Changhui Pak ve Alysia Vrailas Mortimer başlangıçta beyin diseksiyonu tekniği SMK verdiğiniz için teşekkür etmek istiyorum. Biz de Ken Moberg'ın laboratuar grubunun üyeleri, özellikle Chris mermi, eleştirel yazının okumak için teşekkür ederiz. Fas2 tanıma antikorlar (1 d 4) ve chaoptin (24B10) gelişim çalışmaları Hibridoma bankadan elde. Antikor 24B10 Seymour Benzer ve Nansi Colley24tarafından,60,61DSHB için yatırılır, antikor 1 d 4 için DSHB Corey Goodman 22,23,56tarafından yatırılır. Sinek stokları Bloomington hisse senedi merkezden elde edilmiştir. Ayrıca Ohio tarımsal araştırma ve Geliştirme Merkezi (OARDC) MCIC görüntüleme Merkezi confocal mikroskop kullanımı için şekil 4A beyinlerinde görüntü için teşekkür etmek istiyorum ve B. SMK NICHD hibe tarafından desteklenmektedir (1 R15 HD084241-01A1).

1. drosophila melanogaster genetik ve isteğe bağlı ısı şok yordamlar
<ol><li>Bir kez sinekler geçti ve F1 döl yumurtadan, kadın ve/veya uygun genotip erkek elde edilir. Soruşturma altında beyin bölgesi bağlı olarak sinekler her gün toplanması ve böylece beyin bağlantısı yaş bağımlı ve/veya cinsel şekilli desen daha kolay ayırt edilebilir seks tarafından ayrılmış. 
	Not: İsteğe bağlı: sinekler bir Repressible hücre işaretçisi (MARCM) analizi 12 , 47, embriyo, larvaları ile mozaik analiz için kullanılmaktadır, ya da pupa ısı 30-45 dk 37 ° C'de şok olmalı Mitotik rekombinasyon neden. MARCM analiz için mantar organlarının belirli bölgeleri hedeflemek için şekil 5 ' te B ana hatlarıyla ve 12 tarafından belirlenen zamanlamaya göre ısı şok zaman. MARCM beyin bölgeleri mantar organları dışında araştırmak için kullanılıyorsa, pilot deneyler ısı şok olmak en iyi sahne belirlemek için yapılmalıdır. Belgili tanımlık merdiven aşağı konuda yazılmış olsa da eclosed uçar, pharate yetişkin de disseke pupa durum kaldırıldıktan sonra aşağıdaki adımları kullanarak.</li>
</ol> 2. Diseksiyon istasyonu hazırlık <ol><li>stereomicroscope ve ışık kaynağı ile konum bağlı fiber optik goosenecks üzerinde büyük bir benchtop. Sürekli el hareketleri teşvik etmek ve azaltmak el &#34; sallamak &#34; diseksiyon sırasında yeterli el ve kol dinlenme alanı mevcuttur mikroskop için önemlidir. Mikroskop ve 4-6 inç mikroskop Bankası tezgah kenarı arasındaki iki tarafında yaklaşık 8-10 inç olduğundan emin olun.</li>
	Bir cam <li>dolgu 2 veya 3 Kuyu PTN arabelleği 1.0 mL ile 9-şey veya 3-iyi yemek (0.1 M sodyum fosfat tampon pH 7.2, % 0,1 Nonyonik yüzey aktif, tam arabellek bileşenleri için malzemeler tabloya bakınız) ve yer yanında bulunuyor parçalanmış buz üzerinde. Yeni disseke beyin bu yemek için transfer ve fiksasyon adım kadar saklı.
	<ol><li>Not: canlı görüntüleme gerekiyorsa, diseksiyon arabellek fosfat tamponlu tuz (PBS) veya HL3 arabellek 48 x 1 olmalıdır. İntraselüler protein yerelleştirme gerekiyorsa, PBS de alternatif bir tampon olarak diseksiyon ve fiksasyon için kullanılabilir. Fiksasyon, hücre zarları permeabilization sonra gerçekleştirilmesi PTN yıkar %0,1 veya % 0,3 Noniyonik deterjan içeren kullanarak.</li>
		<li>PBS diseksiyonu ve fiksasyon için kullandıysanız, pipet ipuçları deterjan içeren bir arabellek (örneğin PTN) ile durulanır en az bir kez beyin microcentrifuge tüpler transfer sırasında plastik pipet ipuçları yapışmasını önlemek için olmalıdır.</li>
	</ol></li> <li>Bir boş 35 mm cam veya plastik petri dish, kullanarak oluşturmak bir silikon elastomer içeren bir diseksiyon yemek. Kısaca, üretici göre elastomer bileşenleri karıştırmak &#39; s yön, 35 mm yemeklerin dökün ve bir gecede düz bir yüzeye polimerize sağlar. Diseksiyon yemekleri içeren elastomer forseps forseps ve bir cam tabak gibi sert bir yüzeye arasında iletişim yapılırsa hangi kolayca hasar görebilir, anatomi iyi ipuçları korumak için kullanılır. Biz de düzenli olarak online perakendecilerin ticari olarak mevcut silikon kaplı yemekleri satın alma. Inaktif kömür (ve böylece renkli siyah) içeren silikon elastomer diseksiyon yemekleri kontrast diseksiyonu sırasında artırmak için özellikle yararlı.</li>
</ol> 3. Yetişkin beyin diseksiyon yordam <ol><li>Anesthetize 3-5 gün eski yetişkin D. melanogaster CO 2 ile veya kullanarak buz. Buz kullanılıyorsa, sinekler baş aşağı içeren flakon (Tak son aşağı) içine buz kovası ~ 5 dk. şişe buz baş aşağı koyarak engeller yer gıda teslim olma uçar. Bir kez sinekler anestezi, sinekler üzerinde bir soğuk metal yüzey veya petri kabına oturan buz veya sinek pad yayan bir CO 2 yerleştirin. Eğer ateş analiz etmek için beyni anatomi, büyük sinekler de kullanılabilir.</li>
	<li>PTN oluşturmak için bir transfer pipet veya p200 pipet kullanarak diseksiyon çanak merkezinde, küçük bir miktar (150-200 µL) yer bir &#34; kabarcık &#34; PTN in. Stereomicroscope altında diseksiyon tabak yerleştirin ve aydınlatma ayarlayın ve böylece PTN balonu görüş alanı doldurur ve düzgün aydınlatılmış odaklanmak.</li>
	<li>Böylece onlar işlemek sinekler &#34; kadar göbek &#34; (Yani, ventral tarafı yukarı) metal veya CO 2 yastık üzerinde yatarken.</li>
	<li>Kullanarak bir çift #5 forseps, kavramak disseke ve anında tutun tutmak tamamen bu PTN diseksiyon çanak üzerinde daldırın için bir sinek karın. 
