AV bir EMBO uzun vadeli doktora sonrası burs tarafından desteklenmiştir. Martin laboratuarda araştırma bir ERC Başlangıç ​​hibe (GeometryCellCycle) ve SGM bir İsviçre Ulusal Bilim Vakfı hibe (31003A_155944) tarafından finanse edilmektedir.

fizyon maya eşeyli üreme Mikroskopi analizi 1. Medya Hazırlık <ol><li> Glukoz: 10 g / L, KH 2 PO 4: 1 g / L, NaCl: birbirine karıştırılmasıyla az sporlaşma ortamının (MSL-H) 15 Hazırlama 0.1 g / L, MgSO 4 · 7H 2 A: 0.2 g / L. Ekleme Eser elementler (10,000X): 100 ul / L, vitaminler (1,000x): 1 ml / l ve 0.1 M CaCl2 &#160; mL / L. oda sıcaklığında (RT) 0.22 mikron gözenek boyutu filtre ve mağaza kullanarak Filtre sterilize. <ol><li> Aşağıdaki Vitaminler kullanarak (1,000x) hazır: Pantotenat: 1 g / L nikotinik asit: 10 g / L, inozitol: 10 g / L, Biyotin: 10 mg / l. 4 ° C de 0.22 mikron gözenek boyutlu filtre ve mağaza kullanılarak filtre-sterilize edin. </li><li> Borik Asit: 5 g / L, MnSO 4: 4 g / L, ZnSO 4 · 7H 2 O: 4 g / L, FeCl 2 · 6H 2 O: 2 g / L aşağıdaki İz elementler (10,000X) stok kullanın MoO 3: 0.4 g / L, ki: 1 g / L, CuSO 4· 5H 2 A: 0.4 g / L, Sitrik asit: 10 g / L. 4 ° C de 0.22 mikron gözenek boyutlu filtre ve mağaza kullanılarak filtre-sterilize edin. </li></ol></li><li> Agaroz 0.2 g MSL-10 ml N birleştirerek MSL-N agaroz (agaroz pedi odaları yapmak için kullanılan)% 2 hazırlayın. mikrosantrifüj tüpleri içinde agaroz çözünene ve kısım 0.5 ml kadar mikrodalga fırında yüksek güçte yaklaşık 2 dakika boyunca eritin. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> 1 g / L, Lösin: 0.225 g / L adenin: 0.225 g / L, urasil: (NH4) 2 SO4 eklenerek nitrojen MSL-N (MSL + H) En az sporlaşma ortamının hazırlanması 0.225 g / l . 0.22 mikron gözenek boyutu filtre kullanarak filtre sterilize edin. Oda sıcaklığında saklayın. Not: Lösin, adenin ve urasil oksotropik türlerinin büyümesini sağlamak için bu ortama eklenir. Kullanılan soy (örneğin his3Δ için) ayrı bir oksotrofi taşıyan, ek amino asit takviyesi dahil edilmelidir. Ayrıca tamamen Prototrofuna suşları ile bu işi lütfen unutmayın yalnızca, tavsiye edilirBu tür suşlar yüksek çiftleşme verimlilik sağlayacaktır. </li><li> kamara sızdırmazlık için 200 ml valap hazırlayın. beher Lanolin, vazelin (ya da diğer vazelin) ve Parafin eşit ağırlık eklemek. İyice karışana kadar ısı, düşük sıcaklıkta Karışım ara sıra karıştırıldı. Birkaç kültür kaplarına karışımı kısım. Oda sıcaklığında saklayın. </li></ol> Çiftleşme Deney 2. Kültürleme Fizyon maya cinsleri (Şekil 1). <ol><li> 1. Gün, Akşam: MSL + N 3 ml içeren kültür tüplerine katı ortamdan taze çizgili suşları aşılamak. yaklaşık 2.5 cm çapında düz tabanlı tüpler kullanın. adapte kültür hacmi ile diğer kültür tüpleri veya şişeleri kullanın. gece boyunca inkübe (O / N), 25 ° C, 200 rpm&#39;de çalkalayarak. heterothallic suşları ile çalışıyorsanız, ayrı ayrı aşılamak. <ol><li> Kültürler optik yoğunluk akşam 0.4-0.8 600 nm (OD 600) ölçülen sahip olmasını sağlamak için ertesi sabah medyada hücre süspansiyonları sulandırmak. Not:OD fisyon maya hücre konsantrasyonunun bir vekil olarak 600 ölçümleri yaklaşık 0.1-1.0 aralığında doğrusaldır. Bizim spektrofotometre OD 600 = 0.1 ml başına 1.4 x 10 6 hücre karşılık gelir. İlk OD 600 okur Böylece, eğer numuneler güvenilir ölçümler için konsantre / seyreltilmiş gereken bu aralığın dışında bulunmaktadır. </li></ol></li><li> 2. Gün, Akşam: 100 ml&#39;lik şişelere 600 = 0.025 OD MSL + N ortam, 20 ml hücreleri seyreltilir. 