Bu yayın Grant No altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen çalışma üzerine kuruludur  CHE 1708237.

1. arıtma için hazırlık
<ol><li>Boş hücre ham hazırlanması ayıklamak<ol>
<li>Bu bir 50 mL konik tüp polyhistidine öğesini metalloprotein25 overexpressed E. coli (BL21) ~ 9-10 g hücre Pelet edinin.</li>
		<li>Toplam hacim ~ 45-50 mL için hücre Pelet ~ 9-10 g oda geçici lizis/bağlama arabellek (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8) gram başına 5 mL ekleyin. Düzenli olarak dağılması teşvik etmek için girdap. Pelet donmuştu, ılık su banyosu içinde çözülme.</li>
		<li>Buz-su banyosu kullanarak, hücre süspansiyon ~ 3 ° c hücre lizis için hazırlık soğuk. Not: Bu noktada, hücre lizis sonication, boncuk freze veya başka bir yöntemi mümkündür. Çünkü bu nispeten ucuz, hızlı ve does değil istemek kulak koruma boncuk freze burada gösterilmiştir.</li>
		<li>Odası üreticinin talimatlarına göre freze 50 mL boncuk bir araya getirin.</li>
		<li>Dolgu yarım, tam Boncuk Değirmen Odası-20 ° C'de depolanan 0.1 mm cam boncuk soğutulmuş</li>
		<li>Odası kalan soğutulmuş hücre süspansiyon ile doldurun ve 4 ° C lizis/bağlama arabellek odası tamamen doldurmak için kullanın.</li>
		<li>Şaft boncuk değirmen döndürmek ve hücre süspansiyon boncuk ile karıştırmak için küçük bir spatula kullanın.</li>
		<li>Herhangi bir büyük kabarcıkları ile bir damlalıklı kaldırın ve sonra kapağı üstüne vidala.</li>
		<li>Herhangi bir sızıntı odasından kapalı kuru.</li>
		<li>Buz yaklaşık 1 fincan için açık, Plastik ceket ekleyin, dolu 50 mL odası dolu buz ceket ve vida kapalı içine ters çevir.</li>
		<li>Motor üzerine buz ceketli odası güvenli.</li>
		<li>Boncuk Değirmen 15 saniye 15,800 devirde motor üzerinde açmak, sonra 45 saniye boyunca dinlenmek için izin. 8 kere tekrar edin.</li>
		<li>8 döngüsü tamamlandığında, tüm hücre lizis süspansiyon 50 mL veya daha büyük tüp (25.000 g x veya daha yüksek) yüksek hızlı Santrifüjü için dekor içine dikkatle boşaltmak. 4 ° C hücre artıkları ve cam boncuklar cips 40-45 dakika santrifüj ve 25.000 x g spin dengeli tüpler bir çift koyun. Not: mevcut değildir 50 mL veya daha büyük tüpler için yüksek hızlı Santrifüjü dekor, cam boncuk, centrifuging tarafından kaldırın 1000-2000 g 2-3 dk bir 50 mL konik tüp daha küçük bir güç çıkarmak hücre süspansiyon (~ 25 mL) daha küçük bir hacim verim için x e tüp için yüksek hızlı Santrifüjü dekor.</li>
		<li>Santrifüjü tamamlandığında, berrak, sarı, boş hücre, ham özleri temiz 50 mL konik tüp içine dikkatle boşaltmak. Herhangi bir hücre artıkları aktarmak için dikkat ediniz.</li>
		<li>Boş hücre ham özleri arıtma daha sonraki analizler için küçük bir örnek toplamak SDS-sayfa26tarafından.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IMAC sütun hazırlanması<ol>
<li>Reçine parçacıklar, radarı kilit çıkışı ve ayrıca uygun bir radarı kilit içeren bir üst kap korumak için daha düşük bir yatak desteği ile donatılmış bir 1.5 x 20 cm sütun edinin. Radarı-kilit çıkış akışını kontrol etmek için bir stopcock ile uygun.</li>
		<li>Benchtop çalışma, güvenli bir şekilde sütun bir yüzük stand üzerine monte.</li>
		<li>Nikel-bağlı nitriloacetic asit (Ni-NTA) reçine 4 ° C'de depolanan % 20 etanol içinde % 50 Bulamaç elde</li>
		<li>Yavaşça eşit reçine yeniden askıya için şişe girdap.</li>
		<li>Oda sıcaklığında ve benchtop, reçine polyhistidine 50-60 mg bağlama yeteneğine sahip protein öğesini ve bulamaç sütuna aktarmak 2 mL 1 mL verecektir Bulamaç çekilmeye mezun bir damlalıklı yerleşmiş kullanımı üzerinde çalışıyor.</li>
		<li>Stopcock açın ve reçine düşük yerçekimi tarafından boşaltmak aşırı depolama çözümü sağlar.</li>
		<li>Stopcock güvenli șekilde kapatır</li>
		<li>Pasteur damlalıklı kullanarak dikkatli bir şekilde soğutulmuş lizis/bağlama arabellek (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8) ekleyin ve reçine-en az 30 mL sütunun. Reçine yüzey bozmamaya özen. Arabellek sütun sıçramasına önlemek için duvarları aşağı çalıştırın.</li>
		<li>Reçine yavaş yavaş toplama kabı içine yerçekimi tarafından sütundan boşaltmak lizis/bağlama arabellek izin vererek equilibrate.</li>
		<li>Lizis/bağlama arabellek çoğunlukla drene zaman ~ 5 mL lizis arabelleği reçine kaldığında arabellek akışını durdurmak için stopcock kapatın ve dik, devam etmek için hazır kadar veya en fazla 1 hafta monte sütun bırakın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Polyhistidine öğesini hedef tarafından IMAC saflaştırılması
<ol><li>Yıkama tampon (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole pH 8) ve elüsyon tampon (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, % 10 gliserol pH 8) hazırlayın. 4 ° C'de soğuk</li>
	<li>Ni-NTA sütun boş hücre ham özleri eklenmesi için stopcock açarak ve Ni-NTA reçine ile yerçekimi tarafından boşaltmak için lizis/bağlama arabellek kalan izin hazır olun. Tüm arabellek süzülmüş ve reçine yüzey maruz stopcock kapatın.</li>
	<li>Bir Pasteur damlalıklı, dikkatle damlalıklı kullanarak hücre ücretsiz ham reçine yüzey bozmamaya dikkat çekici, ayıklar. Ham özleri duvarları sıçramasına önlemek için sütun aşağı çalıştırın. Ham özleri uygulanan hacmi ifade polyhistidine öğesini protein düzeyine bağlıdır; ham özleri hacmi 50-60 mg içerir emin olmak veya hedef protein mL Ni-NTA reçine başına daha az (bkz. Adım 1.2.4).</li>
	<li>Tüm ham özleri sütuna devredilmiştir sütun yerçekimi tarafından drenaj olabilir bu yüzden stopcock açın. Bu akış için reçine-SDS-sayfa tarafından arınma daha sonraki analizler için toplamak 100 μL bağlanamadı proteinler oluşur. 26
</li>
	<li>Boş hücre ham özleri viskozite yerçekimi akışı sütun önemli ölçüde yavaşlatabilir. Akış oranını artırmak için basit bir "el-pompa" uygulanır:<ol>
<li>Bir 10 mL radarı-kilit şırınga al ve kap plastik boru ve sütun kap ve şırınga radarı-kilit bağlantı parçaları arasında kısa uzunluğu kullanarak sütun bağlayın. Şırınga pistonu çizin ve sonra sıkı bir şekilde uygun sütun üst sütun kap.</li>
