Name: combining analysis of dna in a crude virion extraction with the analysis of rna from infected leaves to discover new virus genomes
Uploaded: 2018-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes at JoVE.com

Araştırma bilim ilerleme ve teknoloji uygulanan araştırma programı faz II AR 132-053-2 için Oklahoma Merkezi tarafından finanse edildi; ve tarım özel bitkileri Oklahoma departmanı tarafından hibe programı araştırma. Biz Dr HongJin Hwang ve OSU Biyoinformatik çekirdek tesisi olan NSF (EOS-0132534) ve NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 ve 5P20RR15564 / 03) gelen hibe tarafından desteklenen teşekkür ederim.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Son yıllarda çeşitli yöntemler istihdam bitki virüs biyoçeşitlilik virüs benzeri parçacıklar (VIP) ya da virüs belirli RNA veya DNA2,3,44için zenginleştirici içeren doğal ortamlarda çalışmaya, 45,46 . Bu yöntemler NGS ve bioinformatic analiz tarafından takip edilmektedir. Bu çalışmanın amacı ekili fabrikasında ortak bir hastalık nedensel Ajan bulmaktı. Hastalık bu sigara zarflı bacilliform parçacıklar vardır ve yalnızca bir 565 bp parçası klonlanmış47olduğu bilinmeyen bir virüs sonucu olduğu bildirildi. Bu bilgi kuramsal olarak Caulimoviridaeaile içinde cins Badnavirus virüs atamak önceden araştırmacılar için yeterli oldu. Önceki raporlar canna lilyum canna mottle hastalığında bu çalışmada, özetlenen metagenomics yaklaşımı kullanarak tek bir badnavirus sonucuydu onaylanmadığına karar ise hastalık iki geçici badnavirus türler24tarafından neden olduğu belirledi. Böylece, biz şimdi durumlar belirleyebilir bir hastalık nedensel Ajan keşfetmek için bir metagenome yaklaşımı kullanmanın gücü olduğunu yerde birden fazla nedeni olabilir.
DNA ve RNA sıralama veri birleştirerek yaklaşımımız kapsamlı olduğunu ve ayrıca iki yaklaşım kullanarak sonuçları tutarlı sonuçlar vermiştir ve iki ilgili virüs varlığını doğruladı. Biz caulimoviruses yalıtım için değiştirilmiş bir yordam istihdam ve bu ilişkili virüs nükleik asitler için zenginleştirilmiş ve bu virüs kapsid içinde korunan bir örnek üretti. Bir hizmet laboratuar DNA sıralama dışarı taşımak için sözleşme imzalamıştı. Temel de novo sıralama için bu DNA polimeraz nükleotit bir DNA şablon iplik DNA sentezi sıralı döngüsü sırasında etiketli floresan içerir bir kavramdır. Contigs monte takip NGS tarafından virüs contigs tespit edilmiştir birkaç contigs üreten bir bioinformatic iş akışı içine sunuldu. Doğrulanmadı iki virüs genleri10,24,48,49,50 bioinformatic Analizi ribo tükenmiş RNA ürünleri alınan RNA-seq veri ile elde edildi. Bir ilginç sonuç dizileri nüfus DNA ve RNA sıralama tarafından kurtarılan öğrenmek için çıktı bu benzer viral sigara ve viral nükleik asitleri dağılımları sağlanan. DNA ve RNA sıralama için < %0,5 sıralarının virüs kökenli idi. Virüs dizileri 78-%82 Caulimoviridaeailesine ait nüfus içinde. DNA ve RNA sıralama üzerinden birleştirilmiş virüs contigs karşılaştırarak, iki monte genleri her iki veri kümelerini meydana geldiğini doğruladı.
Yeni virüs genleri tanımlamak için tek DNA sıralama kullanarak bir endişe badnavirus genom açık bir dairesel DNA olmasıdır. Süreksizliklerin genom içinde üst üste dizileri contigs genom derleme için engel mevcut olabilir tahmin edebilmiş. DNA sıralama sonuçlarının ilk sınav iki benzer virüs genleri ortaya koydu. Biz bu genleri de değil okudu bir türün genetik çeşitlilik temsil olan veya24aynı ortak bulaşmasını temsil iki tür bitki. Bu nedenle, toplu bioinformatic analiz NGS DNA ve RNA sıralamanın, tarafından elde edilen veri kümeleri iki tam uzunlukta genomları varlığı teyit etkin.
VIP ve nükleik asitler bitki homogenates metagenomic araştırmalar, DNA dan karnabahar mozaik virüsü (CaMV; bir caulimovirus)3kurtarmak için yordamlar dayalı çıkarma için alternatif bir Yöntem geliştiren başka bir rapordur. Bu yaklaşım Roman RNA ve DNA virüs olmayan ekili bitkiler serilerinde tespit edilmiştir. Doğal olarak enfekte bitkiler24VIP ayıklamak için türetilmiş adımları aksine bir hastalık ekili bitkiler nedensel Ajan keşfetmek için bu çalışmada kullanılan caulimovirus yalıtım yordamla elde adımlar vardır. Değiştirilmiş her iki yöntem başarısı caulimovirus yalıtım framework yordamı genel bitki virüs metagenomic çalışmalar için değerli bir başlangıç noktası olabileceğini düşündürmektedir.