30 ° C, 200 rpm&#39;de suşları O / N inkübe edin. Not: Yabani tip hücre kültürleri, OD 600 -0.8 Ertesi sabah (15 saat sonra) ulaşması gerekir. uzun nesil zamanla suşları ile çalışma buna göre seyreltme ayarlayın. </li><li> 3. Gün, Sabah: Kültürler OD 600 ~ 0.8 hücre yoğunluğuna sahip olduğunu doğrulamak için OD 600 ölçün. heterothallic suşları ile çalışıyorsanız, ortak hücrelerinin eşit sayıda karıştırın. 1.5 ml 1.000 xg ve transferi de Pelet hücreleritüp. MSL-N, 1 ml aracı hücreleri üç kez yıkayın. MSL-N orta 3 ml hücreleri yeniden askıya ve = 1.5 OD 600 hücreleri sulandırmak. <ol><li> doğrudan görüntüleme için hücreler monte kardeş hücreler arasındaki çiftleşme izlemek (Protokol bakın Bölüm 2.4). Çiftleşme tipi anahtarlama azot yoksunluğu sonra meydana gelen mitoz bölünmeler sırasında gerçekleşecek olan homothallic H90 suşları kullanın. agaroz pad üzerinde hücrelerin acil montaj hücre bölünmesi sonrası, kardeş-hücreleri yanyana kalır sağlar. </li><li> Hücre polarizasyon (keşif dinamikleri ve shmooing) monitör 30 ° C, görüntüleme için önceden monte hücrelere 3-4 saat boyunca 200 rpm&#39;de hücre kültürü 1-3 ml kuluçkalanması. Bu 3-4 saat içinde, son mitoz bölünme gerçekleşmiş olacak. Birkaç hücreler kutuplaşma başlatmış, ancak sadece kendi keşif polarizasyon dinamiklerini başlangıç ​​olacaktır çoğu. </li><li> Hücre-hücre füzyon 30 ° C&#39;de hücre kültürü 1-3 ml inkübe izlemek için, 200 rpm&#39;de 4-6 saat PRI içinveya görüntüleme için hücrelerin montaj. </li><li> Ekran Füzyon sonrası olaylar, 30 ° C &#39;de hücre kültürleri 1-3 ml önce görüntüleme için hücrelerin montaj 8 saat 200 rpm&#39;de inkübe edin. </li><li> (Sadece heterothallic suşlar için) belirli bir feromon konsantrasyonuna yanıtını izlemek için 30 ° C&#39;de hücre kültürü 3 ml inkübe 200 rpm&#39;de 3-4 st için görüntüleme için hücrelerin montaj öncesinde. <ol><li> 95 ° C ısıya blok MSL-N-içeren ependorf tüp çıkarın (Protokol bölüm 2.4.1 bakın. Aşağıda). eritilmiş MSL-N agaroz doğrudan istenilen konsantrasyonda P-faktörü veya M-faktörü ekleyin. acil ped hazırlanmasından önce vorteks ile iyice karıştırın. </li><li> Hücre monte edildikten sonra, önce görüntüleme 25 ° C&#39;de 15-30 dakika boyunca pedi inkübe edin. P-faktörü ve M faktörü feromon metanol içinde 1 mg / ml&#39;lik bir stok çözeltisinden kullanılmıştır. Not: mutant ile çalışan kuluçka süreleri değişebilir suşları edin. hücrelerin Topaklanma sıvı m uzun süreli kuluçkadan sonra ortaya çıkabiliredya ve bazı mutant özellikle güçlü olabilir. Clumped hücreler tek bir katmanda agaroz pabuçlarına gördü ve böylece otofokus ve görüntü zordur edilemez. Kapsamlı hücre topaklanma durumunda