	Not: baş PTN içinde sular altında iken protokol geri kalanı için tüm adımlar gerçekleştirilmelidir.</li>
	<li>#5 forseps ikinci bir çifti kullanarak, sinek hortum Bankası kavrayın ve forseps ayrı vücuttan sinek kafa ayırmak için iki çift çekin. Karın ve göğüs atmak. Bu adım sırasında bu kafa değil serbest bırakmak ve PTN yüzeyinde gezmek için izin önemlidir. Bir kez başından yüzen, yine beyin ezme olmadan kavramak zor olabilir. 
	Not: Bu yöntemi kullanarak, beyin ve ventral sinir kablosu arasındaki bağlantıları kopmuş. MSS bu bölgeler arasındaki sağlam bağlantıları gerekliyse, 49 , 50 gibi bir alternatif diseksiyon protokolü takip edilmelidir. Baş kaldırılmadan önce hortum sinek baştan çıkarır, hortum neredeydi bir delik olacak. Bu durumda, bir eye yakınındaki deliğin kenarında sinek kafa kavramak. Sonra başından forseps dışında bir başka iki çift kablolarıylaberaber orta miktarda güç kullanarak kaldırın. Bazen, kafa vücuttan çıkarıldığı zaman, gut ve/veya ventral sinir kordonu kalır kafasına bağlı ve diseksiyon devam etmeden önce kaldırılması gerektiğini.</li>
	Forseps bir çift hortum kavrıyor ise <li>, ikinci çift şu sinek göz medial kenarı kavramak gerekir. Yavaş yavaş, bir başka dışında forseps çek. Bu adımı sabit yanal kuvvet küçük bir miktar ile yapılmalıdır. Forseps yavaş yavaş dışında bir başka hareket ettirdiğinizde, hortum uzak kafanı çıkar ve merkezi bir delik kafa kütikül oluşturmanız gerekir. İkinci Çift sağ gözünden medial kısmı bırakmadan forseps ilk çifti ile hortum atın. 
	Not: Yetişkin D. melanogaster beynidir Kaudal (Yani, arka/arka) bölgesinin sinek. Böylece, o bölgesinin açgözlü kaçınılmalıdır. İdeal olarak, yalnızca rostral (Yani, açık) medial retina yakınındaki baş kısmını doğrudan kavradı tarafından forseps. Beyin ve ilişkili Trakea artık manikür orta delikten görünür olmalıdır. Şu anda, delikten nefes borusu çıkıntılı herhangi bir beyaz kılçıklı konu kaldırıldı ve atılan.</li>
	<li>(Baş kütikül Merkez delik kenarındaki) sol retina medial kenarı forseps ikinci çifti ile kavramak. Retina ve ilişkili kütikül kaldırmak için yavaş yavaş birbirlerine uzak forseps 180 ° açıyla çekin. Retina temel optik LOB ayrışıp gibi gerilim hafif bir düşüş hissetmeniz gerekir. Yavaş yavaş optik LOB yırtılma önlemek için devam. 
	Not: forseps, çok hızlı bir şekilde bu adımı sırasında ayıran th yırtılma sonuçlanabilire optik LOB veya kesintileri mantar vücut yapıları. Zaman zaman, manikür kaldırılacak ancak retina adet optik LOB bağlı kalır. Mantar cesetleri Imaging, tüm retina kaldırmak gerekli değildir. Ancak, diğer beyin bölgeleri (gibi retina nöron innervasyon optik beyin LOB) analizini 48 , 51 tarafından açıklandığı gibi tamamen kaldırılacak retina gerektirebilir. 
	Not: retina yavaş yavaş beynin temel optik LOB ayrılır, optik LOB observable beyaz, kılçıklı trake ile kaplı bir opak beyaz yapısı olarak olmalıdır. Bir retina kaldırıldıktan sonra göz ardı. Kılavuz retina nöronların analiz ederken, belirli bu adımı sırasında optik lobe hasarı önlemek için özen gösterilmelidir. Ek bir protokol diseksiyon üzerinde duruldu ve canlı görüntüleme photoreceptor nöron da kullanılabilir 48.</li>
	<li>Şimdi, dikkatli bir şekilde mümkün olduğunca görünür Trakea daha fazla çıkarın. Trakea zaten içeriyor veya daha sonra hava, float ve büyük olasılıkla, daha sonra immunostaining adımları sırasında kayıp beyin neden ile doldurun. Trakea kaldırmak için #5 forseps çok keskin bir çift kullanarak beyin off al.</li>
	<li>Kalan retina ve çevresindeki kütikül sol sinek retina medial bölge kavramak için her iki çift forseps kullanarak kaldırın. Dikkatle retina retina ve kütikül parçalarını kaldırmak için ikiye gözyaşı. Bazı durumlarda, özellikle zorlu beyin ezme olmadan kalan kütikül kaldırma kanıtlıyor. Bu gibi durumlarda, forseps diğer çifti dikkatle manikür sonunu kaldırmak için kullanıldığı gibi ventral sinir kordonu kalan ipliklerini yerine forseps bir çift tarafından anlaşılacak bulduk.</li>
	<li>P200 pipet hareket ettirmek istimal disseke beyin PTN içeren 9 - veya 3-da yemek bir şey için. Aynı genotip beyinlerinin de aynı birlikte havuza alınmış ve buz tuttu. Beyin dokusu diseksiyon bir saat içinde sabit olmalıdır. Beyni küçük gruplar halinde sabit ve beyin daha çok sayıda gerekliyse havuza alınmış. Birçok durumda, deneyimli bir araştırmacı genellikle bir beynini incelememize ve cam koleksiyonu çanak yaklaşık 3-5 dak transfer</li>
</ol> 4. Fiksasyon ve immünfloresan boyama prosedürü <ol><li>p200 pipet kullanarak, disseke beyin PTN içinde seyreltilmiş %4 paraformaldehyde 0.5 mL ile dolu bir 0.5 mL microcentrifuge Tube 9-iyi yemek transfer. Aynı genotip beyinlerinin en az 10-15 bir microcentrifuge tüp içine birleştirilebilir. 0.5 ml microcentrifuge tüplerde (kadar beyin slaytlar üzerine montajı) tüm kalan adımları tamamlanır. 
	Dikkat: Paraformaldehyde (PFA) bir duman mahallede ele alınmalıdır. İngiltere'de yılın atık kaydedilir ve düzgün pislikleri atmak için kullanmamıştım. cam ampul içinde satın alınan % 20 paraformaldehyde microcentrifuge tüpler içine bölünmemeli ve saklı-20 ° c kadar gerekli olabilir.</li>