Ortaya çıkan bitki hastalıklarının araştırmacılar doğru nedensel temsilcisi tanımlamak için yeni araçlar geliştirmek için sürücü. Yeni veya yinelenen virüs hastalıklarının başlangıç raporlarını mozaik ve yaprak, takas ven, cücelik, solan, lezyonlar, nekroz malformasyonlar gibi yaygın olarak karşılaşılan belirtiler veya diğer belirtiler üzerinde temel alır. Diğer bulaşıcı patojenler ayırmak için bir hastalık için nedensel ajan olduğu gibi yeni bir virüs raporlama için standart uygun konukçuda yaymak ve özgün ana bilgisayar türlerinin sağlıklı bitkiler aşı hastalık ürerler. Bu yaklaşımda bitki virüslerin birçok cins bir böcek ya da diğer vektörleri iletim uygun bir ana bilgisayar veya yeniden özgün ana türler için üzerine bağlıdır kısıtlamadır. Bu durumda, uygun vektör için arama uzun, Yöneyin laboratuar koloniler kurmak için zorluklar olabilir ve daha fazla çabaları bir protokol deneysel iletimi için hazırlamak gereklidir. Eğer başarılı laboratuar iletim çalışmaları için koşullar elde çalışma yeni bir virüs hastalık raporlama için standart kısa düşüyor. Çok düşük titreleri doğal onların ana oluşan virüs olarak araştırmacılar araştırma taşımak için yeterli bulaşıcı hisse senetleri korumak için alternatif hosts yayma için tanımlamanız gerekir. Sadece bir kaç bitki bulaştırmak virüs türler için bu da hisse senedi kültürler1büyüyen için bir engel olabilir.
Son yıllarda, bilim adamları daha sık yüksek üretilen iş NGS ve metagenomic yaklaşımlar için bilinen bir hastalık ilgisiz bulunabilir, ancak taksonomik tür ve cins atanabilir çevre, mevcut virüs dizileri ortaya çıkarmak için istihdam olduğunu 2 , 3 , 4. bulma ve ayrı bir ortamda genetik materyallerin sınıflandırılması böyle yaklaşımlar virüs çeşitlilik doğanın ya da varlığı belirli bir ekosistem tanımlamak için bir yol sağlar, ancak mutlaka tanımlamak için bir çerçeve için onaylamak değil nedensel maddeleri için belirgin bir hastalık.
Badnavirus cins Caulimoviridae pararetroviruses ailesine ait. Bu virüsler bacilliform şekli ile dairesel Çift Kişilik iplikçik DNA genleri yaklaşık 7-9 KB vardır. Tüm pararetroviruses bir RNA orta yineler. Pararetroviruses episomes mevcut ve bitki kromozom DNA5,6bağımsız çoğaltmak. Saha çalışmaları virüs nüfusun bu virüs nüfus genetiği karmaşık olduğunu gösteriyor. Buna ek olarak, bir bitki genom aralığında yüksek işlem hacmi sıralama tarafından elde edilen bilgileri gayri meşru tümleştirme olaylar tarafından bitki genleri eklenen badnavirus genom parçaları sayısız örnekleri ortaya. Bu endojen badnavirus dizilere mutlaka enfeksiyon7,8,9,10,11ile ilişkili değildir. Daha sonra yeni badnaviruses hastalığı nedensel ajan olarak tanımlamak için NGS kullanımı episomal genleri subpopulation çeşitliliği yanı sıra endojen dizileri12,13oluşumunu karmaşıktır.
Roman pararetrovirus genleri keşfi için değil bir en uygun potansiyel varken, bu virüs hastalığı için nedensel ajanı olarak tanımlamak için iki genel yaklaşım vardır. Virüslü yaprakları küçük RNA sıralarının zenginleştirmek ve virüs genome(s)14,15,16,17yeniden oluşturmak için bu dizilere araya bir yöntemdir. Çalışırken daire amplifikasyon (RCA) dairesel DNA virüs genleri18yükseltmek için başka bir yaklaşımdır. RCA başarısı yaş yaprak ve virüs titresi seçilen doku bağlıdır. RCA ürünleri kısıtlama sindirim için tabi ve plazmidler için19,20,21sıralama doğrudan içine klonlanmış.
Canna sarı mottle virüs (CaYMV) bir badnavirus olduğunu ve sadece bir 565 bp parçası genom virüslü cannas22daha önce izole olmasına rağmen canna, sarı mottle hastalığının etyolojik neden olarak tanımlanıyor. Çağdaş bir çalışma Alpinia purpurata (çiçekli zencefil; CaYMV tespit CaYMV-Ap)23. Bu çalışmanın amacı tam badnavirus genom dizileri virüslü canna lilyum kurtarmak için oldu. Biz virüs--dan bitki kirletici arındırıcı ve bu hazırlık üzerinden viral DNA izole eden bir protokol tanımlamak ve DNA kitaplığa NGS kullanmak için hazırlamak. Bu yaklaşım ara moleküler amplifikasyon adımları gereksinimini ortadan kaldırır. Biz de RNA-seq. NGS için virüslü bitkilerden mRNA izole olan RNA-seq içerir her nükleik asit hazırlık kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Monte contigs Badnavirus takson nükleik asit (BLASTn) için Biyoteknoloji ve bilgi (NCBI) temel yerel hizalama arama aracı için Ulusal Merkezi kullanarak her iki DataSet'lerdeki ile arasında bir ilişki bulunamadı. Biz iki badnavirus türler24genleri tespit.