hemen yıkamadan sonra agaroz pedleri hücreleri monte ve yeniden süspansiyon azot eksik medya (Protokol Bölüm 2.3.1 gibi.) ve önceki görüntüleme 30 ° C&#39;de inkübe. </li></ol></li></ol></li><li> Görüntüleme Hücreleri Montaj: <ol><li> 10-15 dakika boyunca 95 ° C ısıya-blok bir kısım eritilmesi ve aralama (Şekil 1B) ile ayrılmış iki cam slaytlar arasında 200 ul ilave edilerek MSL-N- agaroz pedleri 16 hazırlayın. ~ 0.5 mm bir kalınlığı olan tutucular kullanın. ara parçalar yapmak için, kullanım şeritleri gibi kısıtlama enzimleri ile teslim edilene, karton kesip. </li><li> 1 dakika boyunca 1.000 xg&#39;de hücrelerin 100 ul Pelet süpernatant kaldırmak ve artık 2-4 ul ortamda hücrelerin yeniden askıya. o gecikmeler olarak yapmayın taze ortamda yeniden askıyaçiftleşme. </li><li> 2-3 dakika sonra dikkatlice spacers ve üst cam slayt kaldırmak. birçok suşu monte edilecek ise, hücre agaroz pedi hazırlamadan önce konsantre hazırlanır. </li><li> pad Hücrelerin 1 ul ekleyin ve açılan kapak kayma ile kaplama ve valap ile sızdırmazlık önce (~ 1 dk) kurutma başlayana kadar bekleyin. </li><li> ped 25 ° C veya oda sıcaklığında görüntüleme önce en az 30 dakika bekletin. </li><li> Çiftleşme çeşitli aşamalarında bir hücre karışımı elde edilir, MSL-N- (Bölüm 2.3.) &#39;de yıkamadan sonra hemen ped yapmak ve 18 ° CO / N (~ 15 saat) inkübe edilir. Bu yaklaşım zayıf sinyal ile yüksek temporal çözünürlük veya örnekleri ile farklı çiftleşme aşamalarında görüntüleme hücreleri için yararlıdır. </li></ol></li></ol> Çiftleşme Maya Hücreleri 3. Canlı hücre Görüntüleme <ol><li> Resim Alma Ayarları ayarlayın. Not: Burada sunulan görüntü alma ayarları özelleştirilmiş Olympus IX-71 oluşan DeltaVision platformu için optimize edildiPlanı Apo 60X / 1.42 NA veya U-Planı Apo 100X / 1.4 NA hedefleri, bir CoolSnap HQ2 kamera ve bir Insight SSI 7 renk kombine ünite aydınlatıcı ile inverted mikroskop. Donanım aynı zamanda dijital otofokus sağlayan softWoRx v4.1.2 tarafından kontrol edilir. <ol><li> uzun süre boyunca Z-sürüklenme yazılım otomatik odaklama sisteminin kapasitesini aşacak beri otomatik netleme aralıkları 15 dakika aşmamasını emin olun. Bir donanım tabanlı otomatik netleme sistemi kullanıyorsanız, büyük aralıkları kullanın. </li><li> Görüntüleme aralığını ayarlayın. floresan ilk kez protein etiketlenmiş bir ile çalışırken bir başlangıç ​​noktası olarak 15 saat ~ için görüntüleri her 10 dakika sürer. Bu aralık geniş beyazlatma olmadan tüm çiftleşme sürecinin iyi bir bakış sağlar. <ol><li> Böyle füzyon olarak daha doğrusu zaman olaylara 5 dk aralıklarla veya daha kısa Image. Kısa aralıklarla düşük pozlama süreleri ve küçük ağartma sağlayan güçlü fluorophores gerektirir. 1 dk önlemek O / N mikroskobu altında aralıklarla görüntülemeProtokol, Bölüm 2.4.6 ayrıntılı olarak ve bunun yerine tüm birleşme aşamalarının bir karışım hazırlanması. </li></ol></li><li> görüntü pozlama süresini ayarlayın. 