Bu araştırma R35GM148160 (C. C.) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Eğitim Hibesi T32 GM007270 (R. C. S) tarafından desteklenmektedir.

NOT: Şekil 1'de bu etüdü gerçekleştirmek için gerekli malzemeler gösterilmektedir.
1. Deney için dikkat edilmesi gereken noktalar ve hazırlıklar
<ol><li>Larvaların aşırı kalabalıklaşmasını önleyin. NOT: Eksplant larva beyinlerinin kalitesi, diseksiyon öncesi larvaların sağlığı ve kalitesi ile doğrudan ilişkilidir. Aşırı kalabalıktan yetersiz beslenen larvalar genellikle daha düşük kaliteli beyinler verir30.<ol><li>Yetersiz beslenmeyi önlemek için yemek kapağı kabı başına 20-30'dan fazla larva bulunmadığından emin olun. Bunların örnekleri Şekil 2'de görülebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Kullanmadan önce Schneider'in ortamını filtreleyin ve aliquot edin.<ol><li>Her diseksiyon için, alıntılanan Schneider'in böcek besiyerini% 1 sığır büyüme serumu (BGS) ile destekleyerek taze görüntüleme ve diseksiyon ortamı hazırlayın. Bir görüntüleme deneyi için genellikle 5 mL'lik bir diseksiyon ve görüntüleme ortamı hacmi yeterlidir.</li>
		<li>Kullanmadan önce takviye edilen ortamı oda sıcaklığına (RT) ısıtın.</li>
	</ol></li>
	<li>Toplanacak filmin uzunluğunu düşünün ve görüntüleme ortamının takviyesini, montaj yaklaşımını ve mikroskobun edinme ayarlarını hesaba katmak için bunu kullanın. NOT: En uygun koşullar altında, sadece BGS ile desteklenen beyinlerdeki NB'ler, 3 saate kadar sağlam bir şekilde bölünecektir.<ol><li>Daha uzun filmler gerektiren deneyler yaparken 4 saatten önceki bölünmeleri desteklemek için görüntüleme ortamına larva yağlı vücut dokuları ekleyerek görüntüleme ortamını destekleyin. NOT: Yağlı cisimler NB proliferasyonunu destekleyen mitojenler salgılar31 ve 10 larvadan gelen tüm yağlı vücutlar dört ila beş beyni desteklemek için yeterlidir. Ayrıca, membrana bağlı bir slaytla görüntülenen örneklerin 10 saat13,32'den fazla bölündüğü gösterilirken, çok kuyucuklu bir slaytla görüntülenen örnekler genellikle daha az bölünür (yayınlanmamış gözlemler).</li>
		<li>Alternatif olarak, daha önce açıklandığı gibi daha uzun filmler için daha karmaşık bir görüntüleme ortamı uygulayın33. En iyi sonuçlar için pozlama süresini, lazer gücünü ve örnekleme frekansını ayarlayarak fotohasarı en aza indirin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Larva evrelemesi ve toplanması (Şekil 2)
<ol><li>İstenilen genotipte döl üretmek için 1-5 günlük dişi bakire sinekleri 1-7 günlük yetişkin erkek sineklerle geçin. Optimum verim için, 10-15 dişi bakireyi 5-10 erkekle geçin. Bu sinekleri bir yemek kapağı olan bir sinek kafesine koyun (Şekil 2A-C) ve 25 ° C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Yemek kapağını günlük olarak değiştirin. Bu, yemek kapaklarının larvalarla aşırı kalabalıklaşmasını önler, bu da disseke beyinlerin kalitesini düşürür.</li>
	<li>Yemek kapağı larvalarla önemli ölçüde kaplıysa (yani, >30), bu yemek kapağını ikiye bölün ve yarısını da ikiye kesilmiş taze bir yemek kapağıyla değiştirin. Alternatif olarak, yemek kapaklarını daha sık değiştirin (yani, her 24 saatte bir yerine her 12 saatte bir). Aşırı nüfuslu yemek kapaklarının örnekleri Şekil 2E, F'de görülebilir.</li>
	<li>Larvalar istenen yaşa ulaşana kadar yemek kapağını larvalarla 25 ° C'de inkübe edin.</li>
</ol>3. Larva yağlı vücut diseksiyonu (Şekil 3)
NOT: Bu protokol, 3 kuyucuklu bir diseksiyon kabı kullanarak diseksiyonları açıklar.
<ol><li>Pipet, 3 delikli bir diseksiyon kabının her bir kuyucuğuna ~ 400 μL diseksiyon ve görüntüleme ortamı.</li>
	<li>On adet 72-96 saatlik iyi beslenmiş vahşi tip larvaları, diseksiyon forsepsleri ile hafifçe tutarak ve tüm gıda partikülleri yıkanana kadar en alttaki kuyuya diseksiyon çözeltisinin içine ve dışına daldırarak yıkayın. Durulamadan sonra, temiz larvaları orta kuyuya taşıyın.</li>
	<li>Bir cımbız seti kullanarak, larvaları ağız kancalarından tutun. Diğer cımbız seti ile larvaların kütikülünün bir tarafını yırtın.</li>
	<li>Bu yırtılma, yağlı cisimlerin larvadan dökülmesine neden olacaktır. Yağ cisimleri kirli beyaz ve yarı yarı saydamdır ve kafes benzeri bir yapıya sahip olacaktır (Şekil 3I). Yağlı cisimler ayrıca kendilerine ve diseksiyon cımbızlarına yapışma eğiliminde olacaktır. Tanımlandıktan sonra, her larvadan mümkün olduğunca fazla yağ gövdesi toplayın ve forseps ile 400 μL RT diseksiyon ortamı ile en üstteki kuyuya aktarın.</li>
</ol>4. Larva beyin diseksiyonu (Şekil 3)
<ol><li>Deneysel larvaları yiyecek artıklarından arındırmak için yukarıdaki gibi diseksiyon ve görüntüleme ortamında yıkayın. En iyi sonuçlar için, disseke edilmemiş larvaları diseksiyon çözeltisinde saklamaktan kaçının. Bu, larvaların "boğulmasına" neden olacak ve disseke edilmiş beyinlerin kalitesini olumsuz yönde etkileyecektir.</li>