<table><tbody><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich St. Louis MO</td><td>S5976</td><td>Grinding buffer for virus purification</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S0751</td><td>Grinding buffer for virus purification</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Thermo-Fisher Waltham, MA</td><td>28790</td><td>Grinding buffer for virus purification</td></tr><tr><td>urea</td><td>Thermo-Fisher</td><td>PB169-212</td><td>Homogenate extraction&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>X-100</td><td>Homogenate extraction&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cheesecloth</td><td>VWR Radnor, PA</td><td>21910-107</td><td>Filter homogenate&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tris&amp;nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Pellet resuspension&amp;amp; DNA resuspension buffers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Spectrum, Gardena, CA</td><td>M1035</td><td>Pellet resuspension buffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Spectrum</td><td>E1045</td><td>Stops enzyme reactions</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo-Fisher</td><td>25530</td><td>DNA resuspension buffer</td></tr><tr><td>phenol:chloroform:isoamylalcohol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td>Dissolve virion proteins</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Degrade cellular DNA from extracts</td></tr><tr><td>95% ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6B-100</td><td>Virus DNA precipitation</td></tr><tr><td>Laboratory blender</td><td>VWR</td><td>58984-030</td><td>Grind leaf samples</td></tr><tr><td>Floor model ultracentrifuge&amp;nbsp; &amp;amp;Ti70 rotor</td><td>Beckman Coulter, Irving TX&amp;nbsp;</td><td>A94471</td><td>Separation of cellular extracts</td></tr><tr><td>Floor model centrifuge and JA-14 rotor</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>369001</td><td>Separation of cellular extracts</td></tr><tr><td>Magnetic stir plate</td><td>VWR</td><td>75876-022</td><td>Mixing urea into samples overnight</td></tr><tr><td>Rubber policeman</td><td>VWR</td><td>470104-462</td><td>Dissolve virus pellet</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;2100 bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent Genomics, Santa Clare, CA</td><td>G2939BA</td><td>Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer RNA-Picochip</td><td></td><td>5067-1513</td><td>Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip</td><td></td><td>5067-4626</td><td>Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer</td></tr><tr><td>Nanodrop spectrophotometer</td><td>Thermo-Fisher</td><td>ND-2000</td><td>Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures</td></tr><tr><td>Plant total RNA isolation kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>STRN50-1KT</td><td>Isolate RNA for RNA-seq</td></tr><tr><td>RNase-free water&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>10128-514</td><td>Resuspension of DNA and RNA for NGS</td></tr><tr><td>RNA concentrator spin column</td><td>Zymo Research, Irvine, CA</td><td>R1013</td><td>Prepare RNA for RNA-seq</td></tr><tr><td>rRNA removal kit</td><td>Illumina, San Diego, CA</td><td>MRZPL116</td><td>Prepare RNA for RNA-seq</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>Prepare RNA for RNA-seq</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;RNA&amp;nbsp; enrichment system</td><td>Roche</td><td>7277300001</td><td>Prepare RNA for RNA-seq</td></tr><tr><td>Agarose&amp;nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>16500100</td><td>Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15585011</td><td>Agarose