50 ile 300 milisaniye arasında test poz süreleri. (Tipik olarak 100&#39;ün üzerinde) bir ayırt sinyali ile zaman noktalarında çok sayıda elde etmek için sinyal-gürültü oranı ve photobleaching arasında bir denge amaçlamaktadır. </li><li> Z-bölümlendirilmeleri ayarlayın. Bölümler her 0,3 mikron kapsayan 5 mikron iyi bir görüntüleme derinliği sağlamak. (- Toplam örnek derinliğinin tek süpürme toplama optik eksen entegrasyonu) OAI kullanılarak minimize edilebilir Z-kesit daha da artar foto-hasar, unutmayın. İyi otomatik odaklama sistemi birçok Z-bölümleri ihtiyacını azaltır ve şiddetle tavsiye edilir. </li></ol></li><li> İpuçları Çiftleşme Tipi özgü Davranışları Eğitim için: <ol><li> Heterothallic suşlar için, H-kullanımı ve iki hücre türünün ayırt edilebilir şekilde, H + hücreleri, tat florofor ifade. herhangi bir genetik olarak kodlanmış fluoropho kullanınBiz sfGFP, GFP 17 hızlı bir katlama varyantı ile iyi bir başarı elde ettiler ama, bir endojen protein sitozolik sürümü veya füzyon olarak ifade yeniden. Endojen proteinler genellikle homolog rekombinasyon 14 kendi endojen genomik loküsündeki etiketlenir. </li><li> Homothallic suşlar için sırasıyla P ve M hücrelerinde ekspresyonu hızlandırmak için bu feromon reseptör genleri MAP3 ve mam2 olanlar gibi birleşme tipi özel promotörlerin kontrolü altında bir genetik olarak kodlanmış sitosolik floresan proteini ifade eder. Map3 ve mam2 destekleyicileri vejetatif büyüme sırasında etkin değildir ve azot açlık 18,19 üzerine uyarılmaktadır. Bu promoterlerin kontrolü altında sitosolik GFP veya mCherry ekspresyonunu yapılar genel olarak cinsel ömrü 12 normal ilerlemesine müdahale etmeyen genomik lokus (ura4, leu1) entegre edilir. </li></ol></li&gt; <li> (Protokol Bölüm 3.2.2 gibi) kullanın çiftleşme tipi özel sitozolik fluorophores diğer bir ortak hücresinden floresan sinyal verme olarak görüntülenmiştir hücre füzyonu hassas zamanlama belirlemek için. </li></ol> Çiftleşme ve Fusion Efficiencies 4. sayısallaştırılması <ol><li> Yukarıda adım 2.3.1 deki gibi, MSL-N agaroz pabuçlarına yıkama doğrudan MSL-N sonra çiftleşme ve füzyon verimliliği 11,12, nokta hücrelerini ölçmek ve 25 ° C öncesinde görüntüleme (Şekil 1A) 24 saat bırakın. Bu homothallic vahşi tip suşu birleşme etkinliği ulaşır protokolü ~% 60 füzyon etkinliğini% 99 kullanılması. mutant gözlenen bu değerlerde herhangi bir azalma bir terminal fenotip veya gecikme yansıtmak olmadığını test etmek için bir 36 saat inkübasyon süresi ile deneyi tekrar. </li><li> olarak çiftleşme verimliliğini hesaplamak <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/53801/53801eq1.jpg" /> Çiftleşme çiftleri identifiye zigot, asci, ve kaynaşmamış hücre çiftleri içerirHer başkalarına karşı kendi konumunu ve büyüme. </li><li> gibi füzyon etkinliğini hesaplayın <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/53801/53801eq2.jpg" /> Not: bitişik eşleşme çiftleri çalışma altında mutant sporulasyonunu etkilemediğini biliniyorsa spor oluşturmayan kabiliyetleri ile tanımlanır. sporülasyon okuma olarak kullanılamaz ise füzyon her iki partner içine sadece bir birleşme ortağı ile ifade sitozolik markör yayılmasını gözlemleyerek belirlenmiştir. </li></ol>