	<li>Bir cımbız seti kullanarak, larvaları ağız kancalarından tutun. Başka bir cımbız seti kullanarak, larvaların yaklaşık 1 / 3'ünü arka taraftan yavaşça kesin / sökün (Şekil 3A). Bu, sindirim sisteminin, yağ gövdelerinin, bağ dokusunun ve sinir sisteminin elemanlarının larvaların yırtılmış tarafından "patlamasına" neden olacaktır (Şekil 3B).</li>
	<li>Bir cımbız seti kullanarak, larvaları ağız kancalarından tutun. Diğer cımbız seti ile, kütikülü ağız kancalarına doğru nazikçe fırçalayın, tüm larva içten dışa dönene kadar ağız kancalarını tutan cımbızlarla içeri doğru "iterek". Bu hareket bir çorabı "içten dışa" çevirmeye benzer (Şekil 3C, D).</li>
	<li>Larvaları ters çevirin, böylece merkezi sinir sistemi ve diğer dokular hala kütiküle bağlıyken dışa doğru bakar. Bu adımda, yanlışlıkla çıkarılmasını önlemek için merkezi sinir sistemini (CNS) bulun. Cımbız kullanarak, CNS olmayan tüm dokuları nazikçe çıkarın, sadece CNS ve beyni kütiküle bağlı bırakın (Şekil 3E).</li>
	<li>Beyin, aksonal bağlantılar yoluyla kütiküle bağlanacaktır. Mikrodiseksiyon makası kullanarak, beyni kütikülden serbest bırakmak için bu aksonal bağlantıları kesin. Bunu yapmak için, önce beyin loblarının altını yavaşça kesin (Şekil 3F). Ventral sinir kordonunun altındaki bağlantılarla tekrarlayın. NOT: Bu adım, mikrodiseksiyon makası mevcut değilse cımbızla yapılabilir. Cımbız kullanırken, kütikülden çıkarılırken beyin dokusunun aşırı gerilmediğinden emin olmak için özel dikkat gösterin, çünkü mekanik stres beyin sağlığını olumsuz yönde etkileyecektir.</li>
	<li>Diseke edilen beyni diseksiyon ve görüntüleme ortamı ile bir kuyuya aktarın. 3 saatten daha uzun görüntüleme deneyleri için, yukarıda açıklandığı gibi yağlı cisimlerle desteklenmiş diseksiyon ve görüntüleme ortamı kullanın. Diseksiyon süresini 20 dakikanın altında tutmak için larvaları gruplar halinde diseke edin.</li>
</ol>5. Montaj ve görüntüleme (Şekil 4)
<ol><li>Membrana bağlı slayt34 ile görüntüleme için:<ol><li>Diseksiyon kabının son kuyusunda hem disseke edilmiş beyinleri hem de izole edilmiş yağ gövdelerini toplayın.</li>
		<li>Slaytın yarısını, slaytın arkasına gaz geçirgen bir membran yerleştirerek birleştirin ve bölünmüş halkayı yerinde tutarak merkeze bastırın (Şekil 4A-C).</li>
		<li>200 μL'lik bir mikropipet kullanarak, ~ 130-140 μL diseksiyon ve görüntüleme ortamında 10 adede kadar disseke edilmiş beyni ve mümkün olduğunca fazla yağ gövdesini (yukarıya bakın) membrana aktarın. Ortamı, numunelerle birlikte gaz geçirgen membranın ortasına bıraktığınızdan emin olun (Şekil 4D, E).</li>
		<li>Beyinleri, görüntülenecek NB popülasyonu ve kullanılan mikroskop türü için yönlendirin (Şekil 4E). Numuneyi mikroskopun amacına mümkün olduğunca yakın konumlandırın. Örneğin, merkezi beyin loblarındaki NB'leri görüntülemek için, beyinleri beyin lobları hedefe en yakın olacak şekilde yönlendirin (Şekil 4H).</li>
		<li>Beyinler yönlendirildikten sonra, zardaki çözeltinin üzerine yavaşça bir cam örtü parçası yerleştirin. Bu, beyinleri ve yağ gövdelerini içeren çözeltinin zarın tamamına yayılmasına neden olacaktır (Şekil 4F).</li>
		<li>Bir laboratuvar dokusunu kapak kayma kenarına yakın tutarak aşırı çözeltiyi lekeleyin. En uygun çözüm miktarı, beyinler ezilmeden kapak kaymasına dokunduğunda elde edilir. Bu adımda yeniden yönlendirme gerekiyorsa, beyinleri hareket ettirmek için kapak kaymasını dikkatlice hareket ettirin.</li>
		<li>Bir boya fırçası ile kapak kaymasının kenarları boyunca erimiş petrol jölesi uygulayarak kapak kaymasını hareketsiz hale getirin. Jölenin katılaşmasına izin verin (Şekil 4G).</li>
	</ol></li>
	<li>Çok kuyulu görüntüleme slaytı ile görüntüleme için (Şekil 4):<ol><li>Çok kuyucuklu bir slaytın bir kuyucuğuna 400 μL görüntüleme ortamı ekleyin (burada yapılan deneyde, odacıklı 8 delikli bir mikro [μ] slayt kullanılmıştır; Şekil 4I). Daha önce disseke edilmiş yağ cisimleri bu kuyuya aktarın (bkz. adım 3.4).</li>
		<li>Kuyunun merkezine yakın bir kümede 10 adede kadar beyin biriktirin (Şekil 4J).</li>
		<li>Beyinleri, görüntülenecek NB popülasyonu ve kullanılan mikroskop türü için, adım 5.1.4'te açıklandığı gibi yönlendirin (Şekil 4K). Örnekleri birbirine yakın olacak şekilde düzenleyin. Bu, aşamanın numuneler arasında hareket etmesi gereken mesafeyi en aza indirecek ve bu da alım sırasında numune sürüklenmesini azaltacaktır.</li>
		<li>Beyinler kuyuya yönlendirildikten sonra, beyinlerin 2-5 dakika boyunca yerleşmesine izin verin. Bu, taşıma / görüntüleme sırasında stabilitelerini arttırır. Bu süre zarfında mikroskopu edinim için hazırlayın.</li>
		<li>μ slaytı slayt kapağıyla örtün ve mikroskopa aktarın. Fotobeyazlatmayı en aza indirmek için mümkün olan en düşük lazer gücü ve pozlama süresi ile edinmeye başlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Veri işleme ve yönetimi için en iyi uygulamalar