gel staining</td></tr><tr><td>pGEM-T +JM109 competent cells</td><td>Promega, Madison, WI</td><td>A3610</td><td>Clone genome fragments</td></tr><tr><td>pFU Taq polymerase</td><td>Promega</td><td>M7741</td><td>PCR amplify virus genome</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td>PCR amplify virus genome</td></tr><tr><td>PCR oligonucleotides</td><td>IDT, Coralvill, IA</td><td>Custom order</td><td>PCR amplify virus genome</td></tr><tr><td>Miniprep DNA purification kit</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td>Plasmid DNA purification prior to sequencing</td></tr><tr><td>PCR clean-up kit</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Prepare PCR products for cloning</td></tr><tr><td>pDRAW32 software</td><td>ACAClone</td><td></td><td>Computer analysis of circular DNA and motifs</td></tr><tr><td>MEGA6.0 software</td><td>MEGA</td><td></td><td>Molecular evolutionary genetics analysis</td></tr><tr><td>Primer 3.0</td><td>Simgene.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT&amp;trade; RiboGreen&amp;trade; RNA Assay Kit</td><td>Thermo-Fisher</td><td>R11490</td><td>Fluorometric determination of RNA quantity</td></tr><tr><td>GS Junior&amp;trade; pyrosequencing System</td><td>Roche</td><td>5526337001</td><td>Sequencing platform</td></tr><tr><td>GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A)</td><td>Roche</td><td>5996520001</td><td>Reagents for emulsion PCR</td></tr><tr><td>GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents</td><td>Roche</td><td>5996490001</td><td>Reagents for emulsion PCR</td></tr><tr><td>GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A)</td><td>Roche</td><td>5996538001</td><td>Reagents for emulsion PCR</td></tr><tr><td>GS Jr EmPCR Oil &amp;amp; Breaking Kit</td><td>Roche</td><td>5996511001</td><td>Reagents for emulsion PCR</td></tr><tr><td>GS Jr Titanium Sequenicing kit*</td><td>Roche</td><td>5996554001</td><td>Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads</td></tr><tr><td>GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit</td><td>Roche</td><td>5996619001</td><td>Sequencing plate with associated reagents and gaskets</td></tr><tr><td>IKA Turrax mixer</td><td></td><td>3646000</td><td>Special mixer used with Turrax Tubes</td></tr><tr><td>IKA Turrax Tube (specialized mixer)</td><td></td><td>20003213</td><td>Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions</td></tr><tr><td>GS Nebulizers Kit</td><td>Roche</td><td>5160570001</td><td>Nucleic acid size fractionator for use during library preparations</td></tr><tr><td>GS Junior emPCR Bead Counter</td><td>Roche</td><td>05 996 635 001</td><td>Library bead counter</td></tr><tr><td>GS Junior Bead Deposition Device</td><td>Roche</td><td>05 996 473 001</td><td>Holder for Picotiter plate during centrifugation</td></tr><tr><td>Counterweight &amp;amp; Adaptor for the Bead Deposition Devices</td><td>Roche</td><td>05 889 103 001</td><td>Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation</td></tr><tr><td>GS Junior Software</td><td>Roche</td><td>05 996 643 001</td><td>Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data</td></tr><tr><td>GS Junior Sequencer Control v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td></tr><tr><td>GS Run Processor v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td></tr><tr><td>GS De Novo Assembler v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td></tr><tr><td>GS Reference Mapper v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td></tr><tr><td>GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td></tr></tbody></table>