		<li>Yavaşça şırınga pistonu el ile mezun silindir içine eluent toplayarak akış hızı değerlendirilmesi sırasında sıkıştırmak; 1-2 mL / dakika oranları reçine ve bu kurulum ile uyumludur. Akış hızı yavaşlar gibi yavaşça şırınga pistonu sıkıştırma artırın.</li>
		<li>Hava giriş reçine içine engellemek için sütun başlığını çıkarın ve menisküs uygulanan sıvı reçine yatağın üzerinde 5-10 mm ulaştığında el pompası bağlı ve yerçekimi tarafından boşaltmak zorunda kalan cilt izin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre ücretsiz ham özleri boşaltma tamamladıktan ve reçine yüzey tekrar maruz Pasteur damlalıklı dikkatle ~ 30 mL soğuk yıkama arabellek sütuna reçine yüzey bozmamaya dikkat çekici – eklemek için kullanın. Arabellek sütun sıçramasına önlemek için duvarları aşağı çalıştırın.</li>
	<li>Stopcock açmak ve yıkama arabellek sütun ile drenaj izin vermek. Bu işlem zayıf ilişkili proteinler reçine kaldırıyor. Eluent atın.</li>
	<li>Yıkama arabellek boşaltma iken, on altı yaşında hazırlamak etiketli, 1 mL kesirleri toplamak için microcentrifuge tüpler.</li>
	<li>Yıkama arabellek süzülmüş ve reçine yüzey tekrar maruz stopcock kapatın. Pasteur damlalıklı dikkatle ~ 30 mL soğuk elüsyon arabelleği reçine yüzey bozmamaya dikkat çekici sütun için – eklemek için kullanın. Arabellek sütun sıçramasına önlemek için duvarları aşağı çalıştırın.</li>
	<li>Stopcock yavaş yavaş açmak ve elüsyon arabellek sütun öğesini polyhistidine protein elute izin vermek. 1 mL eluent her işaretli microcentrifuge tüpler, 1-16 arası toplamak.</li>
	<li>Renkölçer protein tahlil Bradford tahlil veya belirli yöntemlerine göre UV-görünür spektroskopisi gibi reaktif ve/veya araç üreticileri27,28tarafından kullanarak protein için kesirler test. Burada gösterildiği gibi Coomassie mavi kullanarak Renkölçer tahlil 100 μL birime her fraksiyonu sadece küçük bir birimden kurban için küçültülür.</li>
	<li>Her kesir Mix 3 μL 100 µL kolorimetrik bir protein ile reaktif tahlil ve el ile protein fraksiyonu varlığını göstermek için herhangi bir renk oluşumu gözlemlemek; algılama bir Spektrometre ile gerekli değildir.</li>
	<li>Protein fraksiyonu 16 bulunursa, eluted kesirler artık önemli miktarda protein içeren kadar 1 mL kesirler ve tahlil protein için düzenli olarak eluting devam edin.</li>
	<li>Protein içeren kesirleri temiz konik tüp içine birleştirmek ve daha sonraki analizler için 100 μL örnek SDS-sayfa26tarafından tutar.</li>
	<li>Metal iyon kofaktör sulandırma ile devam etmek ya da protein 3 mL aliquots-80 ° C'de dondurmak O % 10 gliserol dahil olduğundan emin olun elüsyon arabellek saf protein donma sırasında dengelemek için bir cryoprotectant olduğunu.</li>
	<li>Ni-NTA sütunun elüsyon tamamlandığında, tüm protein sütundur ve kesirler toplanan, elüsyon arabelleği sütun aracılığıyla başka bir 25 mL geçmek ve sütun 4 ° c ~ 5 mL elüsyon arabelleği için kısa süreli depolama depolamak , veya daha uzun vadeli depolama için % 20 etanol ile lizis/bağlama arabellek.</li>
</ol>3. hedef Protein ile Fe2 + sulandırma
<ol><li>Fe2 + ek Not: Bu örnekte L-DOPA dioxygenase gibi enzim bağlama heme olmayan demir (II) etkinliği için bir Fe2 + iyon gerektirir; Ancak, demir (II) etkin olan demir (III), kolayca oksitlenir ve protein bir kısmını herhangi bir demir hiç arındırır.<ol>
<li>Metal sulandırma başlamak için 3 mL saf enzim elüsyon arabellekte askıya alın. Dondurulmuş, hızla ılık su banyosu kullanarak çözme ve bir kez çözdürülen, protein buza koy.</li>
		<li>Protein hacmi tüp kullanarak, sodyum askorbat (198.1 g/mol) son konsantrasyonu 12,5 mM örnek yapmak için gerekli miktarı hesaplamak. De, dithiothreitol (DTT, 154.25 g/mol) son konsantrasyonu 12,5 mM örnek olması için gereken miktarını hesaplar.</li>
		<li>Katı sodyum askorbat ve DTT ve tamamen erimesi için yumuşak, ama iyice karıştırın. Protein yağış aşırı saldırgan karıştırma ile neden olmaması için dikkat ediniz. Demir (II) sülfat heptahydrate (MW 278.01 g/mol) az miktarda protein örnek ekleyin.</li>
		<li>Demir tuz, dokunun yeterince küçük bir miktar birkaç 1 elde etmek için mm granül FeSO4•7H2O dışarı sağlam bir parça kağıt tartmak, granül üzerinde kağıt katlama ve metal bir spatula düz tarafıyla ezersin.</li>
		<li>Bir tanesini elde edilen toz protein tüp için ekleyin.</li>
		<li>Girdap karışımı ve pembe pembe renk tüp içinde görünür.</li>
		<li>Pembe çözüm protein, şapkalı, 10-30 dakika buz üzerinde kuluçkaya. Pembe renk yavaş yavaş zaman içinde kaybolacak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jel filtrasyon<ol>
<li>Küresel polyacrylamide jel 10 mL bir molekül ağırlığı dışlama sınırı yaklaşık 6000 ve 90-180 µm de bir 10 mL rezervuar ile donatılmış bir 1.5 x 12 cm sütundaki sulu parçacık boyutu aralığı dolu bir jel filtrasyon sütun kullanın. Sütun alt ile donatılmıştır ve reçine sütun korumak ve reçine yatak kuru çalışmasını engellemek için 30 um gözenekli polietilen disk şeklinde üst yatak desteklediğinden olun. Jel filtrasyon sütun bir yüzük stand mount.</li>
		<li>Önceden paketlenmiş jel filtrasyon sütun kullanılıyorsa, kapağını çıkarın ve aşırı arabellek üst yatak destek yukarıda kapalı dökün.</li>
		<li>Sütun equilibrate için arabellek sonraki tahlil ve Muhafazası, örneğin, 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, % 10 gliserol pH 8.0 uyumlu ile havzanın doldurarak başlayın.</li>
		<li>Önceden paketlenmiş jel filtrasyon sütun kullanılıyorsa, arabellek akışını başlatmak ve radarı kayma uygun maruz jel filtrasyon sütun alt ucu çekin. Bir stopcock sonuna radarı kayma sütun uygun ama açık bırakın ve yerçekimi tarafından damla sütun izin.</li>
		<li>Arabellek sütun süzülmüş ve üst yatak destek maruz stopcock kapatın ve çözüm maruz üst yatak desteği üzerine pipetting Fe (II) yeniden metalloenzyme ~ 3 mL sütuna ekleyin.</li>