<ol><li>Verileri mevcut analiz yazılımına göre gerektiği gibi işleyin.<ol><li>Burada gösterilen örnek için, elde edilen verileri SlideBook yazılımıyla SlideBook Image File (.sld) olarak kaydedin.</li>
		<li>Imaris Dosya Dönüştürücüsü'nü kullanarak Imaris'in tescilli dosya türüne (.ims) dönüştürmek için, Imaris Dosya Dönüştürücüsü'nü ayrı bir pencerede açın. .sld dosyalarını tıklayın ve Imaris Dosya Dönüştürücüsü'nün " giriş" bölümüne sürükleyin.</li>
		<li>Dönüştürülen dosyalar için istediğiniz çıktı konumunu belirleyin ve "Tümünü başlat" ı tıklayın.</li>
		<li>Dönüştürmeden sonra, Imaris yazılımındaki verileri görüntüleyin ve bunlara açıklama ekleyin. NOT: Görüntü analizi için Fiji (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html), Aivia (https://www.aivia-software.com/), Volocity (https://www.volocity4d.com/) veya diğerleri gibi Imaris yerine alternatifler kullanılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Doğru kayıt tutma için orijinal verilerin mümkün olduğunca çoğunu saklayın. Örneğin, edinme yazılımı bir dosya biçiminde kaydedilmiş, ancak analiz için farklı bir biçime dönüştürülmüşse, verilerin edinilen sürümünü koruyun.</li>
	<li>Veri analizi için, örnek ve edinme ayarları hakkında mümkün olduğunca çok ayrıntının kaydını tutun. Saklanacak anahtar bilgiler, disseke edilen larvaların genotipini, diseksiyondan önce larvaların yaşını, yetiştirildikleri yemek kapağının durumunu, görüntüleme sırasında kullanılan lazer gücünü, maruz kalma süresini, edinim uzunluğunu ve zamansal çözünürlüğü içerir.</li>
</ol>7. Hücre döngüsü uzunluğunun örnek nicelleştirilmesi (Şekil 5)
NOT: Bu örnekte, polarite işaretleyici Pinleri (Pins::EGFP16) ve mikrotübül bağlayıcı protein Jüpiter25'i (cherry::Jüpiter13) ifade eden larvalar görüntülenmiştir. Sonraki analiz Imaris yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi.
<ol><li>Seçtiğiniz görüntü analiz yazılımını kullanarak filmi açın. Bölünen NB'leri tanımlamak için filmin uzunluğu boyunca ilerleyin ve ileride başvurmak üzere etiketleyin. Bölünen NB'leri farklı mitotik iğlerine göre tanımlayın (Şekil 5C-E).</li>
	<li>Hücre döngüsü uzunluğunu belirlemek için bir referans hücre döngüsü aşaması tanımlayın. Bu örnekte, metafaz başvuru olarak kullanılmıştır.</li>
	<li>Ardışık metafazlar arasındaki kare sayısını el ile belirleyin ve bir hücre döngüsünü tamamlamak için geçen süreyi belirlemek için bunu dakikalara veya saatlere dönüştürün.<ol><li>Bunu, filmin zamansal çözünürlüğünü alarak ve metafazlar arasındaki kare sayısıyla çarparak yapın. Örneğin, filmin zamansal çözünürlüğü her 5 dakikada bir kareyse ve metafazlar kare 13 ve kare 35'te gözlenirse, bu metafazlar arasındaki süre 110 dakika olacaktır ([35 − 13] × 5).</li>
	</ol></li>
	<li>Verileri uygun herhangi bir yazılımla çizin. Burada gösterilen veriler PRISM yazılımı kullanılarak çizilmiştir.</li>
</ol>8. Hücre mili hizalamasının örnek nicelleştirilmesi (Şekil 5)
NOT: Bu örnekte, analiz Imaris yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir.
<ol><li>Film dosyasını Imaris'te veya tercih edilen başka bir yazılımda açın. Bölünen NB'leri tanımlamak için filmin uzunluğu boyunca ilerleyin ve ileride başvurmak üzere etiketleyin.</li>
	<li>Apikal ve bazal sentrozomları ( m ile temsil edilen) kullanarak iş mili kutupları tarafından oluşturulan vektörü aşağıdaki gibi belirleyin: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65538/65538eq01.jpg" style="margin: auto;"> burada Ax, Ay ve Az , apikal sentrozomun koordinatlarıdır ve Bx, By ve Bz , bazal sentrozomun koordinatlarıdır. Benzer şekilde, bölünme vektörünün ekseni ( n ile temsil edilir) apikal Pinlerin orta noktası tarafından oluşturulur::EGFP hilali ve bazal korteks: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65538/65538eq02.jpg" style="margin: auto;"> burada Ax, Ay ve Az , Pinlerin orta noktasının koordinatlarıdır::EGFP hilali ve Bx, By ve Bz , bazal korteksin orta noktasının koordinatlarıdır.</li>
	<li>m ve n vektörlerinin büyüklüğünü belirleyin: m büyüklüğü:<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/65538/65538eq03.jpg" style="margin: auto;"> n'nin büyüklüğü:<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/65538/65538eq04.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>m ve n'nin nokta ürününü (k ile temsil edilen) belirleyin: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/65538/65538eq05.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>Nokta çarpımı k ve vektör büyüklükleri m ve n'yi kullanarak, vektörler arasındaki açıyı belirleyin: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/65538/65538eq06.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>Verileri tercih ettiğiniz yazılımda çizin. Burada gösterilen veriler Microsoft Excel'de hazırlanmış ve PRISM'de görselleştirilmiştir.</li>
</ol>