combining analysis of dna in a crude virion extraction with the analysis of rna from infected leaves to discover new virus genomes

Bu metagenome yaklaşım dairesel DNA genleri ile bitki virüs ve onların transkript tanımlamak için kullanılır. Ev sahibi olarak düşük titreleri meydana veya mekanik olarak başka bir ana bilgisayara aşılamak değil sık sık bitki DNA virüsler bulaşıcı malzeme büyük bir titresi elde etmek için yaymak zordur. En uygun pH ve çoğu bacilliform Para retrovirüsler arıtma için önerilen iyonik bileşimi ile hafif bir tampon toprağa virüslü yapraklar. Üre virions tuzak dahil cesetleri kırmaya ve hücresel bileşenleri dağıtmak için kullanılır. Fark Santrifüjü daha fazla virions ayrılması bitki kirletici üzerinden sağlar. Sonra İndinavir K tedavi capsids kaldırır. Sonra viral DNA konsantre ve yeni nesil sıralama (NGS) için kullanılır. NGS veri virüs dizileri oluşturulan veri kümesi kümesini tanımlamak için NCBI-BLASTn için hangi gönderilmektedir contigs birleştirmek için kullanılır. Paralel bir boru hattı, RNA bir standart sütunlara göre RNA ayıklama yöntemi kullanarak enfekte yapraklarından izole edilmiştir. MRNA ve virüs tutanaklar bir alt için zenginleştirmek için ribozom tükenmesi sonra gerçekleştirilir. Birleştirilmiş dizileri (RNA-seq) sıralama RNA türetilmiş virüs serilerinde bu veri kümesi kümesini tanımlamak için NCBI-BLASTn için sunuldu. Bizim çalışmada, iki veri kümeleri içinde iki ilgili tam uzunlukta badnavirus genleri tespit edilmiştir. Bu yöntem bitki virüs genom dizileri reconstitute için toplam nüfusun küçük RNA dizilerinin ayıklayan başka bir ortak yaklaşım tercih edilir. Bu ikinci metagenomic boru hattı kurtarır virüs ile ilgili diziler bu retro transkripsiyonu öğeleri bitki genom eklenir. Bu daha da aktif enfeksiyöz ajanlar ayırt etmek biyokimyasal veya moleküler deneyleri için birleştirilmiştir. Bu çalışmada, belgelenen yaklaşım dizileri büyük olasılıkla etkin virüs enfeksiyonu gösteren virüsler çoğaltılıyor temsilcisi kurtarır.