		<li>Stopcock açmak ve tüm 3,0 mL örnek sütun yerçekimi tarafından girmek izin vermek. Eluent bu ilk 3 mL atmak. Çözüm taşıma sırasında formları herhangi bir pembe renk sütunun üst kısmına sıkışmış.</li>
		<li>Sütun damlama durdurdu ve üst yatak destek maruz, 4 mL jel-filtrasyon arabelleği (Örneğin, 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, % 10 gliserol pH 8.0) için sütun ekleyin. Stopcock açın ve eluent microcentrifuge tüpler içine sekiz 0.5 mL kesirleri toplamak.</li>
		<li>Renkölçer protein tahlil veya UV-VIS27,28 daha önce açıklandığı gibi kullanarak protein için kesirler test.</li>
		<li>Protein içeren kesirleri birleştirin.</li>
		<li>Bir örnek SDS-sayfa analizi26için geri alıyorum.</li>
		<li>Tahlil veya bir örnek ile devam edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hochuli, E., Bannwarth, W., D&#246;beli, H., Gentz, R., St&#252;ber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Approach+to+Facilitate+Purification+of+Recombinant+Proteins+with+a+Novel+Metal+Chelate+Adsorbent.">Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent.</a> Nature Biotechnology. 6 (11), 1321 (1988).</li><li>Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelating+peptide-immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.+A+new+concept+in+affinity+chromatography+for+recombinant+proteins.">Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).</li><li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27+Immobilized-Metal+Affinity+Chromatography+(IMAC):+A+Review.">Chapter 27 Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review.</a> Methods in Enzymology. , 439-473 (2009).</li><li>Derewenda, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+recombinant+methods+and+molecular+engineering+in+protein+crystallization.">The use of recombinant methods and molecular engineering in protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 354-363 (2004).</li><li>Gr&#228;slund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Switzer, R. L., Garrity, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental Biochemistry. , (1999).</li><li>Boyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modern Experimental Biochemistry, 3rd Edition. , (2001).</li><li>le Maire, M., Chabaud, R., Herv&#233;, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Guide to Biochemistry, Enzymology, and Protein Physical Chemistry: A Study of Aspartate Transcarbamylase. , (2012).</li><li>Bettelheim, F. A., Landesburg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Experiments for General, Organic, and Biochemistry. , (2013).</li><li>Anderson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+chromatography+of+lactate+dehydrogenase:+An+experiment+for+the+undergraduate+biochemistry+laboratory.">Affinity chromatography of lactate dehydrogenase: An experiment for the undergraduate biochemistry laboratory.</a> Journal of Chemical Education. 65 (10), 901 (1988).</li><li>Boyer, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+milk+whey+&#945;-lactalbumin+by+immobilized+metal-ion+affinity+chromatography.">Purification of milk whey &#945;-lactalbumin by immobilized metal-ion affinity chromatography.</a> Journal of Chemical Education. 68 (5), 430 (1991).</li><li>Moffet, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+mutation+to+protein+characterization.">From gene mutation to protein characterization.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37 (2), 110-115 (2009).</li><li>Sommer, C. A., Silva, F. H., Novo, M. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teaching+molecular+biology+to+undergraduate+biology+students:+An+illustration+of+protein+expression+and+purification*.">Teaching molecular biology to undergraduate biology students: An illustration of protein expression and purification*.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (1), 7-10 (2004).</li><li>Wu, Y., Zhou, Y., Song, J., Hu, X., Ding, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+green+and+red+fluorescent+proteins+to+teach+protein+expression,+purification,+and+crystallization.">Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (1), 43-54 (2008).</li><li>Ward, W. W., Swiatek, G. C., Gonzalez, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+in+biotechnology+education.">Green fluorescent protein in biotechnology education.</a> Methods in enzymology. 305, 672-680 (2000).</li><li>Kay, B. K., Winter, J., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual. , (1996).</li><li>Arkus, K. A. J., Jez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+protein+chemistry+laboratory.">An integrated protein chemistry laboratory.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (2), 125-128 (2008).</li><li>Crowley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification,+and+characterization+of+a+recombinant+flavin+reductase+from+the+luminescent+marine+bacterium+Photobacterium+leiognathi.">Expression, purification, and characterization of a recombinant flavin reductase from the luminescent marine bacterium Photobacterium leiognathi.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (3), 151-160 (2010).</li><li>Colabroy, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+writing-intensive,+methods-based+laboratory+course+for+undergraduates.">A writing-intensive, methods-based laboratory course for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education: A Bimonthly Publication of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 39 (3), 196-203 (2011).</li><li>Kreiling, J. L., Brader, K., Kolar, C., Borgstahl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+real-time+and+hands-on+research+course+in+protein+purification+and+characterization:+Purification+and+crystal+growth+of+human+inosine+triphosphate+pyrophosphatase.">A real-time and hands-on research course in protein purification and characterization: Purification and crystal growth of human inosine triphosphate pyrophosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 39 (1), 28-37 (2011).