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larvalarından Canlı Beyin Eksplantlarının Görüntülenmesi

<ol>
	<li>Delgado, M. K., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+cell+size,+fate,+and+behavior+during+asymmetric+cell+division.">Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division.</a> Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).</li><li>Sunchu, B., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+mechanisms+of+asymmetric+cell+division.">Principles and mechanisms of asymmetric cell division.</a> Development. 147 (13), (2020).</li><li>Homem, C. C. F., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+A+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: A model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Gallaud, E., Pham, T., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+neuroblasts:+A+model+for+asymmetric+stem+cell+divisions.">Drosophila melanogaster neuroblasts: A model for asymmetric stem cell divisions.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 61 (1489), 183-210 (2017).</li><li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Where+does+asymmetry+come+from?+Illustrating+principles+of+polarity+and+asymmetry+establishment+in+Drosophila+neuroblasts.">Where does asymmetry come from? Illustrating principles of polarity and asymmetry establishment in Drosophila neuroblasts.</a> Current Opinion in Cell Biology. 62, 70-77 (2020).</li><li>Pollington, H. Q., Seroka, A. Q., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+temporal+patterning+to+neuronal+connectivity+in+Drosophila+type+I+neuroblast+lineages.">From temporal patterning to neuronal connectivity in Drosophila type I neuroblast lineages.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 142, 4-12 (2023).</li><li>Oon, C. H., Prehoda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+recruitment+and+actin+dependent+cortical+flows+drive+the+neuroblast+polarity+cycle.">Asymmetric recruitment and actin dependent cortical flows drive the neuroblast polarity cycle.</a> eLife. 8, e45815 (2019).</li><li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA.">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li><li>Oon, C. H., Prehoda, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phases+of+cortical+actomyosin+dynamics+coupled+to+the+neuroblast+polarity+cycle.">Phases of cortical actomyosin dynamics coupled to the neuroblast polarity cycle.</a> eLife. 10, e66574 (2021).</li><li>LaFoya, B., Prehoda, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-dependent+membrane+polarization+reveals+the+mechanical+nature+of+the+neuroblast+polarity+cycle.">Actin-dependent membrane polarization reveals the mechanical nature of the neuroblast polarity cycle.</a> Cell Reports. 35 (7), 109146 (2021).</li><li>Siller, K. H., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lis1/dynactin+regulates+metaphase+spindle+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts.</a> Developmental Biology. 319 (1), 1-9 (2008).</li><li>Siller, K. H., Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NuMA-related+Mud+protein+binds+Pins+and+regulates+spindle+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts.</a> Nature Cell Biology. 8 (6), 594-600 (2006).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical/basal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila.">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).</li><li>Cabernard, C., Prehoda, K. E., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spindle-independent+cleavage+furrow+positioning+pathway.">A spindle-independent cleavage furrow positioning pathway.</a> Nature. 467 (7311), 91-94 (2010).</li><li>Connell, M., Cabernard, C., Ricketson, D., Doe, C. Q., Prehoda, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cortical+extension+shifts+cleavage+furrow+position+in+Drosophila+neuroblasts.">Asymmetric cortical extension shifts cleavage furrow position in Drosophila neuroblasts.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (22), 4220-4226 (2011).</li><li>Tsankova, A., Pham, T. T., Garcia, D. S., Otte, F., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+polarity+regulates+biased+myosin+activity+and+dynamics+during+asymmetric+cell+division+via+Drosophila+rho+kinase+and+protein+kinase+N.">Cell polarity regulates biased myosin activity and dynamics during asymmetric cell division via Drosophila rho kinase and protein kinase N.</a> Developmental Cell. 42 (2), 143-155 (2017).</li><li>Montembault, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+efflux+promotes+cell+elongation+to+coordinate+chromosome+segregation+with+cell+cleavage.">Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage.</a> Nature Communications. 8 (1), 326 (2017).</li><li>Roubinet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+separated+cortical+flows+and+spindle+geometry+establish+physical+asymmetry+in+fly+neural+stem+cells.">Spatio-temporally separated cortical flows and spindle geometry establish physical asymmetry in fly neural stem cells.