Bu değiştirilmiş virüs arıtma yöntemi virüs DNA'lar NGS ve Biyoinformatik iki virüs türü tanımlamak için yararlı bir zenginleştirme sağlanan. Homogenate 40.000 x g 2,5 h için de centrifuged sonra tüp altındaki yeşil bir pelet ve uzunluğu boyunca beyaz bir Pelet vardı. Yeşil Pelet bir microcentrifuge tüp içine resuspended ve beyaz Pelet iki microcentrifuge tüpler içine resuspended. PCR standart CaYMV PCR tanılama primerler kullanılarak gerçekleştirildiği ve ürünleri solubilized beyaz Pelet ve değil yeşil Pelet (Şekil 1A) tespit edildi. Ham hazırlama örneği transmisyon elektron mikroskobu tarafından incelenmiş ve 124-133 nm uzunluğundadır (Şekil 1B) ölçme bacilliform partikülleri görülmektedir. Çoğu badnaviruses öngörülen kalıcı uzunluğu içinde bu. DNA beyaz ve yeşil çökeltilerini çıkarılan ve ayrı ayrı resuspended. Şekil 1C, biz 5 µL yeşil çıkarılan DNA'ın yüklü ve beyaz Pelet örnek (yeşil kısmı için DNA'ın 1.6 µg) ve DNA 3,1 µg beyaz kısmı için % 0,8 özel Elektroforez jel ve etidyum bromür takip DNA analiz boyama. Beyaz kesir daha yüksek molekül ağırlıklı DNA, hem de daha düşük moleküler ağırlıklı DNA (Şekil 1C) iki grup üretilen ise yeşil kesir düşük moleküler ağırlıklı DNA içerdiği. Şekil 1' deC sunulan jel 100 V 40 min için çalıştırıldı ve jel gerilim daha net bantları üretmek için düşürülmelidir şeritte 3 smear öneriyor. Bu verileri beyaz Pelet virions için zenginleştirilmiş göstermektedir. Beyaz örneğinden çıkarılan DNA (0.6 µg/mL) konsantrasyonu düşük ama yeterli için en az 10 gerektirir NGS ng devam etmek için DNA'ın. Parçalanmış DNA'lar bir kütüphane NGS için hazırlamak için kullanıldı.
Buna paralel olarak, RNA virüslü canna bitkilerden (Şekil 1D) yüksek üretilen iş RNA-devamı için ayıklandı Standart bir iş akışı için Kütüphane hazırlık, contigs oluşturma ve viral genom dizileri (Şekil 1E) tanımlayan NGS yapılmıştır. DNA ve RNA malzemeleri başlangıç olarak kullanarak çıkış sonuçları karşılaştırıldı.
Biz 188,626 ham DNA okuma NGS tarafından ham virüs hazırlık izole DNA'yı kullanarak elde. Okuma 13,269 contigs monte ve BLASTn NCBI veri kümesi nükleotit dizileri aramak için kullanılan (Viridplantae TaxID kullanarak: 33090 ve virüs TaxID: 10239 sınırlayıcı organizmalar olarak) (resim 1E). NCBI-BLASTn sonuçları monte de novo contigs % 93 hücresel dizileri vardı, % 22 bilinmeyen ve virüs contigs (resim 2A) % 0,3 olduğunu ortaya koydu. Contigs hücresel dizileri olarak mitokondriyal tespit edilmiştir olarak kategorize veya kloroplast DNA çoğunluğu. Virüs contigs veri kümesi içinde virüs contigs % 32 (yani Badnavirus dizileri edilmiştir), üyelerine Caulimoviridae ilgili olduğunu ve bunların % 58'i için ile ilgili Badnavirus. Virüs contigs, % 29 yaşına geldiğinde son derece benzer (e < 1 x 10-30)'e CaYMV izole V17 ORF3 gen (EF189148.1), şeker kamışı bacilliform virüs izole Batavia D, komple genom (FJ439817.1), ve muz çizgi CA virüs genomu (tamamlamak KJ013511). Bu nüfus içinde iki tam uzunlukta genleri andıran uzun contigs vardı.
Yüksek üretilen iş RNA-seq üretilen 153,488 temizlenmiş bireysel sıra okuma okuma < 500 bp. dokunma derleme uzunluğu ortalama ile bu 8,243 contigs için azaltılmış. Bunlar NCBI-BLASTn için sunuldu (Viridplantae TaxID kullanarak: 33090 ve virüs TaxID: 10239 sınırlayıcı organizmalar olarak) contigs % 76'bitki hücre dizileri, % 23 kategoride yer çıkışlarını bilinmeyen ve % 0.1 virüs contigs () kategorize Resim 2 B). virüs contigs % 0.1 nüfusunun nüfusun daha yakından incelendiğinde belirlenen bunlar % 68'i Caulimoviridae için (Şekil 2B) ayrıldı. Bu nüfus içinde üç büyük contigs yüksek benzerliği ile tespit edildi (e < 1 X 10-30) CaYMV ayrı tut moduyla V17 ORF3 gen için (EF189148.1), şeker kamışı bacilliform virüs izole Batavia D, komple genom (FJ439817.1) ve muz çizgi CA virüs komple genom (KJ013511). Üç contigs incelenmesi, biz el ile bu bir tam uzunlukta virüs genomu üretmek için iki katıldı.