<ol>
	<li>Mata, J., Bahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+roles+of+Ste11p,+cell+type,+and+pheromone+in+the+control+of+gene+expression+during+early+sexual+differentiation+in+fission+yeast.">Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).</li><li>Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomewide+identification+of+pheromone-targeted+transcription+in+fission+yeast.">Genomewide identification of pheromone-targeted transcription in fission yeast.</a> BMC Genomics. 7, 303 (2006).</li><li>Klar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+learned+from+studies+of+fission+yeast+mating-type+switching+and+silencing.">Lessons learned from studies of fission yeast mating-type switching and silencing.</a> Annu Rev Genet. 41, 213-236 (2007).</li><li>Beach, D. H., Klar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangements+of+the+transposable+mating-type+cassettes+of+fission+yeast.">Rearrangements of the transposable mating-type cassettes of fission yeast.</a> EMBO J. 3 (3), 603-610 (1984).</li><li>Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+and+fuse:+how+yeast+cells+do+it.">Mate and fuse: how yeast cells do it.</a> Open Biol. 3 (3), 130008 (2013).</li><li>Mochizuki, N., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+in+the+intracellular+cAMP+level+triggers+initiation+of+sexual+development+in+fission+yeast.">Reduction in the intracellular cAMP level triggers initiation of sexual development in fission yeast.</a> Mol Gen Genet. 233 (1-2), 17-24 (1992).</li><li>Sugimoto, A., Iino, Y., Maeda, T., Watanabe, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+pombe+ste11++encodes+a+transcription+factor+with+an+HMG+motif+that+is+a+critical+regulator+of+sexual+development.">Schizosaccharomyces pombe ste11+ encodes a transcription factor with an HMG motif that is a critical regulator of sexual development.</a> Genes Dev. 5 (11), 1990-1999 (1991).</li><li>Kjaerulff, S., Lautrup-Larsen, I., Truelsen, S., Pedersen, M., Nielsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+activation+of+the+fission+yeast+pheromone-responsive+pathway+induces+ectopic+meiosis+and+reveals+ste11+as+a+mitogen-activated+protein+kinase+target.">Constitutive activation of the fission yeast pheromone-responsive pathway induces ectopic meiosis and reveals ste11 as a mitogen-activated protein kinase target.</a> Mol Cell Biol. 25 (5), 2045-2059 (2005).</li><li>Obara, T., Nakafuku, M., Yamamoto, M., Kaziro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+a+gene+encoding+a+G-protein+alpha+subunit+from+Schizosaccharomyces+pombe:+involvement+in+mating+and+sporulation+pathways.">Isolation and characterization of a gene encoding a G-protein alpha subunit from Schizosaccharomyces pombe: involvement in mating and sporulation pathways.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (13), 5877-5881 (1991).</li><li>Toda, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+yeast+genes+that+confer+resistance+to+staurosporine+encode+an+AP-1-like+transcription+factor+and+a+protein+kinase+related+to+the+mammalian+ERK1/MAP2+and+budding+yeast+FUS3+and+KSS1+kinases.">Fission yeast genes that confer resistance to staurosporine encode an AP-1-like transcription factor and a protein kinase related to the mammalian ERK1/MAP2 and budding yeast FUS3 and KSS1 kinases.</a> Genes Dev. 5 (1), 60-73 (1991).</li><li>Bendezu, F. O., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+explores+the+cell+periphery+for+mate+selection+in+fission+yeast.">Cdc42 explores the cell periphery for mate selection in fission yeast.</a> Curr Biol. 23 (1), 42-47 (2013).</li><li>Dudin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formin-nucleated+actin+aster+concentrates+cell+wall+hydrolases+for+cell+fusion+in+fission+yeast.">A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast.</a> J Cell Biol. 208 (7), 897-911 (2015).</li><li>Chikashige, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere-led+premeiotic+chromosome+movement+in+fission+yeast.">Telomere-led premeiotic chromosome movement in fission yeast.</a> Science. 264 (5156), 270-273 (1994).</li><li>Bahler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).</li><li>Egel, R., Willer, M., Kjaerulff, S., Davey, J., Nielsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+pheromone+production+and+response+in+fission+yeast+by+a+halo+test+of+induced+sporulation.">Assessment of pheromone production and response in fission yeast by a halo test of induced sporulation.</a> Yeast. 10 (10), 1347-1354 (1994).</li><li>Tran, P. T., Marsh, L., Doye, V., Inoue, S., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+nuclear+positioning+in+fission+yeast+based+on+microtubule+pushing.">A mechanism for nuclear positioning in fission yeast based on microtubule pushing.</a> J Cell Biol. 153 (2), 397-411 (2001).</li><li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Kitamura, K., Shimoda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Schizosaccharomyces+pombe+mam2+gene+encodes+a+putative+pheromone+receptor+which+has+a+significant+homology+with+the+Saccharomyces+cerevisiae+Ste2+protein.">The Schizosaccharomyces pombe mam2 gene encodes a putative pheromone receptor which has a significant homology with the Saccharomyces cerevisiae Ste2 protein.</a> EMBO J. 10 (12), 3743-3751 (1991).</li><li>Tanaka, K., Davey, J., Imai, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+pombe+map3++encodes+the+putative+M-factor+receptor.">Schizosaccharomyces pombe map3+ encodes the putative M-factor receptor.</a> Mol Cell Biol. 13 (1), 80-88 (1993).</li><li>Motegi, F., Arai, R., Mabuchi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+type+V+myosins+in+fission+yeast,+one+of+which+functions+in+polarized+cell+growth+and+moves+rapidly+in+the+cell.">Identification of two type V myosins in fission yeast, one of which functions in polarized cell growth and moves rapidly in the cell.</a> Mol Biol Cell. 12 (5), 1367-1380 (2001).</li><li>Sajiki, K., Pluskal, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+analysis+of+fission+yeast+at+the+onset+of+nitrogen+starvation.">Metabolomic analysis of fission yeast at the onset of nitrogen starvation.</a> Metabolites. 3 (4), 1118-1129 (2013).</li><li>Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+fluorophore+formation+and+engineering.">Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering.</a> Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 557-562 (2003).</li><li>Dyer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+shallow+chemical+gradients+by+actin-driven+wandering+of+the+polarization+site.">Tracking shallow chemical gradients by actin-driven wandering of the polarization site.</a> Curr Biol. 23 (1), 32-41 (2013).</li><li>Beta, C., Bodenschatz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+tools+for+quantitative+studies+of+eukaryotic+chemotaxis.">Microfluidic tools for quantitative studies of eukaryotic chemotaxis.</a> Eur J Cell Biol. 90 (10), 811-816 (2011).</li><li>Lee, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+dynamic+assay+of+single+cell+chemotaxis.">Quantitative and dynamic assay of single cell chemotaxis.</a> Integr Biol (Camb). 4 (4), 381-390 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Çevresel koşullar, ve besin kullanılabilirlik, özellikle güçlü fisyon maya fizyolojisini etkiler. Azot açlık eşeyli üreme bağlılık için gerekli olan ve başlangıçta mitoz hücre döngüsü ilerlemesinde çarpıcı değişiklikler (Ref. 21 ve Şekil 2) yol açar. Katlanarak büyüyen nüfus azot giderimi üzerine, bölünme sırasında hücre boyutu hızla (Şekil 2C) azalır ve hücrelerin çoğunluğu yeni doğmuş katlanarak büyüdü hücreleri (Ref. ...