</a> Nature Communications. 8 (1), 1383 (2017).</li><li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrobin+controls+mother-daughter+centriole+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts.">Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Nature Cell Biology. 15 (3), 241-248 (2013).</li><li>Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts+retain+the+daughter+centrosome.">Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome.</a> Nature Communications. 2 (1), 243 (2011).</li><li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+Drosophila+neural+stem+cells.">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells.</a> Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> The Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).</li><li>Lerit, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+centrosome+organization+by+the+PLP-Cnn+scaffold+is+required+for+centrosome+function.">Interphase centrosome organization by the PLP-Cnn scaffold is required for centrosome function.</a> Journal of Cell Biology. 210 (1), 79-97 (2015).</li><li>Gallaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+centriolar+localization+of+Polo+and+Centrobin+in+early+mitosis+primes+centrosome+asymmetry.">Dynamic centriolar localization of Polo and Centrobin in early mitosis primes centrosome asymmetry.</a> PLoS Biology. 18 (8), e3000762 (2020).</li><li>Ramdas Nair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microcephaly-associated+protein+Wdr62/CG7337+is+required+to+maintain+centrosome+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts.">The microcephaly-associated protein Wdr62/CG7337 is required to maintain centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Cell Reports. 14 (5), 1100-1113 (2016).</li><li>Singh, P., Nair, A. R., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centriolar+protein+Bld10/Cep135+is+required+to+establish+centrosome+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts.">The centriolar protein Bld10/Cep135 is required to establish centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Current Biology. 24 (13), 1548-1555 (2014).</li><li>LaFoya, B., Prehoda, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consumption+of+a+polarized+membrane+reservoir+drives+asymmetric+membrane+expansion+during+the+unequal+divisions+of+neural+stem+cells.">Consumption of a polarized membrane reservoir drives asymmetric membrane expansion during the unequal divisions of neural stem cells.</a> Developmental Cell. 1534 (23), 00159 (2023).</li><li>Sunchu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+chromatin+retention+and+nuclear+envelopes+separate+chromosomes+in+fused+cells+in+vivo.">Asymmetric chromatin retention and nuclear envelopes separate chromosomes in fused cells in vivo.</a> Communications Biology. 5 (1), 953 (2022).</li><li>Oliveira, A. C., Rebelo, A. R., Homem, C. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+animal+development:+How+hormones+and+metabolism+regulate+developmental+transitions+and+brain+formation.">Integrating animal development: How hormones and metabolism regulate developmental transitions and brain formation.</a> Developmental Biology. 475, 256-264 (2021).</li><li>Britton, J. S., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+control+of+the+cell+cycle+in+Drosophila:+nutrition+activates+mitotic+and+endoreplicative+cells+by+distinct+mechanisms.">Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms.</a> Development. 125 (11), 2149-2158 (1998).</li><li>Lee, C. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Aurora-A+kinase+inhibits+neuroblast+self-renewal+by+regulating+aPKC/Numb+cortical+polarity+and+spindle+orientation.">Drosophila Aurora-A kinase inhibits neuroblast self-renewal by regulating aPKC/Numb cortical polarity and spindle orientation.</a> Genes &amp; Development. 20 (24), 3464-3474 (2006).</li><li>Homem, C. C. F., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+Drosophila+neuroblast+lineages.">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of Drosophila neuroblast lineages.</a> PLoS ONE. 8 (11), e79588 (2013).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).</li><li>Karpova, N., Bobinnec, Y., Fouix, S., Huitorel, P., Debec, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jupiter,+a+new+Drosophila+protein+associated+with+microtubules.">Jupiter, a new Drosophila protein associated with microtubules.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 63 (5), 301-312 (2006).</li><li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).</li><li>Bostock, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immobilization+technique+for+long-term+time-lapse+imaging+of+explanted+Drosophila+tissues.">An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted Drosophila tissues.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).</li></ol>