	<li>Bir duman başlık içinde oda sıcaklığında sallanan yavaş hızı ile %4 paraformaldehyde 20 dk için beyinlerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Fiksasyon beyin yerçekimi tarafından microcentrifuge tüp altına yerleşmek izin. 
	Not: Bazen, beyin microcentrifuge tüp tarafına yapışabilir. Bu durum ortaya çıkarsa, yanal başparmak ve işaret parmağı arasında tüp döndürmek veya tüp beyni batan tanıtmak için tezgah üzerinde hafifçe dokunun genellikle yardımcı olur.</li>
	<li>Kaldır sabitleştirici bir p1000 kullanarak pipet ve iki gerçekleştirmek &#34; hızlı &#34; yıkar 500 µL PTN, beyin yıkama arasında microcentrifuge tüp altına yerleşmek izin ile. Tüm beyin tarafından yerçekimi microcentrifuge tüp altına yerleşmiş bir kez bu hızlı yıkama sırasında PTN hemen taze arabelleği için değiştirilebilir; hiçbir ek yıkama zamanı gereklidir. 
	Not: Genellikle, tüpe ilave arabellek bırakarak beyin kaldırma riske için tercih edilir. Pipet ucu dikkatli muayene genellikle beyinsiz tüp sizden yanlışlıkla kaldırılmıştır emin olmak için gereklidir. Beyin belgili tanımlık uç pipetted kaza olması gerekir, onları geri microcentrifuge tüpüne dağıtmak, yerleşmeye beynim bekleyin ve kalır herhangi bir ilave PTN kaldırmaya devam.</li>
	<li>Son hızlı yıkama sonra üç gerçekleştirmek için p1000 pipet kullanın &#34; uzun &#34; yıkar: bir rock'çı / nutator üzerinde oda sıcaklığında PTN ve yıkama 20 dk için 500 µL ekleyin. Gelecekteki tüm &#34; uzun &#34; yıkar 20 dakika için olmalıdır. 
	Not: Bu yıkar, beyin sabit takip gecede PTN 4 ° C'de depolanmış olabilir.</li>
	<li>P1000 pipet kullanarak son yıkama kaldırmak ve kuluçkaya beyin bir rocker veya nutator, oda sıcaklığında en az 30 dakika oda sıcaklığında için çözüm [PTN + % 5 normal keçi serum (NGS)] engelleme 0.5 ml.
	<ol><li>Keçi ikincil antikorlar sonraki Protokolü adımda kullanılacak. Başka bir tür ikincil antikorlar kullanılacaksa bu tür (yerine NGS) normal serum engelleme ve antikor çözümlerinde kullanılmalıdır.</li>
	</ol></li> <li>P1000 pipet kullanarak, engelleme çözüm kaldırın ve PTN (PTN + %5 NGS + seyreltilmiş birincil antikor) seyreltilmiş birincil antikor ekleyin. Birincil bir antikor ilk kez kullanırken, bu antikor en uygun seyreltme ampirik olarak tespit edilmelidir. 
	Not: mantar vücut nöronlar görüntülenmesi için Fas2 tanıma antikorlar genellikle kullanılır. Bu antikorlar antikor 1 d 4 gelişim çalışmaları Hibridoma banka (DSHB) üzerinden kullanılabilir ve sulandırılmış 1:20 PTN + % 5 olmalıdır NGS. 
	Not: photoreceptor nöronlar görüntülenmesi için chaoptin tanıma antikorlar genellikle kullanılır. Chaoptin antikor DSHB antikor 24B10 olarak kullanılabilir ve sulandırılmış 1:20 PTN + % 5 olmalıdır NGS. 
	Not: Fiksasyon işlemi genellikle floresan yeşil flüoresan protein (GFP) gibi floresan protein üzerinden ortadan kaldırır. Bu nedenle, MARCM aksonal rehberlik bireysel MB nöronların analiz etmek için kullanırken, GFP tanıma bir antikor kullanın.</li>
	<li>2-3 gece 4 birincil antikor çözüm üzerinde bir rocker/nutator beyinlerinde kuluçkaya ° C.</li>
	<li>Beyin microcentrifuge tüp altına yerleşmek ve birincil antikor çözümü kaldırmak birincil antikorlar ile kuluçka izin.</li>
	<li>P1000 pipet kullanarak yerine 2 &#34; hızlı &#34; yıkama ve 3 &#34; uzun &#34; 20 dk adımları 4.4 ve 4.5 yukarıda açıklandığı gibi PTN 0.5 mL ile yıkar, dikkatli bir şekilde izin microcentrifuge tüp her yıkama arasında altına yerçekimi tarafından yerleşmek beyin</li>
	<li>Incubate beyin fluorescently etiketli uygun ikincil antikorlar ile oda sıcaklığında 3 h için. İkincil antikorlar genellikle seyreltilmiş 0.5 mL PTN + % 5, 1: 200 bir konsantrasyon NGS. 
	Not: floresan ikincil antikorlar ekledikten sonra beyin deneme geri kalanı için karanlıkta tutulmalıdır. 
	Not: benzer uyarma/emisyon dalga boylarında GFP sahip bir fluorophore ile etiketli bir ikincil antikor kullanmak için tavsiye MARCM çözümleme işlemi sırasında büyük kalıntı GFP Floresans kalır içinde (örneğin, Fluoroscein isothyocyanate (FITC) veya Alexa488).</li>
	<li>İkincil antikor kuluçka, takip izin microcentrifuge tüp altına yerleşmek ve ikincil antikor çözümü kaldırmak beyin.</li>
	<li>Gerçekleştirmek 2 &#34; hızlı &#34; yıkama ve 3 &#34; uzun &#34; 20 dk adımları 4.4 ve 4.5 yukarıda açıklandığı gibi PTN 0.5 mL ile yıkar, dikkatli bir şekilde izin microcentrifuge tüp her yıkama arasında alt yerleşmek beyin</li>
	<li>Üçüncü takip &#34; uzun &#34; 20 dk yıkama, kullanım mümkün olduğunca fazla arabellek kaldırmak için p200 pipet.</li>
	<li>Ekleyin 75 µL floresan Anti-fade in montaj orta beyin ve. Pipet beyin ve montaj orta içine karıştırmak için bir kez pipet ucu. Beyin kap veya microcentrifuge tüp kısımlarına sıkışmış beri tüp ters değil. 
	Not: süspansiyon montaj orta beyin, tüpler olabilir fluorophore Şoklama yavaşlatmak için alüminyum folyo sarılı ve gecede 4 ° C'de depolanan. Gerekli, beyin birkaç gün 4 ° C'de depolanan Eğer, ama ideal olarak en kısa zamanda slaytlar monte edilmelidir.</li>