İki hücre arasındaki genetik değişim eşeyli üreme merkezi olay olmasına rağmen, hücre farklılaşmasını teşvik ortağı seçimi için izin hücre-hücre füzyonu yürütmek ve genomik istikrarı korumak olaylar zincirinin dayanmaktadır. Böylece cinsel yaşam döngüsü gelişimsel anahtarları ile ilgili biyolojik bir dizi soru incelemek için bir model sistem olarak kendini göstermektedir, fisyon maya bu olguları incelemek için cinsel döngüsü keşfetmek vb dışsal uyaranlara, plazma membran füzyon, kromozom ayrımı, yanıt faydalarını getirir Model sisteminin güçlü genetik, yüksek verimli yaklaşımları ve sofistike mikroskopi köklü. fisyon maya Sex P-hücre ve farklı çiftleşme tipleri M-hücre arasında bir heterotypic olaydır. İki hücre tipleri farklı olarak salgılanan P- üretim ve M-feromonlar, feromon-reseptörleri map3 ve Mam2 yanı sıra feromon-protea için olanlar da dahil olmak üzere genlerin 1,2 bir dizi ifadeses Sxa1 ve Sxa2. Bu yaygın olarak kullanılan H90 suşu olarak Homothallic suşlar, tek genomunda her iki geçme tip genetik bilgi taşıyan ve hücreler (Ref. 3 gözden) mitotik yaşam döngüsü boyunca birleşme tipi anahtarlama karmaşık bir desen geçer. Nadiren veya hiç çiftleşme türünü değiştirmek heterothallic fisyon maya Çoklu izolatlar da yaygın en belirgin, h + N (P-tipi) ve h -S (M-tipi) suşları 4 kullanılmaktadır. fizyon maya, cinsel yaşam döngüsü içine giriş katı besin yönetmelik altındadır. Sadece azot hasret fisyon maya hücreleri mitotik üreme tutuklama ve bir çiftleşme partneri varlığına işaret ve (Ref. 5 gözden) cinsel döngünün ilave adımlar teşvik etmek yayılabilir feromonlar üretir. Azot yoksunluk gelişimsel anahtarı olarak görev yapar ve e-teşvik çiftleşme Ste11 anahtar transkripsiyonel regülatör de-bastıranferomon reseptörü ve Ferromon üretim genleri 6,7 dahil olmak üzere belirli genleri çiftleşme XPression. Feromon-reseptör nişan ayrıca böylece çiftleşme ortakları arasında pozitif geribildirim feromon üretimin artırılması, Ste11 transkripsiyonel aktivitesini 8-10 artırır reseptör-birleştiğinde protein G-alfa ve aşağı MAPK sinyallerini harekete geçirir. Feromon seviyeleri hücre polarite, Rho-aile GTPaz Cdc42 11 master organizatörü düzenleyerek farklı hücre polarizasyon durumları ikna etmek için çok önemlidir. Düşük feromon konsantrasyonlarına maruz kaldıktan sonra, aktif Cdc42 hücre kenarına keşfetmek dinamik yamalar görüntülenmiştir, ve hücre büyümesi, bu aşamada görülmektedir. Artan feromon düzeyleri tek bölge ve polarize projeksiyon büyümesine Cdc42 aktivitesinin istikrar teşvik temas ortak hücrelerini getiren Shmoo olarak adlandırılan. Daha sonra, iki haploid çiftleşme ortakları diploid zigot oluşturmak için sigorta. Son çalışmalar th ortayaçiftleşme kaynaklı formin FUR1 12 tarafından monte edilir füzyon için gerekli yeni bir aktin yapısının e varlığı. Bu füzyon odak böylece hücre lizizi 12 olmadan plazma zarı temasa izin hücre duvarının biçimlenme sağlayan tip V miyosin sürece bağlı olarak, konsantre ve hücre duvarı bozunma amaçlı konumlandırır. Hücre-hücre füzyon üzerine, çekirdekler temas ve karyogamy geçer. Zigot (at kuyruğu hareket) içindeki çekirdeğin önde gelen bir dynein bağımlı ve geri ileri hareketi daha sonra mayoz tarafından takip edilir kromozom homologlarının 13,14, eşleştirme teşvik etmektedir. Son olarak, mayoz dört ürün sporlanma sırasında bireysel sporların içine paketlenir. Çünkü onun karmaşıklığı ve ilgili sayısız adımlar, çiftleşme detaylı izleme zorlu olmuştur. İki önemli zorluklar tüm süreci iyi on beş saatten fazla sürdüğünü ve hücrelerin senkronize etmek zor olmasıdır. bu difficulties tek hücreli mikroskopi yaklaşımlarla hile vardır. İşte genel bir protokol fisyon maya cinsel yaşam döngüsü sunulmaktadır araştırmak. küçük ayarlamalar ile, bu protokol sürecinin tüm farklı aşamalarında, çiftleşme gen ürünü olmayan kardeş ortakları çiftleşme tipi anahtarlama sonra kardeş hücreler arasında ve hücre kutuplaşma ve eşleştirme, hücre-hücre füzyon yani indüksiyon çalışmasına izin verir, ve post-füzyon at kuyruğu hareket, mayoz ve sporulasyon. Bu yöntem kolayca görselleştirmek floresan sırasında ve sonrasında füzyon, zaman önceden üzerinde etiketli proteinlerin) 1 olanak sağlar; 2) karşıt çiftleşme Çeşidi hücrelerin davranışını ayırt; ve 3) ölçü ve shmooing, çiftleşme, füzyon ya da sporlaşma verimliliği gibi parametreleri ölçmek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="667">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:219px;">Glucose</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:108px;">G8270-10KG</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.05108.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pantothenate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2088,0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Nicotinic Acid</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0963,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Inositol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1716,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Biotin</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0967,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MnSO4</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1038,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZnSO4.7H2O&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FeCl2.6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3514,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molybdenum oxide (VI) (MoO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>69850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">KI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3872,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CuSO4.5H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1034,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Citric Acid&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2344,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(NH4)2SO4&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01217.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">L-Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Adenine Hemisulfat Salt, mini 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Uracil&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Lanolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vaseline</td>
			<td>Reactolab</td>
			<td>92045-74-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Paraffin</td>
			<td>Reactolab</td>
			<td>7005600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopy of fission yeast sexual lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

