in TE, pH 8.0&amp;nbsp;</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots (5 &amp;micro;L) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>various</td><td></td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Ambion</td><td>AM9763</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>TE, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma</td><td>238813</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots.</td></tr><tr><td>200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>MP Biomedicals</td><td>08320932</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution in water.</td></tr><tr><td>Low-adhesion tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2600</td><td>Store at room temperature.</td></tr></tbody></table>

single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis

Tek molekül floresans in situ hibridizasyon (smFISH) gen ekspresyonu nedeniyle algılayıp bireysel RNA molekülleri saymak için onun yetenek tek kişilik hücrelerde çalışma için güçlü bir tekniktir. Derin-dayandırılmış yöntemleri için tamamlayıcı, smFISH hücre hücre varyasyon transkript bolca ve belirli bir RNA'ın hücre altı yerelleştirme hakkında bilgi sağlar. Son zamanlarda, NDC80 gen ifade mayası mayoz sırasında çalışmaya smFISH kullanmış, hangi iki transkript izoformlarının adlı biri yok ve tüm onun sırası ile uzun izoformu paylaşılan kısa transkript izoformu vardır. Güvenle her transkript izoformu tanımlamak için bilinen smFISH iletişim kuralları en iyi duruma getirilmiş ve yüksek tutarlılık ve kalite tomurcuklanma sırasında alınan örnekleri için smFISH veri elde Maya mayoz. Burada, en iyi duruma getirilmiş bu iletişim kuralı olup kaliteli smFISH veri elde edilir ve bu iletişim kuralı diğer maya suşları ve büyüme koşulları uygulamak için bazı ipuçları belirlemek için kullandığımız ölçütleri açıklanmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis at JoVE.com

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Bu tek molekül floresans in situ hibridizasyon Protokolü bitkisel büyüme ve mayoz sırasında RNA molekülleri mayası sayısını ölçmek için optimize edilmiştir.

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

single-molecule-fluorescence-situ-hybridization-smfish-analysis

Research

JoVE Journal

Genetics

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

19.3K Görüntüleme.  University of California, Berkeley. Bu tek molekül floresans in situ hibridizasyon Protokolü bitkisel büyüme ve mayoz sırasında RNA molekülleri mayası sayısını ölçmek için optimize edilmiştir.

Video: Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

Canlı İmmobilize Maya Hücreleri Görselleştirme Hızlı Tekniği

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Biyoloji

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk of conceiving an aneuploid fetus increases dramatically and this phenomenon is known as the maternal age effect. One requirement for accurate chromosome segregation during the meiotic divisions is maintenance of sister chromatid cohesion during the extended prophase period that oocytes experience. Cytological evidence in both humans and model organisms suggests that meiotic cohesion deteriorates during the aging process. In addition, segregation errors in human oocytes are most prevalent during meiosis I, consistent with premature loss of arm cohesion. The use of model organisms is critical for unraveling the mechanisms that underlie age-dependent loss of cohesion. Drosophila melanogaster offers several advantages for studying the regulation of meiotic cohesion in oocytes. However, until recently, only genetic tests were available to assay for loss of arm cohesion in oocytes of different genotypes or under different experimental conditions. Here, a detailed protocol is provided for using fluorescence in situ hybridization (FISH) to directly visualize defects in arm cohesion in prometaphase I and metaphase I arrested Drosophila oocytes. By generating a FISH probe that hybridizes to the distal arm of the X chromosome and collecting confocal Z stacks, a researcher can visualize the number of individual FISH signals in three dimensions and determine whether sister chromatid arms are separated. The procedure outlined makes it possible to quantify arm cohesion defects in hundreds of Drosophila oocytes. As such, this method provides an important tool for investigating the mechanisms that contribute to cohesion maintenance as well as the factors that lead to its demise during the aging process.

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

This manuscript presents a detailed method for generating X-chromosome arm probes and performing fluorescence in situ hybridization (FISH) to examine the state of sister chromatid cohesion in prometaphase and metaphase I arrested Drosophila oocytes. This protocol is suitable for determining whether meiotic arm cohesion is intact or disrupted in different genotypes.

Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

Tomurcuklanma Maya Floresan Time-lapse Filmler Kazanılması ve GREFTLERİ kullanarak Tek hücreli Dynamics analiz

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Bölünme Maya Cinsel Yaşam Döngüsü Mikroskopi

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Budding Maya endositozun kantitatif, kinetik ve Yüksek verim Analizi pHluorin Uygulamaları

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...