</li><li>Gray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Known+structure,+unknown+function:+An+inquiry-based+undergraduate+biochemistry+laboratory+course.">Known structure, unknown function: An inquiry-based undergraduate biochemistry laboratory course.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 43 (4), 245-262 (2015).</li><li>Kocabas, E., Hernick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloenzymes:+Use+of+Recombinant+Protein+Expression+and+Affinity+Tags+to+Aid+Identification+of+Native+Metal+Ion+Cofactors.">Metalloenzymes: Use of Recombinant Protein Expression and Affinity Tags to Aid Identification of Native Metal Ion Cofactors.</a> Biochemistry &amp; Analytical Biochemistry. 2 (2), 1-3 (2013).</li><li>Ellis, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloenzymes.">Metalloenzymes.</a> Reviews in Cell Biology and Molecular Medicine. , (2006).</li><li>Williams, R. J. P., Begley, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallo-Enzymes+and+Metallo-Proteins,+Chemistry+of.">Metallo-Enzymes and Metallo-Proteins, Chemistry of.</a> Wiley Encyclopedia of Chemical Biology. , (2007).</li><li>Mierendorf, R. C., Morris, B. B., Hammer, B., Novy, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Purification+of+Recombinant+Proteins+Using+the+pET+System.">Expression and Purification of Recombinant Proteins Using the pET System.</a> Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , 257-292 (1998).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laemmli-SDS-PAGE.">Laemmli-SDS-PAGE.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradford+Protein+Assay.">Bradford Protein Assay.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (6), (2011).</li><li>Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Quantitation.">Protein Quantitation.</a> Materials and Methods. , (2017).</li><li>Colabroy, K. L., Hackett, W. T., Markham, A. J., Rosenberg, J., Cohen, D. E., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+L-DOPA+2,3-dioxygenase,+a+single-domain+type+I+extradiol+dioxygenase+from+lincomycin+biosynthesis.">Biochemical characterization of L-DOPA 2,3-dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from lincomycin biosynthesis.</a> Arch Biochem Biophys. 479 (2), 131-138 (2008).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer.">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods in Enzymology. , 601-626 (2009).</li><li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets.">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li><li>Wang, Y. Z., Lipscomb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+overexpression,+and+mutagenesis+of+the+gene+for+homoprotocatechuate+2,3-dioxygenase+from+Brevibacterium+fuscum.">Cloning, overexpression, and mutagenesis of the gene for homoprotocatechuate 2,3-dioxygenase from Brevibacterium fuscum.</a> Protein Expr Purif. 10 (1), 1-9 (1997).</li><li>Amaya, A. A., Brzezinski, K. T., Farrington, N., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+human+homogentisate+1,2-dioxygenase.">Kinetic analysis of human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 421 (1), 135-142 (2004).</li><li>Johnson-Winters, K., Purpero, V. M., Kavana, M., Nelson, T., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Hydroxyphenyl)pyruvate+Dioxygenase+from+Streptomyces+avermitilis:+The+Basis+for+Ordered+Substrate+Addition.">4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase from Streptomyces avermitilis: The Basis for Ordered Substrate Addition.</a> Biochemistry. 42 (7), 2072-2080 (2003).</li><li>Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction,+purification+and+properties+of+2,3-dihydroxyphenylpropionate+1,2-dioxygenase+from+Escherichiacoli.+Biochimica+et+Biophysica+Acta+(BBA).">Overproduction, purification and properties of 2,3-dihydroxyphenylpropionate 1,2-dioxygenase from Escherichiacoli. Biochimica et Biophysica Acta (BBA).</a> Protein Structure and Molecular Enzymology. 1202 (2), 258-264 (1993).</li><li>Mendel, S., Arndt, A., Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-Base+Catalysis+in+the+Extradiol+Catechol+Dioxygenase+Reaction+Mechanism+Site-Directed+Mutagenesis+of+His-115+and+His-179+in+Escherichia+coli+2,3-Dihydroxyphenylpropionate+1,2-Dioxygenase+(MhpB).">Acid-Base Catalysis in the Extradiol Catechol Dioxygenase Reaction Mechanism Site-Directed Mutagenesis of His-115 and His-179 in Escherichia coli 2,3-Dihydroxyphenylpropionate 1,2-Dioxygenase (MhpB).</a> Biochemistry. 43 (42), 13390-13396 (2004).</li><li>Viggiani, A., Siani, L., Notomista, E., Birolo, L., Pucci, P., Di Donato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Conserved+Residues+His-246,+His-199,+and+Tyr-255+in+the+Catalysis+of+Catechol+2,3-Dioxygenase+from+Pseudomonas+stutzeri+OX1.">The Role of the Conserved Residues His-246, His-199, and Tyr-255 in the Catalysis of Catechol 2,3-Dioxygenase from Pseudomonas stutzeri OX1.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48630-48639 (2004).</li><li>Uragami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+substrate+free+and+complex+forms+of+reactivated+BphC,+an+extradiol+type+ring-cleavage+dioxygenase.">Crystal structures of substrate free and complex forms of reactivated BphC, an extradiol type ring-cleavage dioxygenase.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 83 (4), 269-279 (2001).</li><li>Veldhuizen, E. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+kinetics+and+inhibition+of+anaerobically+purified+human+homogentisate+1,2-dioxygenase.">Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Biochemical Journal. 386 (Pt 2), 305-314 (2005).</li></ol>