Bir Azot Kaynak çıkarması üzerine Fisyon Maya Büyüme ve Çiftleşme Dinamikleri Azot açlık füzyon maya cinsel üreme başlatılması için bir ön koşul olarak, vahşi tip homothallic H90 suşu, Şekil 1 &#39;de tarif edilen protokol izlenerek, azot bakımından zengin azot yoksun ortama (Şekil 2) kayması üzerine izlenmiştir. Kısaca açıklamak gerekirse hücreler MSL + N ortam içerisinde üstel faz (OD = 0.5 600)</su...

Watch this Scientific Journal Video about Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle at JoVE.com

Fisyon Mayasının Cinsel Yaşam Döngüsünün Mikroskobu | Biyoloji | Video

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Bölünme Maya Cinsel Yaşam Döngüsü Mikroskopi

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

microscopy-of-fission-yeast-sexual-lifecycle

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Human Biology

Reproduction and Development

SCIENTISTS IN ACTION

14.4K Görüntüleme.  University of Lausanne. We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process. 

Video: Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Maya hücreleri Mitokondri saflaştırılması

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Biyoloji

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

Maya Colony Gömme Yöntemi

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Yüksek Aktif Maya Ribozomlar Kromatografik Arıtma

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces fruiting bodies, called perithecia, on carrot agar. Perithecia contain numerous tissue types, produced at specific stages of perithecium development. These include (in order of appearance) formation of the perithecium initials (which give rise to the ascogenous hyphae), the outer wall, paraphyses (sterile mycelia which occupy the center of the perithecium until the asci develop), the asci, and the ascospores within the asci14. The development of each of these tissues is separated by approximately 24 hours and has been the basis of transcriptomic studies during sexual development12,8. Refer to Hallen et al. (2007) for a more thorough description of development, including photographs of each stage. Here, we present the methods for generating and harvesting synchronously developing lawns of perithecia for temporal studies of gene regulation, development, and physiological processes. Although these methods are written specifically to be used with F. graminearum, the techniques can be used for a variety of other fungi, provided that fruiting can be induced in culture and there is some synchrony to development. We have recently adapted this protocol to study the sexual development of F. verticillioides. Although individual perithecia must be hand picked in this species, because a lawn of developing perithecia could not be induced, the process worked well for studying development (Sikhakolli and Trail, unpublished).
The most important function of fungal fruiting bodies is the dispersal of spores. In many of the species of Ascomycota (ascus producing fungi), spores are shot from the ascus, due to the generation of turgor pressure within the ascus, driving ejection of spores (and epiplasmic fluid) through the pore in the ascus tip2,7. Our studies of forcible ascospore discharge have resulted in development of a "spore discharge assay", which we use to screen for mutations in the process. Here we present the details of this assay.
F. graminearum is homothallic, and thus can form fruiting bodies in the absence of a compatible partner. The advantage of homothallism is that crossing is not necessary to generate offspring homozygous for a particular trait, a facet that has facilitated the study of sexual development in this species14,7. However, heterothallic strains have been generated that can be used for crossing5,9. It is also possible to cross homothallic strains to obtain mutants for several genes in one strain1. This is done by coinoculating one Petri dish with 2 strains. Along the meeting point, the majority of perithecia will be recombinant (provided a mutation in one of the parent strains does not inhibit outcrossing). As perithecia age, they exude ascospores en masse instead of forcibly discharging them. The resulting spore exudate (called a cirrhus) sits at the tip of the perithecium and can easily be removed for recovery of individual spores. Here we present a protocol to facilitate the identification of recombinant perithecia and the recovery of recombinant progeny.

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Sexual crosses and isolation of recombinant progeny are important research tools for the filamentous fungus, Fusarium graminearum, The techniques necessary successfully carry out these processes are presented.

Cinsel Gelişim ve askopor Deşarj Fusarium graminearum</em

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Yüzey Yayma ve Maya Kromozomlar immün

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

Fisyon Maya Cytokinetic Olayların zamanmekansal Analizi

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...