</ol> 5. Yetişkin D. melanogaster beyin mikroskop slaytlar ve görüntüleme üzerine montaj <ol><li>Yapı bir &#34; Köprüsü &#34; slayt. İki pozisyon &#34; temel &#34; coverslips yaklaşık 1 cm pozitif yüklü bir slayt üzerinde ayrı. Slaydın pozitif yüklü yan bakan emin olun. Coverslips tırnak Lehçe içeren şekil 3 ' te A gösterilen uygun. Ortam takma altında bu temel kapak paket fişi fitil değil emin olmak için tırnak Lehçe ile temel her kapak notu üç dış kenarlarını mühür genellikle yararlıdır. Tırnak Lehçe tamamen kuru izin (10-15 dk) devam etmeden önce.</li>
	<li>Stereomicroscope altında slayt yerleştirin ve iki coverslips arasındaki boşluğa disseke beyin içeren montaj medya çözüm pipette. Daha fazla karşıtlık sağlamak için böylece tezgah üstü paralel boynu ışıklar manevra yararlıdır.</li>
	<li>Beyin slaydın dışına pipette değil dikkatli ekstra bir pipet kullanarak slayttan ortam takma kaldır.</li>
	<li>Fitil uzakta ilave montaj medya. Bu beyin daha doğrusu sonraki adımı sırasında konumlandırılmış olması izin verir.</li>
	<li>Forseps ve stereomicroscope bir çift kullanarak beyin antennal loblar yukarıya bakan ile ızgara desen slaytta getirin</li>
	<li>Yer bir kapak kayma (&#34; Köprüsü &#34;) beyin ( şekil 3 A) bitti. Nerede onlar iletişim köprüsü kapak notu kenarlarında imzalamaya tırnak Lehçe kullanmak &#34; temel &#34; kapak notları.</li>
	<li>P200 pipet kullanarak yavaş yavaş taze montaj medya ( şekil 3 B) ile köprü altında Merkezi boşluğu doldurmak. Merkezi coverslip açık kenarında bir seferde bir damla yerleştirin ve montaj medya merkezi Köprüsü coverslip altında fitil sağlar. Ortam, takma ile tüm boşluğu doldurulana kadar devam sonra mühür üst ve alt açık tırnak boyasıyla.</li>
	<li>Kez tırnak Lehçe kuru, slaytları hemen görüntü veya mağaza lightproof sıkı slayt kutusunda, -20 ° c</li>
	<li>Bir hafta içinde beyni uyarma lazerler ile lazer tarama confocal mikroskop kullanarak görüntü ve filtre küpleri için seçilen ikincil floresan antikor uygun. Z-yığın görüntüleri mantar vücut nöronların genellikle 20 X veya 40 X hedefleri kullanarak elde edilir. Görüntüleme retina photoreceptor nöron daha yüksek büyütme gerektirebilir.</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Yukarıda açıklanan diseksiyon ve görselleştirme yöntemi immunostaining çok çeşitli olarak kullanılabilir ve düşsel kullanma yaşamak. Biz bir genel immunostaining protokol belirttiğimiz ve MARCM içinde bireysel mantar vücut nöronların aksonal Morfoloji görselleştirmek için kullanılabilir bir yol çizer. Ayrıca, bu genel yordamları da diğer beyin bölgeleri sabit içinde görüntüleme için kullanılabilir veya taze disseke yetişkin48,65beyin. Canlı görüntüleme ifade desenleri artırıcı tuzakları, muhabir gen veya mimik çizgileri66, örneğin analiz ederken daha verimli bir yaklaşım sağlar. Önlemek için hücre ölümü GFP sabitlenmemiş dokusunda canlı görüntüleme sırasında yapılardan yakalama, beyin gereken 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) veya HL3 medya48x disseke, köprü slaytlar 1 x PBS (veya HL3) üzerine monte ve daha az 15-20 dk. bakım görüntüsü Ayrıca GFP Floresans görselleştirme ile etkileyebilir beri--dan disseke beyin görüntüleme önce mümkün olduğu kadar Trakea kaldırmak için alınmalıdır.
Mantar beden ve photoreceptor nöronlar morfolojisi değerlendirmek için boyama koşulları nispeten iyi kurulmuş24,61,67, bu hücredeki ilgi belirli bir protein lokalizasyonu iken türleri kapsamlı sorun giderme ve en iyi duruma getirme gerektirebilir. Özellikle, antikor seyreltme, engelleme arabelleği bileşeni konsantrasyon ve fiksasyon, dahil olmak üzere birkaç önemli adımlar en tekrarlanabilir ve güvenilir sonuçlar üretmek için optimize edilmelidir. İlk olarak, birincil antikor en yüksek konsantrasyonu tespit edilmelidir. Piyasada bulunan antikorlar genellikle önerilen bir seyreltme (ve genellikle başlangıçta bu konsantrasyon kullanarak başlatın rağmen), bu değerler nadiren Drosophila dokular üzerinde ampirik olarak belirlenir. Bu nedenle, aralığın üstündeki ve altındaki üreticinin başlangıç öneri kez daha özel boyama sonuçları birincil antikor dilutions bir dizi test. Birincil antikor seyreltme doğruluk boyama üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir ve tam olarak belirlenir, birincil antikor içeren zaman beyin inkübe çözümler genel sonuç küçük etkisi ile önemli ölçüde değişebilir. Kuluçka beyin Fas2 antikor birincil antikor ile iki, üç, hatta dört gün 4 ° C'de disseke zaman örneğin, benzer sonuçlar gözlemledim Her ne kadar en az iki gece tavsiye, ayrıca tek bir geceliğine birincil antikor çözüm beyinlerinde inkübe ve tekrarlanabilir boyama elde. Önemlisi, beyin içinde oda sıcaklığında (ya da bir gece 4 ° C'de) 3 h ikincil antikor inkübe saat miktarını sınırlayarak sınırı non-spesifik bağlama ikincil antikorların beyin dokusu ile yardımcı olur.
İkinci olarak, istenmeyen arka plan sinyal ortadan kaldırmak için ek "engelleme" reaktifler kullanmak gerekli olabilir. NGS konsantrasyon ~ %10 1-%10 sığır Serum Albumin (BSA) engelleme ve birincil/ikincil antikor çözümleri veya gecede 4 ° C'de Drosophila embriyo (bkz: ile birincil antikorların öncesi adsorpsiyon ekleme, artan seçenekler şunlardır: referans68, Bölüm 2.9, adım 3).