Yazarlar hiçbir açıklamalar var.

Polyhistidine Etiketler rekombinant proteinler ve onların arıtma IMAC tarafından eklenmesi biyokimyasal edebiyat3,4,5, IMAC uygulamaları enzim arıtma için hemen hemen her yerde olmuştur iken Biyokimya Laboratuvarı öğretim kalır seyrek ve yayımlanmış yöntemleri her zaman öğretim kaynak sınırlamaları düşünmüyoruz laboratuvar20. Ayrıca, IMAC öğretim laboratuvar etkinliği ve saflık, IMAC arıtma bir enzim ideal öğretim etkinlik yapma değerlendirmek deneyler birleştiğinde en etkili kullanmaktır. Enzimler, metaloenzimlerde, öğretim laboratuvar dahil arıtma IMAC uygulamaya uzatmak için güvenilir ve ucuz Yöntemler gereklidir. Bu protokol için biz benchtop IMAC göstermek hazır ve ucuz Laboratuvar malzemeleri, ayrıca sınırlamalar IMAC uygulama metalloproteins22, iron(II) bağımlı başlamaktan tarafından hitap ederken kullanarak metalloenzyme, L-DOPA dioxygenase, arıtma sonrası. Reaktifler ve açıklanan malzemeleri kullanarak, sekiz öğrenci grupları için sarf malzemeleri arasında $500-600 resim 1 resim 2aldatmacalarını analysis adımlar da dahil olmak üzere bu iletişim kuralını çalıştırmak için dönem başına maliyetidir tahmin ediyoruz.
Hangi ile Fe2 + amino asit ligandlar24 ve facile oksidasyonunu Fe2 + O2 tarafından Fe3 +için sigara-heme, sulandırma ayırmak kolaylığı nedeniyle rekombinant metalloenzyme içine amino asit Şelatatlı iron(II) olduğunu enzim arıtma tipik bir bileşenidir. Klasik Kromatografi kullanıldığında, bazı durumlarda32demir toplam kayıplarını önlemek mümkündür, ancak demir (II) geri azaltılması ajanlar33,34,35huzurunda, daha sık eklenir 36 kez altında bir anaerobik atomosphere37,38,39ve bazı durumlarda demir fazlalığı değil kaldırıldı33,34,36, komplike Sonraki herhangi bir tahlil. Klasik Kromatografi ve anaerobik bir atmosfer ardışık adımlar bu protokolü gelişimi isteyen Lisans Laboratuvarı için gerçekçi değildir.
Ni-NTA sütun el ile hazırlanması ve örnekleri yerçekimi tarafından büyük ölçüde işleme ek zaman ve önceden paketlenmiş sütunları karşılaştırılır ve Kromatografi araçları otomatik zaman çaba sürer iken, el ile gerçekleştirilecek adımlar için yakışıklı-üstünde izin artan işlem arkasında bilim anlayışı sonucunda öğrenci tarafından öğrenme. Burada özetlenen koşullar altında bir demir (II) tuzu aşırı dithiothreitol için özellikle hassas bir ektir. Bir öğrenci, yanlışlıkla dithiothreitol aşırı ekler, yağış olay olasıdır. Bu laboratuvarda, tezgah laboratuvar zaman en etkin şekilde kullanılacak şekilde gelmeden önce reaktif miktarlar hesaplamalar öğrenciler gerektirecek şekilde yararlı bulduk. Tüm benchtop IMAC arıtma - cep-lysis protein elüsyon için-gelen bir 4 saatlik laboratuvar periyotta ardından sulandırma ve tahlil bir sonraki laboratuvar döneminde yapılır.