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir finansal açıklama bulunmamaktadır.

Bu protokol, Drosophila melanogaster larvalarından canlı eksplant beyinlerinin görüntülenmesi için bir yaklaşımı özetlemektedir. Burada açıklanan protokol, eksplant beyinlerinin doğru deneysel koşullar altında 12-20 saat boyunca gözlemlenmesini sağlar. Numunelerin hazırlanmasına ve istenen deneylerin tasarımına özel dikkat gösterilmelidir. Yukarıda belirtildiği gibi, disseke edilmiş dokunun kalitesini belirleyen en kritik faktörlerden biri larvaların sağlığıdır. Mümkün olan en ...

Asimetrik hücre bölünmesi (ACD), RNA, proteinler ve organeller gibi hücre altı bileşenlerinyavru hücreler 1,2 arasında eşit olmayan bir şekilde bölündüğü süreçtir. Bu süreç, farklı gelişimsel kaderlere sahip yavru hücrelere yol açmak için ACD'ye maruz kalan kök hücrelerde yaygın olarak görülür. Drosophila NB'ler, kökünü koruyan bir NB ve bir ganglion ana hücresi (GMC) üretmek için asimetrik olarak bölünür. GMC, farklılaştırıcı nöronlar veya glia3 üretmek için daha fazla bölünmeye uğrar. Asimetrik olarak bölünen NB'ler, mikroskopi ile kolayca gözlemlenen üçüncü instar larvalarının gelişmekte olan beyinlerinde bol miktarda bulunur. Üçüncü instar larva aşamasında, her bir merkezi beyin lobundayaklaşık 100 NB bulunur 3,4,5,6.
Asimetrik hücre bölünmesi oldukça dinamik bir süreçtir. Canlı hücre görüntüleme protokolleri, hücre polaritesi 7,8,9,10, iğ oryantasyonu11,12,13, aktomiyosin korteksdinamiği 14,15,16,17,18, mikrotübül ve sentrozom biyolojisi 19,20 dinamiklerini ölçmek ve ölçmek için kullanılmıştır,21,22,23,24,25,26,27 ve membran 10,28 ve kromatin dinamiği 29. ACD'nin nitel ve nicel açıklamaları, sağlam canlı beyinlerde NB'leri bölmek için sağlam yöntemlere ve protokollere dayanır. Aşağıdaki protokol, iki farklı montaj yaklaşımı kullanarak in vivo canlı hücre görüntüleme için üçüncü instar larva beyinlerini hazırlama, disseke etme ve görüntüleme yöntemlerini özetlemektedir. Bu yöntemler, kök hücre bölünmelerinin mekansal zamansal dinamiklerinin yanı sıra diğer beyin hücrelerindeki bölünmelerle ilgilenen araştırmacılar için en uygun olanıdır, çünkü hücresel olayların kısa ve uzun vadeli gözlemlerine izin verirler. Ek olarak, bu tekniklere alana yeni gelenler için kolayca erişilebilir. Bu yaklaşımın etkinliğini ve uyarlanabilirliğini, floresan olarak etiketlenmiş mikrotübül ve kortikal füzyon proteinlerini eksprese eden larva beyinleri ile gösteriyoruz. Ek olarak, analiz yöntemlerini ve diğer çalışmalarda uygulama için dikkat edilmesi gerekenleri tartışıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone (PES) Membrane</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-231</td>
			<td>Vacuum-driven filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>20-248</td>
			<td>granulated agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>NA</td>
			<td>Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Growth Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30541.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered Imaging Slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-machined metal slide</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5024343</td>
			<td>3-well porcelain micro spot plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Dumont #5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>59-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas-permeable membrane</td>
			<td>YSI</td>
			<td>98095</td>
			<td>Gas-permeable membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Cover Slides</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72204-03</td>
			<td># 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>NA</td>
			<td>Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris File Converter</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Yeast</td>
			<td>Saf-Instant</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molasses</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>62-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>628161</td>
			<td>60 mm x 15 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum Jelly</td>
			<td>Vaseline</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook acquisition software</td>
			<td>3i</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 &#181;&#181;m PES membrane filter</td>
			<td>Genesee Scientific, GenClone</td>
			<td>25-231</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell imaging of drosophila melanogaster third instar larval brains

Drosophila nöral kök hücreleri (nöroblastlar, bundan sonra NB'ler) asimetrik bölünmelere uğrar, kendini yenileyen nöroblastı yenilerken, aynı zamanda iki nöron veya glia'ya yol açmak için ek bir bölünmeye uğrayacak olan farklılaştırıcı bir gangliyon ana hücresi (GMC) oluşturur. NB'lerde yapılan çalışmalar, hücre polaritesi, iğ oryantasyonu, nöral kök hücre kendini yenileme ve farklılaşmanın altında yatan moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmıştır. Bu asimetrik hücre bölünmeleri, canlı hücre görüntüleme yoluyla kolayca gözlemlenebilir, bu da larva NB'leri canlı dokudaki asimetrik hücre bölünmesinin mekansal zamansal dinamiklerini araştırmak için ideal hale getirir. Besin takviyeli ortamda düzgün bir şekilde diseke edildiğinde ve görüntülendiğinde, eksplant beyinlerindeki NB'ler 12-20 saat boyunca sağlam bir şekilde bölünür. Daha önce açıklanan yöntemler teknik olarak zordur ve bu alanda yeni olanlar için zorlayıcı olabilir. Burada, yağ vücut takviyeleri kullanılarak canlı üçüncü instar larva beyin eksplantlarının hazırlanması, diseksiyonu, montajı ve görüntülenmesi için bir protokol açıklanmaktadır. Olası problemler de tartışılmakta ve bu tekniğin nasıl kullanılabileceğine dair örnekler verilmektedir.