Biz iki tam uzunlukta virüs genleri varlığını doğrulamak için karşılıklı bir iskele olarak DNA ve RNA sıralama tarafından üretilen virüs genomu uzunluğu contigs göre. 6,966 bir tam uzunlukta virüs genomu bp Canna sarı mottle ilişkili virüs 1 (CaYMAV-1) (Şekil 3A) geçici olarak seçildi. İkinci genom 7,385 yapıldı bp ve Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) (Şekil 3A) hastalık CaYMV bir türevi.
Son olarak, her virüs klon ~ 1000 bp parçası için tasarlanmış PCR astar differentially nüfusu 9 ticari türü temsil eden 227 canna bitkiler her iki genleri tespit etmek için kullanılmıştır. Birçok durumda bireysel bitkiler ile her iki virüs bulaşmış. Biz 12 bitkilerde CaYMAV-1 ve CaYMV-Ap01 RT-PCR tespiti için bir örnek sağlar. Bunlardan üçüydü sadece CaYMV-Ap01 için olumlu ve dokuz her iki virüs (Şekil 3B) olumlu idi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig1.jpg"> Resim 1 : Virüs nükleik asit ürünleri ve NGS iş akışı. (A)özel (% 1.0) Jel Elektroforez, 565 bp PCR parçacıkları CaYMV genleri. İki PCR ürünleri Beyaz Pelet (şerit 1, 2) hazırlanan örnekleri ama yeşil Pelet örnek (lane 3) tespit edildi. Pozitif kontrol (+) virüslü bitki standart paramagnetic selüloz parçacıkları içeren otomatik bir yöntem kullanarak izole DNA güçlendirilmiş bir PCR ürünü temsil eder. Lane L örnek yolları doğrusal DNA bantlarında boyutunu ölçmek için standart olarak kullanılan DNA merdiven içerir. (B) örneği virüs parçacık transmisyon elektron mikroskobu içinde virüslü canna yaprakları ham ayırma tarafından kurtarılan beyaz pelet tarafından görüldü. (C) özel (% 0.8) yeşil (lane 1) kurtarılan DNA'ın Elektroforez jel ve beyaz (lane 2) A. panelinde o test pozitif-PCR tarafından granül Lane 2 yanındaki kırmızı ve sarı nokta beyaz kesir ortaya iki yüksek molekül ağırlıklı DNA grup tanımlayın. (D) özel (% 1) jel elektroforez toplam RNA sütunlara göre RNA arıtma tarafından kurtarıldı. Lane L örnek Lanes doğrusal bantları boyutunu ölçmek için standart olarak kullanılan DNA merdiven içerir. Lane 1-6 dan havuza alınmış ribo tükenmesi ve nükleik asit izolasyonları, Kütüphane hazırlık, sıralama, dokunma derleme ve virüs genomu RNA-devamı (E) şematik boru hattı için tek bir örnek için virüslü canna yaprakları izole RNA içerir bir keşif. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig2.jpg"> Resim 2 : Contigs taksonomik kategorilerini görselleştirme Kronu grafikler. (A) grafik üzerinde bereket ve contigs taksonomik dağıtımı ham virüs hazırlık monte sol gösterir. Doğru grafik Caulimoviridae Aile, Badnavirus cins ve üç yakından ilişkili tür ile ilişkili virüs contigs oranlarını gösteriyor. (B) sol panelde RNA-seq türetilmiş contigs bolluk taksonomik dağılımı üzerinde merkezli gösterir. Sağ tarafta contigs Caulimoviridae Aile, Badnavirus cins ve üç yakından ilişkili tür ile ilişkili virüs contigs nüfusu içinde bolluk gösteren grafiktir. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig3.jpg"> Şekil 3 . CaYMAV-1 ve CaYMV-Ap01 genleri karakterizasyonu. Canna sarı mottle ilişkilendirmek virüs 1 (CaYMAV) ve Canna sarı mottle virüs --dan izole genom benzer grafiksel gösterimi(a) Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01). Nükleotit konumları 1-10 genom başlangıç olarak tanımlanır ve bir tRNAtanışmadan antikodon sitesi en badnavirus genleri tipik içerir. Açık okuma çerçevesi (ORF) 1 ve 2 çeviri için durdurma ve başlangıç pozisyonları bitişiktir. Bu proteinler bilinmeyen var işlevleri. ORF3 çinko parmak (ZnF), proteaz (Pro), ters transkriptaz (RT) ve RNAse H etki alanlarını içeren bir polyprotein var. 3' Poli(a) sinyal sıra her iki virüs genleri için korunmuş. (B) RT-PCR analiz virüs bulaşmış yaprakları ve CaYMAV ve CaYMV-Ap01 tespit astar izole RNA kullanılarak gerçekleştirildi. Kalan enfekte ise CaYMAV ve CaYMV-Ap01 ile 12 bitkiler aynı topluluk içinde CaYMV-Ap01 ile üç sadece, bulaşmış. (+) pozitif kontrol gösterir ve (-) negatif kontrol gösterir. Bu rakam çoğaltılamaz/değiştirilmiş Wijayasekara vd. 24 iznine sahip. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes at JoVE.com