Biz PTN önerilen tampon olarak tüm fiksasyon için yukarıdaki iletişim kuralı'nı yazılı iken, yıkama ve antikor kuluçka adımları, doku fiksasyon (PIP ve Malzemeler tabloPEM gibi) diğer arabelleklerindeki derin farklılıklar neden olabilir sinyal gücü. Örneğin, önceki çalışmalarda siklin E dokuları da PBS içinde seyreltilmiş geleneksel %4 paraformaldehyde sabit olan zaman içinde larva Imaginal yuvarlak yüzey mümkün değildir ama doku PLP arabellekte (Ken Moberg, kişisel tamir ederken açıkça görülmeye başlıyor göstermiştir iletişim ve başvuru69). Arabellekteki değişikliklere ek bileşenleri, doku fiksasyon de önemli ölçüde immünfloresan etkileyebilir için zaman ve sıcaklık değiştirme boyama ve gerekirse ampirik olarak belirlenebilir. Genel olarak, fiksasyon zaman hücresel bileşenleri yeterli polietilenin için izin vermek yeterince uzun olmalıdır ve uzun vadeli olurken genel olarak hücresel Morfoloji bakımından yeterli bitti-çapraz ve "protein epitopları gömme" önlemek için sınırlı. Bu nedenle, başlangıçta yeni alınan bir birincil antikor boyama koşullarını iyileştirirken, genellikle yaklaşık 20 dk fiksasyon zaman sınırı ve genelde doku soğuk sıcaklıklarda ortadan kaldırır.
Birden çok denetimi birincil ve ikincil antikorları özgüllük yanı sıra transgenes/genetik arka plan gözlenen fenotip üzerindeki etkisini araştırmak için herhangi bir ayirt denemede dahil edilmelidir. Özellikle kullanılan birincil antikor protein ilgi tanır olup olmadığını tespit etmek için bu protein ve/veya protein overexpressing doku eksik sinekler dokudan denetimleri dahil edilmelidir. Aşırı saf antijen protein ek birincil antikor sinek beyindeki diğer epitopları tanır olup olmadığını belirlemek için de kullanılabilir. Son olarak, herhangi bir floresan sinyal zaman birincil antikorlar atlanırsa mevcut seçili ikincil antikorlar tarafından non-spesifik bağlama düzeyini temsil eder.
Birkaç önemli denetimleri de genetik arka plan katkısını veya transgenes boyama yoğunluğu veya nöronal Morfoloji varlığı değerlendirmek için dahil edilmelidir. Örneğin, birden çok transgenes şekil 5 MARCM deneyde kullanılan sinekler içerir (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, küvet &#62; GAL80 ve OK107-GAL4), her biri ayrı ayrı mantar vücut Morfoloji üzerindeki etkileri için analiz edilmelidir. Sinekler bir çok az, mantar vücut Morfoloji OK107-GAL4 ve UAS-CD8-GFP içeren analiz edilmelidir. Ayrıca ısı şok etkisini değerlendirmek için gerekli olabilir ve hsFLP ve FRT82B içeren Flp recombinase üretim mantar vücut geliştirme analiz tarafından üzerinde uçar. MARCM olup olmadığını denetler verilen bir protein özerk aksonal rehberlik hakkında önemli fikir sağlamasına karşın, bu sonuç doğru bir şekilde yapmak için gerekli denetimlerin sayısını bu tekniğin küçük bir sınırlama olabilir. Daha az karmaşık deneylerde benzer denetimler de geçerlidir. Örneğin, nerede GAL4/UAS sistemi bütün nöronlar ilgi bir protein devirme ifade için bir RNAi transgene ile birlikte kullanılan bir deneyi ele alalım. Bu deneyde, en az iki transgenes mevcut olacaktır: Elav-GAL4 ve UAS RNAi transgene gibi bir pan-nöronal GAL4 sürücüsü. Her biri bu transgenes yalnız içeren sinekler nöronlarda mantar vücut morfolojisi ek olarak her iki transgenes aynı sinek içinde sinekler nerede liman deneysel durumu araştırılmalıdır.
Son olarak, protein ilgi mantar vücut nöronlarda ifade olup olmadığını belirlemek için bu ortak leke beyin için genellikle Fas2 antikorlar ile gereklidir. Alternatif olarak, floresan proteinler gibi GFP, RFP veya membran CD8-GFP bağlı aynı zamanda GAL4/UAS sistemi kullanılarak ve faiz protein tanıma antikorlar ile birlikte kullanılan ifade edilebilir. Fas2 sadece mantar vücut α ve β loblar formu fasciculated akson tanır, GAL4 dayalı, membran bağlı CD8-GFP kullanımı mantar vücut nöronlar işaretlemek için özellikle yararlı beri.
Kusurları aksonal rehberlikte genellikle % 100 penetrant değildir ve hatta aynı genotip beyinlerinin bazı değişkenlik gösterebilir. Ne zaman yeni analiz mutant gen kusurları için mantar vücut veya photoreceptor bunun içinde oluşturulan, bu nedenle, farklı gen ve yaklaşımların bir arada kullanılan. Literatürde en çalışmaları bir protein aksonal rehberlik kontrol hücre özerk bir rol oynar olup olmadığını araştırmak için birkaç farklı yaklaşım kullanın: Ben) bunun analizini kusurları (tercihen farklı nu kullanarak homozigoz null sineklill allelleri), II) bunun analizini kusurları nöronlar (genellikle üzerinden RNAi), sadece ilgi protein eksik sinek içinde III) kılavuz kusurları ve IV MARCM analizi) kurtarma gene nerede homozigoz null nöronlarda yeniden ifade deneyler uçar. İdeal olarak, genotip başına birkaç düzine beyin nöronal Morfoloji kusurları için analiz edilebilir.
İletişim kuralı öncelikle odaklanır sabit doku içinde proteinlerin immünfloresan yerelleştirme burada açıklanan rağmen bu tekniğin bazı gelecekteki uygulamalar görüntü canlı beyin dokusu ile geliştirilmektedir. Bir kez beyin (genellikle hücre kültür medyada) disseke, onlar sonra birkaç gün 25 ° C'de kültürlü olabilir Bu ex vivo kodlamayla yöntemleri çok çeşitli yaralanma70,71, hücre içi takip axon rejenerasyon teşvik protein aktivite gibi biyolojik süreçleri araştırmak amacıyla geliştirilmekte olan sinyal dynamics72ve nöronal gelişim73.