Özler tarafından immobilize bir metal şelasyon histidin etiketi kullanarak bir ana bilgisayar organizmanın bir öğesini polyhistidine protein saflaştırma ilk raporlarını edebiyat 19881,2' girdi. O zamandan beri polyhistidine Etiketler rekombinant proteinler ve onların arıtma immobilize metal benzeşme Kromatografi (IMAC) tarafından ek haline gelmiştir biyokimyasal edebiyat3,4'hemen hemen her yerde karşımıza çıkan, 5. IMAC arıtma yöntemleri otomatik Kromatografi kullanarak benchtop ve spin-sütun biçimlerde uygulanabilir. Benzeşme arıtma yöntemleri, özellikle IMAC, yaygın olarak kullanılan araştırma laboratuvarı, onlar lisans öğretim laboratuvar olarak daha az yaygın vardır. Biyokimya Laboratuvarı için en çok kullanılan laboratuvar ders kitapları düzenli olarak bu yöntemler yerine daha geleneksel iyon değiştirme veya boya-bağlama Kromatografi6,7,8 için gözle öğretmek değil , 9. Örneğin, laktat dehidrogenaz Anderson10 arıtma benzeşme boya-bağlama tarafından ve sığır süt α-laktalbumin7,11 Boyer tarafından arıtma nikel nitriloacetic kullanır asit matris, ama bunun yerine reçine için protein içsel ilgi güvenerek rekombinant poli-histidin etiketi yok, yani. Bazı modern lisans laboratuvar ders kitapları ve yayınlar immobilize metal benzeşme Kromatografi poli-histidin öğesini protein hedefleri yeşil ya da kırmızı-floresan proteinler12,13gibi uygulamak, 14,15, antikorlar16ve seçili enzimler17,18,19,20, hatta bazı bilinmeyen işlev21. Tartışılır, çünkü hedef etkinlik için sonraki oturumlarda deneyim "gerçek bilim" öğrenci adına zenginleştirici denetlesinler bir enzim saflaştırılması öğretim laboratuvar tercih edilir; Gerçekten de, bu tür laboratuvar deneyimleri yayınlandı ve17,18,20,21öğrenci öğrenme üzerinde yararlı sonuçlar bildirdi. Ve henüz, iMac enzim arıtma Biyokimya öğretim laboratuvar seyrek kalır ve yayımlanmış yöntemleri bile erişim genellikle kullanılamaz Kromatografi araçları için tahmin için sınıf laboratuvar uygulamaları 20. Ayrıca IMAC uygulama metalloproteins, özellikle de hangi etkinliği22' ye gerekli olan redoks duyarlı divalent metal bağlamak için sınırlamalar vardır. Sık sık, metal iyon kaybı veya etkin olmayan bir enzim hasta uygun-lisans laboratuvarı verimli arıtma sırasında okside.
Tam üçte enzimlerin bağlamak bir metal iyon23ve demir hayat23tüm formları için neredeyse evrensel bir gereklilik rağmen demir tartışmalı Enzimologiya en sorunlu metal iyonları arasında yer alıyor. Sigara-heme Fe2 + bağlama enzimler IMAC sırasında özellikle eğilimli kaybı ve/veya metal oksidasyon; Muhtemelen heme ve hangi Fe ile ayırmak2 + düşük aminoasit ligandlar24kolaylığı gibi adanmış bir organik ligand eksikliği nedeniyle. Ayrıca, Fe2 + Fe3 + oksijen bağımlı oksidasyon nedeniyle olumsuz serbest enerji değişimi ve Fe3 +göreli istikrar sulu çözelti içinde spontan olduğunu. Çoğu zaman, bu zorlukları anaerobik atmosfer ve/veya sigara IMAC kromatografik yöntemler22kullanımı ile üstesinden vardır. Bu makalede, biz benchtop aktif Fe2 +, sulandırma tarafından takip basit, ucuz Kromatografi malzemeleri kullanarak Fe2 + bağımlı metalloenzyme L-DOPA dioxygenase arındırmak için IMAC kullanımı gösterecektir ve enzimatik tahlil. Bu yöntemler 6-12 öğrenci grupları kendi lisans Biyokimya laboratuarında standart ve enzim araştırmalar lisans düzeyinde repertuarı genişletmek için kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1992px;" width="1991">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">consumables</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeadBeater 0.1mm glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101</td>
			<td>1 pound each</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Conical Tubes with Screw Caps, sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:596px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Potassium phosphate, monobasic</td>
			<td style="width:145px;">Acros (Fisher)</td>
			<td>AC42420-5000</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td style="width:145px;">Acros (Fisher)</td>
			<td>AC35268-1000&#160;</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">DTT (Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:145px;">Lab Scientific</td>
			<td>D-115</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Iron(II) sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:145px;">Sigmaaldrich</td>
			<td>310077</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HisPur NiNTA Resin&#160;</td>
			<td>Fisher (pierce)</td>
			<td>PI88221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-Column Chromatography Columns - 1.5 x 20cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>737-1522&#160;</td>
			<td>1.5 x 20 cm, 35 ml, 2ea,&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stopcock Valve, one way, female to male luer</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>420163-0000</td>
			<td>pack of 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD 10mL luer-loc syringe (non-sterile, without needle)</td>
			<td>VWR</td>
			<td align="right">301029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Female Luer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td align="right">7318222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Male Luer&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7318225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon Tubing (1.6 mm ID/0.8 mm wall, for 0.2-5 ml/min on Peristaltic Pump)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318211</td>
			<td>Pkg of 1, 1.6 mm ID/0.8 mm wall, 10 m, low-pressure tubing for liquid handling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Glycerol</td>
			<td style="width:145px;">Fisher (Pierce)</td>
			<td>17904</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay</td>
			<td>Thermo Scientitic</td>
			<td>23236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tubes, snap cap, 1.5mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand polystyrene disposable serological pipets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiserbrand universal pipet pump</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>14-955-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Econo-Pac 10DG desalting columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td>box of 30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExpressPlus PAGE 5x sample buffer</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>MB01015</td>
			<td>5mL (Dilute 1:5 with sample)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 wells</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M42012</td>
			<td>20 gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Disposable Cuvettes, Methyacrylate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-128&#160;</td>
			<td>case of 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Cuvette Caps Square Disposable</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td>14-385-999</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine)</td>
			<td style="width:145px;">Acros</td>
			<td>D9628-5G</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Permanent Equipment:&#160;</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BeadBeater 50mL chamber&#160;</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>110803-50SS</td>
			<td>1 chamber</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:596px;">BeadBeater</td>
			<td style="width:145px;">BioSpec Products</td>
			<td>1107900-101</td>
			<td style="width:1113px;">350 ml polycarbonate chamber, rotor assembly, motor base, ice-water cooling jacket and one pound of glass beads.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge tubes, High-Speed PPCO, 50mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>3119-0050PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:596px;">Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td style="width:1113px;">&#160;4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td style="width:1113px;">100&#8211;120/220&#8211;240 V, power supply for high-current applications, includes power cord</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">UV-1800 with UV-Probe Software</td>
			<td style="width:145px;">Shimadzu</td>
			<td>UV-1800</td>
			<td style="width:1113px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:596px;">Kintek Global Kinetic Explorer</td>
			<td style="width:145px;">Kintek Corp</td>
			<td>version 6</td>
			<td style="width:1113px;">https://www.kintekexplorer.com/downloads/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