Asymmetric cell division (ACD) is the process by which subcellular components such as RNA, proteins, and organelles are partitioned unequally between daughter cells1,2. This process is commonly seen in stem cells, which undergo ACD to give rise to daughter cells with different developmental fates. Drosophila NBs divide asymmetrically to produce one NB, which retains its stemness, and one ganglion mother cell (GMC). The GMC undergoes further divisions to produce differentiating neurons or glia3. Asymmetrically dividing NBs are abundant in the developing brains of third-instar larvae, which are readily observed via microscopy. At the third instar larval stage, there are roughly 100 NBs present in each central brain lobe3,4,5,6.
Asymmetric cell division is a highly dynamic process. Live-cell imaging protocols have been used to measure and quantify the dynamics of cell polarity7,8,9,10, spindle orientation11,12,13, the dynamics of the actomyosin cortex14,15,16,17,18, microtubule and centrosome biology19,20,21,22,23,24,25,26,27, and membrane10,28 and chromatin dynamics29. Qualitative and quantitative descriptions of ACD rely on robust methods and protocols to image dividing NBs in intact living brains. The following protocol outlines methods to prepare, dissect, and image third instar larval brains for live-cell imaging in vivo using two different mounting approaches. These methods are best suited for researchers interested in the spatiotemporal dynamics of stem cell divisions, as well as divisions in other brain cells, as they allow for short- and long-term observations of cellular events. Additionally, these techniques are readily accessible to newcomers to the field. We demonstrate the effectiveness and adaptability of this approach with larval brains expressing fluorescently tagged microtubule and cortical fusion proteins. We additionally discuss methods of analysis and considerations for application in other studies.

Yazar Gündemi: Asimetrik Hücre Bölünmesi Dinamiğinin Araştırılması: Drosophila Larva Beyin Eksplantlarının Canlı Görüntülenmesi İçin Bir Protokol 

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Our research focuses on studying the impact of asymmetric cell division or ACD, on stem cell proliferation and differentiation. We employ Drosophila neural stem cells or neuroblasts as a model to understand the mechanisms, regulations, and impacts of asymmetric cell division on development and neurogenesis. The recent developments in artificial intelligence have been making major strides in image quantification and analysis, which has significantly advanced the field of life cell imaging.Maintaining sample quality for a long-term movie is a long-standing challenge. While it's insightful to observe a sample for eight to 10 hours, logistical constraints, like the sample's imaging requirements and available imaging tools, make it difficult. Our protocol addresses this by demonstrating long-term imaging without impacting the sample's quality.Our technique could be easily adopted and applied to the field by newcomers. With some time and practice, one can feasibly generate short and long-term movies, which have the potential to yield insightful and meaningful data.

Pinleri ifade eden merkezi beyin lobu NB'lerinin diseksiyonu ve görüntülenmesi::EGFP ve Cherry::Jüpiter Bu protokolü sergilemek için, UAS güdümlü Kiraz::Jüpiter13'ü ifade eden larvalar ve endojen olarak etiketlenmiş Pinler::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jüpiter/CyO; Pinler::EGFP/TM6B, Tb) çok kuyulu görüntüleme slaytları kullanılarak tarif edilen protokol kullanılarak 4 saat boyunca görüntülendi (Şekil 5C,D<...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Asymmetric Cell Division Dynamics: A Protocol for Live-Imaging of Drosophila Larval Brain Explants at JoVE.com

Burada, fizyolojik koşullar altında hücresel ve hücre altı dinamikleri gözlemlemek için Drosophila melanogaster üçüncü instar larvalarından canlı eksplant beyinlerini hazırlamak, parçalamak, monte etmek ve görüntülemek için bir iş akışını tartışıyoruz.

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Araştırmamız, asimetrik hücre bölünmesinin veya ACD'nin kök hücre proliferasyonu ve farklılaşması üzerindeki etkisini incelemeye odaklanmaktadır. Asimetrik hücre bölünmesinin gelişim ve nörogenez üzerindeki mekanizmalarını, düzenlemelerini ve etkilerini anlamak için Drosophila nöral kök hücrelerini veya nöroblastlarını bir model olarak kullanıyoruz. Yapay zekadaki son gelişmeler, yaşam hücresi görüntüleme alanını önemli ölçüde geliştiren görüntü nicelleştirme ve analizinde büyük adımlar atmaktadır.Uzun vadeli bir film için örnek kalitesini korumak, uzun süredir devam eden bir zorluktur. Bir numuneyi sekiz ila 10 saat boyunca gözlemlemek anlayışlı olsa da, numunenin görüntüleme gereksinimleri ve mevcut görüntüleme araçları gibi lojistik kısıtlamalar bunu zorlaştırır. Protokolümüz, numunenin kalitesini etkilemeden uzun süreli görüntüleme göstererek bunu ele almaktadır.Tekniğimiz yeni gelenler tarafından kolayca benimsenebilir ve alana uygulanabilir. Biraz zaman ve pratikle, anlayışlı ve anlamlı veriler üretme potansiyeline sahip kısa ve uzun vadeli filmler üretilebilir.

live-cell-imaging-drosophila-melanogaster-third-instar-larval

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

1.3K Görüntüleme.  University of Washington. Araştırmamız, asimetrik hücre bölünmesinin veya ACD'nin kök hücre proliferasyonu ve farklılaşması üzerindeki etkisini incelemeye odaklanmaktadır. Asimetrik hücre bölünmesinin gelişim ve nörogenez üzerindeki mekanizmalarını, düzenlemelerini ve etkilerini anlamak için Drosophila nöral kök hücrelerini veya nöroblastlarını bir model olarak kullanıyoruz. Yapay zekadaki son gelişmeler, yaşam hücresi görüntüleme alanını önemli ölçüde geliştiren görüntü n...