Drosophila sinir sistemi insanlar ve kemirgenler, karmaşıklığı daha iyi anlamak, omurgalı karşıtları için güçlü ve ulaşılabilir bir modelini sağlayan daha küçük olmasına rağmen. Birçok durumda, omurgalı ve sinekler genleri sinir sistemi gelişimi mekanizmaları dikte çok benzer protein kodlamak. Aslında, birçok gen omurgalılarda nöronal gelişim için de dahil olmak üzere, sinekler orthologs sinyal yollar bu denetim desenlendirme, neurogenesis ve aksonal rehberlik1,2,3 bu işe gerekli ,4,5. Örneğin, netrin bir ligand memeliler ve D. melanogaster6,7,8' aksonal rehberlik için gerekli olur. Netrin ilk olarak embriyonik piliç beyin doku6izole iken, sonraki çalışmalar bu netrin korunmuş bir rol oynar embriyonik merkezi sinir sistemi (MSS) geliştirilmesi sırasında Drosophila8' ortaya çıkardı. Diğer çalışmalar genetik ekranlar embriyonik Drosophila içinde CNS korunmuş ligandlar ve reseptörleri Drosophila ve omurgalıların9bunun için gerekli belirlemek için kullandık.
Embriyonik anında CNS kapsamlı bir şekilde geçmişte ligandlar, reseptörleri ve hücre içi sinyal proteinleri aksonal rehberlik8,9için gerekli belirlemek için kullanılmıştır iken, son iş hangi birçok şekillerde araştırmış Bu proteinler de geliştirme daha sonraki aşamalarında bunun kararları denetler. Özellikle, soruşturma mantar vücut (MB) ve retina photoreceptor nöron geliştirme (şekil 1) mekanizmaları içgörü bu denetimi kılavuz, sinaps oluşumu, akson budama ve çeşitli diğer yönleri nöronal sağlamıştır geliştirme10,11,12,13,14,15,16,17. Photoreceptor nöronlar sinek retina lamina denilen yetişkin beyin bölgelerine bağlanmak ve medulla ve mantar vücut nöronlar ise beyin, (18,19tarafından gözden) görsel bilgi geçişi için kritik vardır Merkezi olarak sinek beyinde bulunan ve öğrenme ve hafıza20,21için gereklidir. Photoreceptor nöronlar ve içsel nöronlar Kenyon hücreleri denilen mantar organlarının Post sinaptik hedefleri bulmak için evrimsel korunmuş diffusible ve ilgili kişi-bağımlı aksonal rehberlik mekanizmaları kullanmaktadır. Yetişkin sinekli görünür olmasının yanı sıra, photoreceptor ve MB nöronlar da doğrudan larva ve pupa antikorlar veya muhabir gen22,23,24,25ile görüntülenmeyecektir. Yetenek kolayca farklı gelişim zaman noktalarda nöronlar bu iki kümesi görselleştirmek için nöronal gelişim birçok yönleri için süper model olarak bunların kullanımı teşvik etmiştir.
Bir model olarak normal sinir sistemi gelişimi mekanizmaları anlamak için kullanılan ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda sinekler de insan hastalıkları, kırılgan X Sendromu (FXS)26 da dahil olmak üzere çok çeşitli doğru modelleri hizmet verebilir göstermiştir , Fikri Engellilik (ID)27,28,29,30,31ve diğerleri32. Örneğin, ZC3H14 moleküler işlevinin çalışması için son zamanlarda insan Fikri Engellilik için bağlantılı bir gen biz sinek manken Nab230denilen anında ZC3H14 ortholog, bir null alleli kullanarak kimliği oluşturdu. Nab2 eksik sinekler ciddi hafıza bozuklukları ve Poli(a) kuyruğu genişletilmiş, ne recapitulating insan hastalarda gözlenen veya hasta hücre hatları33,34türetilmiş. Önemlisi, sinekler Nab2 de eksik onların yetişkin mantar organları34, FXS Sendromu gen FMR135eksik sinekli gözlenen için benzer şiddetli beyin Morfoloji hataları görüntüler. Böylece, sinekler normal beyin gelişimi ve bunu bozmaya hastalıkları eğitim için önemli model organizma hizmet verebilir.
Son olarak, davranışı, genetik araçlar, geniş dizi ile birlikte izlemek için yüksek aktarım yöntemleri erişilebilirlik olun Drosophila bir model organizma gibi karmaşık davranışlar, kontrol beyin bölgeleri tanımlamak için tercih öğrenme ve bellek, uyku, Kur yapma, susuzluk ve diğerleri36,37,38,39. Bir sinek genetikçi'nın "araç kutusu" merkezinde bir özellikle yararlı bir araç (Şekil 2) GAL4/UAS sistemidir. Bu sistem40,41 Gal4 transkripsiyon harekete geçirmek doku belirli ifade genleri veya transgenes aşağı, bir yukarı etkinleştirme sıra (UAS) ifade artırmak için kullanılır. Bu sistemin değişiklikler, örneğin, tam olarak kontrol uyarılabilirlik belirli nöronlar42,43, overexpress veya knock-down belirli genler faiz44, , araştırmacılar izin 45, gerçek zamanlı kalsiyum dynamics in vivo46çözümlemek ve hızlı reporter genler nöronal soy41işaretlemek için. Mitotik rekombinasyon de mozaik analizi ile bir Repressible hücre işaretçisi (MARCM) sistem12,47yaratılması için izin GAL4/UAS sistemiyle birleşimi. MARCM kapsamlı tek nöron izleme aksonal rehberlik12,47için gereken hücresel sinyal bileşenlerini tanımlamak için kullanılmıştır. Bunlar ve diğer teknikleri değerli bakış açısı çok sayıda sinir sistemi işlevi için gerekli hücresel mekanizmaları üzerinde sağlanan rağmen çoğu Drosophila beyin ilk disseke gerekir; dikkatli kaldırma beyin beyin bölgeleri arasında doğru beyin morfoloji ve bağlantı desenleri korumak için gereklidir. Aşağıdaki iletişim kuralı olarak mantar beden ve photoreceptor nöronlar kullanırörnek olarak nöron popülasyonları diseksiyon ile yol gösterir ve immünfloresan yetişkin boyama Drosophila beyin.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microdissection forceps/tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>505-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard dishes</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-50-S-BLK</td>
			<td>Available from amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fas2 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chaoptin Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>24B10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscope Services</td>
			<td>RT15713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>99-910-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-553-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Phosphate Buffer monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na phosphate Buffer dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fingernail polish</td>
			<td>Electron Microscope Services (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica S6D with KL300 LED light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-well dish (spot plate)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutator/rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-152 or 88-861-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-366-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potential Fixation Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTN Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLP buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stocks available from Bloomington</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elav (c155)-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL458</td>
			<td>Pan-neuronal GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*;;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 854</td>
			<td>GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 7362</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64305</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; 201Y-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 4440</td>
			<td>GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64296</td>
			<td>GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub&#62;Gal80/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5145</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL5146</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub&#62;GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44408</td>
			<td>MARCM stock for flipping 3rd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub&#62;GAL80;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL44406</td>
			<td>MARCM stock for flipping 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, hsFLP, tub&#62;GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44407</td>
			<td>MARCM stock for flipping X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5137</td>
			<td>GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 5139</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 28832</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; FRTG13, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5140</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*;; FRT82B, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5135</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains

Sinir sistemi gelişimi çeşitli sinyal yolları ve düzenleyici ağları tarafından koordine olayları sıralı bir dizi içerir. Birçok bu yollar dahil proteinlerin örümceklerle memeliler ve meyve sineği Drosophila melanogasterbenzer organizasyon ilkeleri bunlar geliştirilmesi sırasında bulunduğunu düşündüren, gibi diğer Ökaryotlar arasında korunmuş organizmalar. Önemlisi, Drosophila neurogenesis, farklılaşma, aksonlar rehberlik ve synaptogenesis de dahil olmak üzere memelilerde gereken işlemlerini düzenleyen hücresel ve moleküler mekanizmaları tanımlamak için yaygın olarak kullanılmıştır. Sinekler de başarılı bir şekilde insan nörogelişimsel hastalıkları çeşitli modellemek için kullanılmaktadır. Burada adım adım mikrodiseksiyon, fiksasyon ve yetişkin Drosophila beyin içinde proteinlerin immünfloresan yerelleştirme için bir protokolü açıklar. Bu protokol iki örnek nöron popülasyonları, mantar vücut nöronlar ve retina photoreceptors odaklanır ve bireysel mantar vücut nöronlar Repressible hücre işaretçisi (MARCM) tekniği ile mozaik analizi kullanarak izlemek için isteğe bağlı adımları içerir. Hem vahşi tipi ve mutant beyin örnek verilerden bir puanlama ölçütünü aksonal rehberlik kusurları için kısa bir açıklama ile birlikte gösterilir. Bu iletişim kuralı mantar vücut morfolojisi soruşturma için iki köklü antikorlar vurgular ve photoreceptor nöronlar, diğer Drosophila beyin bölgeleri ve diğer beyin bölgeleri içinde proteinlerin yerelleştirme da olabilir Bu iletişim kuralını kullanan araştırıldı.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains at JoVE.com