benchtop immobilized metal affinity chromatography, reconstitution and assay of a polyhistidine tagged metalloenzyme for the undergraduate laboratory

İmmobilize Benchtop metal benzeşme Kromatografi (IMAC), öğesini polyhistidine proteinlerin ve lisans öğrencileri tarafından kolayca hakim en çok kullanılan protein saflaştırma yöntemi modern edebiyat haline gelmiştir. Ama benzeşme Kromatografi uygulamaya metal bağlayıcı proteinler, özellikle bu gibi demir, redoks hassas metaller ile sık sık laboratuvarları bir torpido - lisans içinde düzenli olarak kullanılamaz ekipman erişim sınırlıdır Laboratuvar. Bu makalede, biz bizim benchtop yöntemleri için yalıtım, IMAC bir poli-histidin etiketlendi arıtma ve metal iyon sulandırma, redoks aktif, heme olmayan demir bağlama extradiol dioxygenase ve dioxygenase ile çeşitli substrat tahlil göstermektedir konsantrasyonları ve oksijen doyurarak. Bu yöntemler lisans öğrencileri tarafından yürütülen ve erişilebilir ve öncelikle lisans kurumlarında uygun araçları ile lisans öğretim ve araştırma laboratuvarında uygulanan.

Bu protokol iki ders laboratuvar dönemlerinde BCM 341 idam gibi temsilcisi bu sonuçlar lisans öğrencileri tarafından toplanmıştır: deneysel Biyokimya Muhlenberg Koleji'nde. Bir 20 kDa poli-histidin arıtma sonuçlarını metalloenzyme, L-DOPA dioxygenase, bir 4 saatlik sınıf laboratuvar dönemde iki lisans öğrencileri tarafından gerçekleştirilen olarak etiketlenen ve SDS-PAGE tarafından aynı tarafından analiz Şekil 1 gösterir Öğrenciler bir sonraki laboratuvar dönemde. Etkili bir şekilde poli-histidin öğesini proteindir saflaştırılmış (Şekil 1, lane 2). Poli-histidin öğesini hedef protein az miktarda akışı aracılığıyla içinde (veri) gösterilmez, kayıp bir immunoblot poli-histidin etiketi karşı antikor kullanarak jel gösterir büyük olasılıkla çünkü hedef protein miktarı 100 mg büyüktür bağlama kapasitesi reçine lysate aştı.
Şekil 2 etkinlik öğrenci toplanan veri poli-histidin etiketli metalloenzyme hedef L-DOPA dioxygenase, enzimatik reaksiyon sonra demir (II) ve sonraki jel-filtrasyon protokolü tarafından tanımlandığı gibi sulandırma üzerinde gösterir burada. Beş ölü-zaman veri toplanan başlar bu tekniği ilk kez yürütme öğrencilerin tipik ikincisidir. Metalloenzyme sağlam etkinliği yayımlanmış bir tahlil kullanarak ve kararlı durum kinetik parametrelerin yayımlanan sonuçları29ile tutarlı sunmuştu algılandı. Kararlı durum kinetik parametrelerin Şekil 2' de gösterilen ilerleme eğrileri30 yaklaştırarak belirlenmiştir; Ancak, doğrusal olmayan en küçük kareler uygun substrat konsantrasyonu bir dizi toplanan ilk oranları eşit olası31' dir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig1.jpg"> Şekil 1. SDS-sayfa26 Analizi poli-histidin protein öncesinde, sırasında ve sonra arıtma etiketledi. Yolları 1 - moleküler ağırlık işaretleri, 2 saf protein (20 kDa) post Ni-NTA, ile 4 - hücre ücretsiz ham özleri önce arıtma, 5 - hücre artıkları Pelet yazı lizis 3-Ni-NTA akışı. Örnekleri 5 x örnek/yükleme arabellek kullanılarak hazırlanan ve önceden döküm 4-%20 polyacrylamide bir jel elektroforez sistemi kullanarak jeller üzerinde ayrılmış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig2.jpg"> Şekil 2. Kararlı duruma tahlil demir (II) metalloenzyme (Yani, L-DOPA dioxygenase, 10µM) substrat (L-DOPA-5 µM (kırmızı), 25 µM (yeşil), 50 µM (mavi)) arabelleği (50 mM fosfat, 200 mM NaCl, pH 8) ile birlikte yeniden düzenlendi. İzleri tasvir ürün oluşumu, 414nm. Absorbans veri sürekli 1 mL metakrilat cuvettes bir split-ışın tarama UV-görünür Spektrometre29kullanarak elde. Ham veri, Michaelis-Menten kararlı durum yaklaşım (KM 30,8 µM ± 14,4, kkedibelirgin 2.3 s-1 ± 0,05)30bir modeli uygun olan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory at JoVE.

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Burada bir iletişim kuralı için immobilize benchtop metal benzeşme Kromatografi arıtma ve etiketli bir polyhistidine sonraki sulandırma, heme olmayan demir bağlama dioxygenase lisans öğretim laboratuvar için uygun mevcut.

Benchtop Metal benzeşme kromatografi, sulandırma immobilize ve bir Polyhistidine tahlil Metalloenzyme Lisans Laboratuvarı etiketli.

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

benchtop-immobilized-metal-affinity-chromatography-reconstitution

Research

JoVE Journal

Biochemistry

17.1K Görüntüleme.  Muhlenberg College. Burada bir iletişim kuralı için immobilize benchtop metal benzeşme Kromatografi arıtma ve etiketli bir polyhistidine sonraki sulandırma, heme olmayan demir bağlama dioxygenase lisans öğretim laboratuvar için uygun mevcut.

Video: Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Biyokimya

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. Peptide affinity reagents can be used for similar applications to antibodies, including sensing and therapeutics, but are more robust and able to perform in more extreme environments. Specific enrichment of peptide capture agents to a protein target of interest is enhanced using semi-automated sorting methods which improve binding and wash steps and therefore decrease the occurrence of false positive binders. A semi-automated sorting method is described herein for use with a commercial automated magnetic-activated cell sorting device with an unconstrained bacterial display sorting library expressing random 15-mer peptides. With slight modifications, these methods are extendable to other automated devices, other sorting libraries, and other organisms. A primary goal of this work is to provide a comprehensive methodology and expound the thought process applied in analyzing and minimizing the resulting pool of candidates. These techniques include analysis of on-cell binding using fluorescence-activated cell sorting (FACS), to assess affinity and specificity during sorting and in comparing individual candidates, and the analysis of peptide sequences to identify trends and consensus sequences for understanding and potentially improving the affinity to and specificity for the target of interest.

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for discovery of peptide affinity reagents, a robust alternative to antibodies. The semi-automated sorting method herein has streamlined biopanning to decrease the occurrence of false positives. Here we illustrate the thought process and techniques applied in evaluating candidates and minimizing downstream analysis.

Peptid benzeşme reaktif keşif ve elde edilen yalıtır analizi için bakteriyel ekran kütüphanelerin yarı otomatik Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and RNAs, are unique to the cells from which they are derived and can be used as indicators of disease. Several common enrichment protocols, including ultracentrifugation, yield exosomes laden with soluble protein contaminants. Specifically, we have found that the most abundant proteins within blood often co-purify with exosomes and can confound downstream proteomic studies, thwarting the identification of low abundance biomarker candidates. Of additional concern is irreproducibility of exosome protein quantification due to inconsistent representation of non-exosomal protein levels. The protocol detailed here was developed to remove non-exosomal proteins that co-purify along with exosomes, adding rigor to the exosome purification process. Five methods were compared using paired blood plasma and serum from five donors. Analysis using nanoparticle tracking analysis and micro bicinchoninic acid protein assay revealed that a combined protocol utilizing ultrafiltration and size exclusion chromatography yielded the optimal vesicle enrichment and soluble protein removal. Western blotting was used to verify that the expected abundant blood proteins, including albumin and apolipoproteins, were depleted.