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

Ham Virion ayıklama DNA analizi yeni virüs genleri keşfetmek için virüslü yaprakları gelen RNA analizi ile birleştirerek

Burada iki iplikçikli DNA genleri ile bitki virüsleri tanımlamak için yeni bir yaklaşım mevcut. DNA ve RNA virüslü yaprakları ayıklamak ve yeni nesil sıralama dışarı taşımak için standart yöntemleri kullanın. Bioinformatic araçları dizileri contigs monte, virüs genleri temsil eden contigs tanımlamak ve genleri taksonomik gruplara atamak.

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

combining-analysis-dna-crude-virion-extraction-with-analysis-rna-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.9K Görüntüleme.  Texas A&M Agrilife Center at Dallas. Burada iki iplikçikli DNA genleri ile bitki virüsleri tanımlamak için yeni bir yaklaşım mevcut. DNA ve RNA virüslü yaprakları ayıklamak ve yeni nesil sıralama dışarı taşımak için standart yöntemleri kullanın. Bioinformatic araçları dizileri contigs monte, virüs genleri temsil eden contigs tanımlamak ve genleri taksonomik gruplara atamak.

Video: Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Nucleocapsids gelen Viral DNA hazırlanması

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal phase during establishment of infection in a given host. Consequently, study of encapsidation deciphers the information regarding the know-how of the mechanism regulating virus assembly to form infectious virions. Such information is vital in formulating novel methods of curbing virus spread and disease control. Virus encapsidation can be studied in vivo and in vitro. Genome encapsidation in vivo is a highly regulated selective process involving macromolecular interactions and subcellular compartmentalization. Therefore, study leading to dissect events encompassing virus encapsidation in vivo would provide basic knowledge to understand how viruses proliferate and assemble. Recently in vitro encapsidation has been exploited for the research in the area of biomedical imaging and therapeutic applications. Non-enveloped plant viruses stand far ahead in the venture of in vitro encapsidation of the negatively charged foreign material. Brome mosaic virus (BMV), a non-enveloped multicomponent RNA virus pathogenic to plants, has been used as a model system for studying genome packaging in vivo and in vitro. For encapsidation assays in Nicotiana benthamiana plants, Agrobacterium -mediated transient expression, refer to as agroinfiltration, is an efficient and robust technique for the synchronized delivery and expression of multiple components to the same cell. In this approach, a suspension of Agrobacterium tumefaciens cells carrying binary plasmid vectors carrying cDNAs of desiredviral mRNAs is infiltrated into the intercellular space withina leaf using nothing more sophisticated than a 1 ml disposable syringe (without needle). This process results in the transfer of DNA insert into plant cells; the T-DNA insert remains transiently in the nucleus and is then transcribed by the host polymerase II, leading to the transient expression. The resulting mRNA transcript (capped and polyadenylated) is then exported to the cytoplasm for translation. After approximately 24 to 48 hours of incubation,sections of infiltrated leaves can be sampled for microscopyor biochemical analyses. Agroinfiltration permits large numbers (hundreds to thousands) of cells to be transfected simultaneously. For in vitro encapsidation, purified virions of BMV are dissociated into capsid protein by dialyzing against dissociation buffer containing calcium chloride followed by removal of RNA and un-dissociated virions by centrifugation. Genome depleted capsid protein subunits are then reassembled with desired viral genome components or non-viral components such as indocyanine dye.

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

A simple, efficient and robust way to synchronize the delivery of multiple viral components to plant cells via Agrobacterium-mediated transient expression is described. This approach is amenable for studying replication, encapsidation followed by in vitro reassembly of non-viral components into genome depleted optical viral ghosts suitable for biomedical applications.

Basit ve Sağlam In vivo Ve In vitro</emVirüs Meclisi Öğrenmenin> Yaklaşım

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

&#39;Tek Virüs Genomik&#39; kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 1 of 3.

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Biyoloji

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 2 of 3.

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Part 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 3 describes the process of fluorescently labeling the amplified RNA from both host and viral samples by amino allyl coupling of dyes. Part 3 of 3.

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 3

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

Teşhis edilmesi için kullanılan ilişkili Viral ve hücresel proteinler Viral DNA'ın arıtma

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from clinical and biological sources. The method is unbiased and universal; it uses random primers for cDNA synthesis and requires no prior knowledge of the viral sequence content. Before library construction, selective RNase H-based digestion is used to deplete unwanted RNA &#8212; including poly(rA) carrier and ribosomal RNA &#8212; from the viral RNA sample. Selective depletion improves both the data quality and the number of unique reads in viral RNA sequencing libraries. Moreover, a transposase-based &#39;tagmentation&#39; step is used in the protocol as it reduces overall library construction time. The protocol has enabled rapid deep sequencing of over 600 Lassa and Ebola virus samples-including collections from both blood and tissue isolates-and is broadly applicable to other microbial genomics studies.

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

Klinik Örneklerden RNA Virüs tarafsız Derin Sıralama

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

Tıp

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

Viral enfeksiyon ve analiz Drosophila Melanogaster ana bilgisayar virüs etkileşimin kurulması

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Ham Virion ayıklama DNA analizi yeni virüs genleri keşfetmek için virüslü yaprakları gelen RNA analizi ile birleştirerek

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Nucleocapsids gelen Viral DNA hazırlanması

Basit ve Sağlam In vivo Ve In vitro Yaklaşım

'Tek Virüs Genomik' kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu & Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 1

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu & Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Part 2

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu & Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 3

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Teşhis edilmesi için kullanılan ilişkili Viral ve hücresel proteinler Viral DNA'ın arıtma

Klinik Örneklerden RNA Virüs tarafsız Derin Sıralama

Viral enfeksiyon ve analiz Drosophila Melanogaster ana bilgisayar virüs etkileşimin kurulması