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Bu iletişim kuralı diseksiyon ve yetişkin Drosophila melanogaster immunostaining açıklar beyin dokuları. Özellikle, bu iletişim kuralı doğru nöronal gelişim birçok yönlerini temel genel prensipler ortaya çıkarmak için kullanılabilecek örnek nöronal alt kümeleri olarak Drosophila mantar beden ve photoreceptor nöronlar kullanımı vurgulamaktadır.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

dissection-immunofluorescent-staining-mushroom-body-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

19.1K Görüntüleme.  The College of Wooster. Bu iletişim kuralı diseksiyon ve yetişkin Drosophila melanogaster immunostaining açıklar beyin dokuları. Özellikle, bu iletişim kuralı doğru nöronal gelişim birçok yönlerini temel genel prensipler ortaya çıkarmak için kullanılabilecek örnek nöronal alt kümeleri olarak Drosophila mantar beden ve photoreceptor nöronlar kullanımı vurgulamaktadır.

Video: Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Gelişim Biyolojisi

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Meyve Fly Yetiştirme<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Aksenik ve gnotobiyotik Koşullarında

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

Sineği boyanmasına ile steroidogenik organları ve İnteraktif Organlar görselleştirme için Protokoller<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Fare Embriyonik Böbreklerinin Diseksiyonu ve Kültürü

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Drosophila pupa Retina diseksiyon immünhistokimya, Batı analiz ve RNA izolasyon için

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Çözdürme, kültür ve Drosophila hücre hatları Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

Drosophila melanogaster endokrin bozulma test yöntemleri

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Drosophila melanogaster Kan-beyin Bariyer Bütünlüğü için Tahse

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the developmental mechanisms that generate neural diversity and drive circuit assembly. Given its complex three-dimensional organization, analysis of the optic lobe requires that one understand how its adult neuropils and larval progenitors are positioned relative to each other and the central brain. Here, we describe a protocol for the dissection, immunostaining and mounting of larval and adult brains for optic lobe imaging. Special emphasis is placed on the relationship between mounting orientation and the spatial organization of the optic lobe. We describe three mounting strategies in the larva (anterior, posterior and lateral) and three in the adult (anterior, posterior and horizontal), each of which provide an ideal imaging angle for a distinct optic lobe structure.

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

This protocol describes three steps to prepare larval and adult Drosophila optic lobes for imaging: 1) brain dissections, 2) immunohistochemistry and 3) mounting. Emphasis is placed on step 3, as distinct mounting orientations are required to visualize specific optic lobe structures.&#160;

Optik lob görselleştirmesi için larva ve erişkin drosophila beyinlerinin diseksiyonu, immünohistokimyası ve montajı

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...