Here, we present a protocol to purify exosomes from both plasma and serum with reduced co-purification of non-exosomal blood proteins. The optimized protocol includes ultrafiltration, protease treatment, and size exclusion chromatography. Enhanced purification of exosomes benefits downstream analyses, including more accurate quantification of vesicles and proteomic characterization.

Protein sindirimi, Ultrafiltrasyon ve boyutu dışlama Kromatografi insan kan plazması ve Serum Exosomes yalıtım en iyi duruma getirmek için

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve classes of intrinsically disordered proteins (IDPs) to reduce oxidative and osmotic stress. This article uses a combination of capillary gel electrophoresis (CGE) and mobility shift affinity electrophoresis (ACE) in order to describe the binding behavior of different conformers of the IDP AtHIRD11 from Arabidopsis thaliana. CGE is used to confirm the purity of AtHIRD11 and to exclude fragments, posttranslational modifications, and other impurities as reasons for complex peak patterns. In this part of the experiment, the different sample components are separated by a viscous gel inside a capillary by their different masses and detected with a diode array detector. Afterward, the binding behavior of the sample towards various metal ions is investigated by ACE. In this case, the ligand is added to the buffer solution and the shift in migration time is measured in order to determine whether a binding event has occurred or not. One of the advantages of using the combination of CGE and ACE to determine the binding behavior of an IDP is the possibility to automate the gel electrophoresis and the binding assay. Furthermore, CGE shows a lower limit of detection than the classical gel electrophoresis and ACE is able to determine the manner of binding a ligand in a fast manner. In addition, ACE can also be applied to other charged species than metal ions. However, the use of this method for binding experiments is limited in its ability to determine the number of binding sites. Nevertheless, the combination of CGE and ACE can be adapted for characterizing the binding behavior of any protein sample towards numerous charged ligands.

This protocol combines the characterization of a protein sample by capillary gel electrophoresis and a fast-binding screening for charged ligands by affinity capillary electrophoresis. It is recommended for proteins with a flexible structure, such as intrinsically disordered proteins, to determine any differences in binding for different conformers.

AtHIRD11 içsel bozukluğu ve bağlama kapiller Jel Elektroforez ve benzeşme kapiler Elektroforez Metal iyonları doğru Analizi

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of fungal secondary metabolites. Inhibitor screening, however, requires purified enzyme activities. Since class 1 deacetylases exert their function as multiprotein complexes, they are usually not active when expressed as single polypeptides in bacteria. Therefore, endogenous complexes need to be isolated, which, when conventional techniques like ion exchange and size exclusion chromatography are applied, is laborious and time consuming. Tandem affinity purification has been developed as a tool to enrich multiprotein complexes from cells and thus turned out to be ideal for the isolation of endogenous enzymes. Here we provide a detailed protocol for the single-step enrichment of active RpdA complexes via the first purification step of C-terminally TAP-tagged RpdA from Aspergillus nidulans. The purified complexes may then be used for the subsequent inhibitor screening applying a deacetylase assay. The protein enrichment together with the enzymatic activity assay can be completed within two days.

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets to treat fungal infections. Here we present a protocol for the specific enrichment of TAP-tagged RpdA combined with an HDAC activity assay that allows in vitro efficacy testing of histone deacetylase inhibitors.

Enzimatik aktivite assay için Filasentous mantar Aspergillus nidulans bir tap-Tagged histon Deacetylase tek adımlı zenginleştirme

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known small molecule-protein interactions and to find potential protein targets for natural products. Compared with other methods, DARTS uses native, unmodified, small molecules and is simple and easy to operate. In this study, we further enhanced the data analysis capabilities of the DARTS experiment by monitoring the changes in protein stability and estimating the affinity of protein-ligand interactions. The protein-ligand interactions can be plotted into two curves: a proteolytic curve and a dose-dependence curve. We have used the mTOR-rapamycin interaction as an exemplary case for establishment of our protocol. From the proteolytic curve we saw that the proteolysis of mTOR by pronase was inhibited by the presence of rapamycin. The dose-dependency curve allowed us to estimate the binding affinity of rapamycin and mTOR. This method is likely to be a powerful and simple method for accurately identifying novel target proteins and for the optimization of drug target engagement.

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

In this study, we enhanced the data analysis capabilities of the DARTS experiment by monitoring the changes in protein stability and estimating the affinity of protein-ligand interactions. The interactions can be plotted into two curves: a proteolytic curve and a dose-dependence curve. We have used mTOR-rapamycin interaction as an exemplary case.

Rapamisin/mTOR etkileşimini incelemek için Yarı Kantitatif İlaç Affinity Responsive Target Stability (DARTS)

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

Rekombinant Drosophila , lipid karıştırıcılar Için lipozomlar halinde deterjan destekli yeniden yapılanma

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall process costs. Alternative, cost-effective capture steps are therefore valuable for industrial-scale manufacturing, where large quantities of a single mAb are produced. Here we present a method for the immobilization of a DsRed-based epitope ligand to a cross-linked agarose resin allowing the selective capture of the HIV-neutralizing antibody 2F5 from crude plant extracts without using Protein A. The linear epitope ELDKWA was first genetically fused to the fluorescent protein DsRed and the fusion protein was expressed in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants before purification by immobilized metal-ion affinity chromatography. Furthermore, a method based on activated cross-linked agarose was optimized for high ligand density, efficient coupling and low costs. The pH and buffer composition and the soluble ligand concentration were the most important parameters during the coupling procedure, which was improved using a design-of-experiments approach. The resulting affinity resin was tested for its ability to selectively bind the target mAb in a crude plant extract and the elution buffer was optimized for high mAb recovery, product activity and affinity resin stability. The method can easily be adapted to other antibodies with linear epitopes. The new resins allow gentler elution conditions than Protein A and could also reduce the costs of an initial capture step for mAb production.

In this procedure, a DsRed-based epitope ligand is immobilized to produce a highly selective affinity resin for the capture of monoclonal antibodies from crude plant extracts or cell culture supernatants, as an alternative to Protein A.

Affinity Kromatografi Reçiyatlarının Hızlı Gelişimi İçin Aktif Çapraz Bağlantılı Agarose - Örnek Olay Olarak Antikor Yakalama

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...