Video: Yazar Gündemi: Asimetrik Hücre Bölünmesi Dinamiğinin Araştırılması: Drosophila Larva Beyin Eksplantlarının Canlı Görüntülenmesi İçin Bir Protokol 

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Gelişim Biyolojisi

﻿Staging and Collecting Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

Staging and Collecting Drosophila melanogaster Third Instar Larvae  

Begin by crossing one to five-day-old female virgin flies with one to seven-day-old adult male flies to produce progeny with the desired genotype. To do so, place the flies in a fly cage with a meal cap. Use 10 to 15 female virgins with five to 10 males to get optimal yield.Incubate the fly cage containing flies at 25 degrees Celsius. Change the meal cap daily to prevent overcrowding of larvae which reduces the quality of the dissected brains. If the meal cap has more than 30 larvae, split it into half and replace one portion with a fresh meal cap cut in half.Incubate the meal caps with larvae at 25 degrees Celsius until the larvae reached the desired age.

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larvalarının Evrelendirilmesi ve Toplanması

Fat Body Collection from Drosophila melanogaster Third Instar Larvae

Fat Body Collection from Drosophila melanogaster Third Instar Larvae  

Begin by pipetting around 400 microliters of dissection and imaging medium into each well of a three-well dissection dish. Under a microscope, wash 10, well-fed, wild-type larvae by gently holding them with dissection forceps and dipping them in and out of the dissection medium in the bottommost well to remove all food particulates. While continuing to work under the dissection microscope, transfer the clean larvae to the middle well.Hold the larva by the mouth hooks using one set of tweezers. With another set of tweezers, rupture one side of the larva's cuticle to spill out the fat bodies. Using forceps, collect as much fat body from each larva as possible and transfer it to the topmost well containing 400 microliters of dissection medium at room temperature.

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larvalarından Yağ Vücut Koleksiyonu

Dissection of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brain for Live-Cell Imaging

Dissection of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brain for Live-Cell Imaging  

Begin by pipetting around 400 microliters of dissection and imaging medium into each well of a three-well dissection dish. Working under a dissection microscope, wash the experimental larvae in dissection and imaging medium to remove food residues. While continuing to work under the dissection microscope, hold the larvae by the mouth hooks using one set of tweezers.With another set of tweezers, carefully cut off approximately 1/3 of the larva from the posterior side. Next, while holding the larva by the mouth hooks using one set of tweezers, use the other set of tweezers to brush the cuticle towards the mouth hooks gently. Simultaneously, push inward with the tweezers holding the mouth hooks until the entire larva is turned inside out.Invert the larva to expose the central nervous system and other tissues while maintaining their connection to the cuticle. Locate the central nervous system, or CNS, to avoid accidental removal. Gently remove non-CNS tissues using tweezers, keeping only the CNS and brain attached to the cuticle.To release the brain from the cuticle by severing the axonal connections, using microdissection scissors, cut gently beneath the brain lobes. Then, cut the connections under the ventral nerve cord. Dissect larvae in batches to keep the dissection time under 20 minutes.Transfer the dissected brain into a well containing the dissection and imaging medium. For imaging lasting over three hours, supplement the medium with fat bodies.

Canlı hücre görüntüleme için Drosophila melanogaster üçüncü instar larva beyninin diseksiyonu

Mounting and Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brain

Mounting and Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brain  

To perform live cell imaging of the third instar larval brain, begin by collecting the dissected brains and the isolated fat bodies in the last well of a three well dissection dish containing the dissection and imaging medium. Place a gas permeable membrane on the back of a slide and press the split ring into the center. Using a 200 microliter micro pipette, transfer up to 10 dissected brains with maximum possible fat bodies and 130 to 140 microliters of the medium onto the center of the membrane.Orient the brains according to the neural stem cell population to be imaged and the microscope type, ensuring the samples are close to the microscope's objective. For example, to image neural stem cells in the central brain lobes, ensure the brain lobes are closest to the objective. Then gently place a glass cover slip over the solution on the membrane to spread the solution with the brain's and fat bodies throughout the membrane.Hold the laboratory tissue at the cover slip edge to blot excess solution until the brains touch the cover slip without being squashed. Next, immobilize the cover slip by applying molten petroleum jelly along its edges using a paintbrush and allow the jelly to solidify. Add 400 microliters of imaging medium to a well in a multi well micro slide.Transfer the previously dissected fat bodies to this well. Then, place up to 10 brains in a cluster near the center of the well. Orient the brains according to the neural stem cell population to be imaged and the microscope type.Allow the brains to settle in the well for two to five minutes. Cover the micro slide with the slide cover before transferring it to the microscope. Start the acquisition process using the lowest laser power and exposure time to minimize photo bleaching.Imaging of larval brains expressing UAS driven Cherry-Jupiter and androgynously tagged pins GFP using multi-well imaging slides and without fat body supplementation revealed that the pins formed a pronounced apical crescent in dividing neuroblasts to which the mitotic spindles consistently aligned during mitosis. In those samples, the cell cycle length increased with increasing imaging time. Samples that were imaged in a fat body supplemented medium on a membrane-bound slide did not show an increase in cell cycle length.Furthermore, neuroblasts with four divisions were observed on the 10 hour membrane-bound slide.